叢臺(tái)酒大曲中高產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的分離和鑒定

王鑫昕，耿霄，吳子龍，王磊

（邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北邯鄲056000）

叢臺(tái)酒大曲中高產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的分離和鑒定

王鑫昕，耿霄，吳子龍，王磊

（邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北邯鄲056000）

為從叢臺(tái)酒中溫大曲中分離高產(chǎn)淀粉酶的菌株，通過(guò)透明圈法和淀粉酶活力測(cè)定分別進(jìn)行了初篩和復(fù)篩，并通過(guò)生理生化性能鑒定確定高產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的分類(lèi)。經(jīng)篩選得到的高產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌C3，其淀粉酶活力為63.1U，比原廠(chǎng)濃香型大曲提高了44.4%。經(jīng)鑒定，C3為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，其菌落為黃褐色，表面無(wú)光澤、不透明且邊緣整齊，有不規(guī)則突起。對(duì)叢臺(tái)酒高產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的分離，將為酒廠(chǎng)提高大曲質(zhì)量和出酒率提供菌種和依據(jù)。

大曲；淀粉酶；細(xì)菌；分離；鑒定

在釀造過(guò)程中加入酒曲是我國(guó)白酒釀造的顯著特點(diǎn)[1]。大曲是釀酒微生物和酶的載體，其內(nèi)部微生物種類(lèi)十分復(fù)雜，主要包括三大類(lèi)即霉菌、細(xì)菌和酵母菌[2]，這些菌起到利用原料產(chǎn)香、產(chǎn)酸、產(chǎn)酒的作用，影響著白酒的產(chǎn)量，賦予了白酒不同的風(fēng)味和口感，因而有“曲是酒之骨”之說(shuō)。白酒大曲中的微生物，傳統(tǒng)的方法是從自然界自然接種而來(lái)，在近代微生物學(xué)發(fā)展后，可由人工選育接種。大曲微生物的人工加入能夠增加酒的產(chǎn)量或豐富酒的風(fēng)味，因此人工選育微生物可以讓白酒生產(chǎn)按照工藝設(shè)定目標(biāo)進(jìn)行。近年來(lái)，有關(guān)白酒大曲微生物的研究日益增多，主要集中在對(duì)酒曲微生物的種類(lèi)、數(shù)量及其與酒曲理化性質(zhì)關(guān)系的研究[3-4]，以及對(duì)酒曲中優(yōu)良菌株的選育等方面[5-7]。有關(guān)叢臺(tái)酒中細(xì)菌的研究在本文之前未見(jiàn)報(bào)道。本研究以叢臺(tái)酒中溫大曲作為研究對(duì)象，首次對(duì)成熟曲中高產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌進(jìn)行分離并初步鑒定，以備為后續(xù)大曲液化力、糖化力的提高及發(fā)酵力等其他指標(biāo)的平衡關(guān)系的研究提供菌種，為大曲的發(fā)酵培養(yǎng)工藝控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

河北省邯鄲市叢臺(tái)酒業(yè)提供的成熟中溫大曲。

1.2 培養(yǎng)基

淀粉培養(yǎng)基：10 g蛋白胨，5 g NaCl，5 g牛肉膏，2 g可溶性淀粉，20 g瓊脂，加水至1 L，121℃滅菌20m in。

種子培養(yǎng)基：10 g蛋白胨，5 g NaCl，3 g牛肉膏，2 g可溶性淀粉，加水定容至1 L，121℃滅菌20m in。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：80 g玉米粉，5 g蛋白胨，40 g豆餅粉，5 g K2HPO4，3 g(NH4)2SO4，5 g Na2HPO4，加水定容至1 L，121℃滅菌20m in。

檸檬酸鈉培養(yǎng)基：2 g檸檬酸鈉，5 g NaCl，0.1 g Mg-SO4·7H2O，1 g(NH4)2HPO4，1 g K2HPO4·3H2O，溴百里酚藍(lán)水溶液100m L，20 g瓊脂，121℃滅菌20m in。

肉湯培養(yǎng)基：1 g蛋白胨，0.5 g NaCl，0.3 g牛肉膏，2 g瓊脂，加水定容至100m L，121℃滅菌30m in。

1.3 產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的初篩和復(fù)篩

無(wú)菌環(huán)境中，稱(chēng)取曲皮（距大曲表面1 cm處）、曲心（距曲塊中心1 cm處）各5 g，研磨后加入10m L無(wú)菌水中振蕩1m in，經(jīng)過(guò)濾后取濾液1m L加入到9m L無(wú)菌水中，振蕩混勻，得到10-1菌懸液。經(jīng)逐級(jí)稀釋后，依次得到10-2、10-3……10-6的梯度稀釋液。

取10-5、10-6稀釋菌懸液各100μL涂布在淀粉培養(yǎng)基上，并置于30℃倒置培養(yǎng)2 d。之后，對(duì)每個(gè)生長(zhǎng)出單菌落的培養(yǎng)皿進(jìn)行碘熏，并將有明顯透明圈的單菌落挑出，接種到淀粉培養(yǎng)基斜面，30℃培養(yǎng)48 h。觀(guān)察菌落形態(tài)特征，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

從斜面培養(yǎng)基挑取單菌落，接種到液體種子培養(yǎng)基中，在30℃搖床150 r/m in振蕩培養(yǎng)24 h，然后將種子液以10%的接種量接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基上，30℃、150 r/m in振蕩培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)液測(cè)定淀粉酶活力，得到其中酶活力最大的菌株為高產(chǎn)淀粉酶菌株。

1.4 產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的生理生化性能鑒定

檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)：用接種針挑取復(fù)篩的高產(chǎn)淀粉酶菌株，穿刺接種在檸檬酸鹽培養(yǎng)基試管斜面上，另取一相同檸檬酸鹽培養(yǎng)基試管斜面不接種，作對(duì)照組。將2支試管以30℃培養(yǎng)48 h，觀(guān)察菌落形態(tài)。

細(xì)菌耐熱性：將篩選出來(lái)的細(xì)菌接種到種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，再將菌液放入60℃水浴中30m in，最后取1m L菌液涂布在淀粉培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)24 h。另取未經(jīng)水浴的1m L菌液涂布于同樣的淀粉培養(yǎng)基平板上，作為對(duì)照。

過(guò)氧化氫酶產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)：將復(fù)篩的高產(chǎn)淀粉酶菌株接種在肉湯培養(yǎng)基平皿中，30℃培養(yǎng)24 h。將H2O2溶液滴加到平皿上生長(zhǎng)出的菌落上，觀(guān)察記錄結(jié)果。

1.5 淀粉酶活力的測(cè)定

取1.3中產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后的5m L培養(yǎng)液，5000 r/m in離心10m in，取上清液作為測(cè)定淀粉酶活力的酶液。5m L淀粉溶液以40℃水浴10m in，再加入0.5m L已經(jīng)稀釋10倍的酶液，反應(yīng)5m in后，加入5m L H2SO4溶液終止反應(yīng)。

另取5m L工作碘液于新試管中，然后取0.5m L上述反應(yīng)液混合進(jìn)行顯色反應(yīng)。用620 nm波長(zhǎng)可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，并計(jì)算各試管的酶活力。以0.5m L水代替0.5m L反應(yīng)液為空白，以不加酶液(加相同的水)的管為對(duì)照。

定義酶活力單位：40℃、5 m in內(nèi)水解1 mg淀粉(0.5%淀粉)的酶量定義為1個(gè)活力單位（U）。

酶活力計(jì)算公式：

其中，Rt表示對(duì)照組吸光度值，R代表反應(yīng)液的吸光度值，D為酶液的稀釋倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程要調(diào)節(jié)D值使(Rt-R)/Rt在0.2～0.7。從中篩選出吸光值最小，即酶活力最強(qiáng)的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲中產(chǎn)淀粉酶菌株的初篩結(jié)果

按照1.3的方法，叢臺(tái)酒中溫大曲樣品經(jīng)培養(yǎng)得到單菌落，在進(jìn)行碘熏后對(duì)有透明圈的單菌落進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察，共得到主要7種菌落形態(tài)，見(jiàn)圖1和表1。

2.2 大曲中產(chǎn)淀粉酶菌株的復(fù)篩結(jié)果

按照1.5的方法對(duì)初篩的7株產(chǎn)透明圈菌株測(cè)淀粉酶活力，所得的結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)B3、C1、C3的淀粉酶活力較強(qiáng)，其中B3和C1分別為41.3U和46.6U，與原廠(chǎng)濃香型大曲的淀粉酶活力相近。以C3菌株產(chǎn)淀粉酶活力為最高，為63.1 U，與原廠(chǎng)濃香型大曲的淀粉酶活力（表2中對(duì)照）相比，提高了44.4%。

2.3 對(duì)高產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的生理生化性能鑒定

2.3.1 革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)

圖2為C3菌的革蘭氏染色結(jié)果，從顯微鏡下可見(jiàn)菌細(xì)胞形態(tài)為桿狀，染色結(jié)果顯示紫色，因此確定C3為革蘭氏陽(yáng)性桿菌。

2.3.2 檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)

圖1 具有透明圈的單菌落

表1 菌落形態(tài)特征

表2 淀粉酶活力測(cè)定結(jié)果

圖2 革蘭氏染色結(jié)果

接種了C3菌培養(yǎng)24 h后，檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的顏色，由對(duì)照組的草綠色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，見(jiàn)圖3。這說(shuō)明C3菌可利用檸檬酸鈉。根據(jù)檸檬酸鈉可以被大多數(shù)芽孢桿菌利用這一性質(zhì)，繼續(xù)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 測(cè)定過(guò)氧化氫酶產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)

滴加過(guò)氧化氫到培養(yǎng)C3的培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基表面會(huì)不時(shí)的產(chǎn)生氣泡，說(shuō)明C3菌能夠產(chǎn)生分解過(guò)氧化氫的酶。由于芽孢桿菌都能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，因此可判斷C3菌可能為芽孢桿菌。

圖3 檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 耐熱性實(shí)驗(yàn)

C3菌經(jīng)60℃水浴30m in后，得到與對(duì)照相同的結(jié)果：發(fā)現(xiàn)涂布的平板上布滿(mǎn)細(xì)菌，可見(jiàn)的單菌落在300個(gè)以上。因此C3菌是耐熱的芽孢桿菌。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)對(duì)叢臺(tái)酒成熟中溫大曲中的細(xì)菌進(jìn)行初篩和復(fù)篩，篩選出C3菌為高產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌，其淀粉酶活力為63.1 U，與原廠(chǎng)濃香型大曲的相比，其淀粉酶活力提高了44.4%。C3為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，其菌落為黃褐色，表面無(wú)光澤、不透明且邊緣整齊，有不規(guī)則突起。

[1]侯小歌,杜小波,李學(xué)思,等.中溫大曲中乳酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸特性[J].釀酒科技,2010(9)：17-24.

[2]張中義,暢曉霞,鐘其頂.酒曲酶系、菌系特征及釀造過(guò)程中微生物動(dòng)態(tài)變化[J].釀酒,2008,35(5)：24-29.

[3]唐玉明,張正英,任道群,等.曲外層和曲心的微生物數(shù)量生化性能及釀造效果研究[J].釀酒科技,1995(3)：73-76.

[4]姚萬(wàn)春,唐玉明,張正英,等.瀘型陳曲貯存期微生物酶類(lèi)的變化及釀造效果[J].釀酒科技,1996(4)：19-20.

[5]唐玉明,廖建民,姚萬(wàn)春,等.濃香型曲藥功能菌選育及利用研究[J].釀酒科技,1998(3)：22-24.

[6]廖建民,唐玉明,姚萬(wàn)春,等.濃香型曲藥微生物的分離與篩選研究簡(jiǎn)報(bào)[J].釀酒,2000,136(1)：36-38.

[7]廖建民,任道瓊,唐玉明,等.濃香型曲藥中酵母菌的初步分類(lèi)和選育[J].釀酒,2000,137(2)：47-48.

Isolation and Identification of a Bacteria Strain with High Yield of Amylase from Congtai Daqu

WANG Xinxin,GENG Xiao,WU Zilong and WANG Lei
(Department of Life Science and Engineering,Handan Colleage,Handan,Hebei056000,China)

In this study,transparent circle method and amylase activity measurement were adopted respectively for primary screening and secondary screening of bacteria strains with high yield of amylase from Congtai Daqu.As a result,strain C3 with high yield of amylase was obtained and its amylase activity reached up to 63.1 U,44.4%higher than that of the original Daqu.Through physiological and physiochemical identification,strain C3 was identified as gram-positive Bacillus and its single colony was yellowish-brown with matt surface,neat edge and irregular convex.This study provided reference for obtaining useful bacteria strains in distilleries to improve Daqu quality and liquor yield.

Daqu;amylase;bacteria;isolation;identification

Q93-3；TS261.1；TS262.3；TQ920

A

1001-9286（2017）01-0030-03

10.13746/j.njkj.2016325

邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(1523103064-5)。

2016-11-03

王鑫昕(1982-)，女，河北邯鄲人，講師，主要從事生化和發(fā)酵生產(chǎn)研究。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-12-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161202.1106.002.html。