梁可槿，梁燦恒，利婉紅，鄭偉濤，周 欣

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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大鼠中抗凝血化合物TI-02的含量測(cè)定研究*

梁可槿，梁燦恒，利婉紅，鄭偉濤，周 欣

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

對(duì)一類肽化合物的抗凝活性進(jìn)行初步篩選，同時(shí)建立測(cè)定大鼠血漿中化合物TI-02濃度的HPLC方法。選用C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)，采用甲醇-乙腈-水三元體系梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL?？鼓衔颰I-02在濃度0.125～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，r=0.9964；回收率為97.1%～106.7%；日內(nèi)、日間精密度RSD < 2.3%，室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD < 1.0%。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC測(cè)定方法靈敏度高、精密度好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于該肽類化合物大鼠血漿中濃度的測(cè)定。

肽類化合物；抗凝活性；含量測(cè)定

世界上心腦血管疾病的死亡率一直居于第二位，其中血栓栓塞是造成心腦血管疾病發(fā)病和死亡的主要原因[1-3]，近十年來(lái)研究開發(fā)人工合成新型口服直接凝血酶抑制劑是抗血栓藥物研究的熱點(diǎn)，但取得的成果有限，到目前為止僅上市了阿加曲班和達(dá)比加群酯[4-5]，這類藥物都是針對(duì)單個(gè)有活性的凝血因子，抗凝作用不依賴于抗凝血酶，口服起效快，相對(duì)于華法林半衰期較短，具有良好的劑效關(guān)系，與食物和藥物之間很少相互作用，口服使用無(wú)需監(jiān)測(cè)常規(guī)凝血指標(biāo)，可以減少或者盡量避免因用藥不當(dāng)造成的藥物療效下降或者出血不良事件，且劑量個(gè)體差異小只需固定劑量服用，對(duì)醫(yī)生及患者均極為方便[6-8]。但是這類藥物的缺點(diǎn)是口服利用度較低[9]，因此基于凝血酶的相關(guān)活性位點(diǎn)自主設(shè)計(jì)合成的SIPI-GYEZ-TI系列新化合物，有望獲得選擇性高、活性強(qiáng)、而且口服生物利用度比較好的終產(chǎn)物。通過(guò)選取SIPI-GYEZ-TI系列化合物其中一類新穎的肽化合物，并對(duì)一定數(shù)量的肽類化合物進(jìn)行小鼠的抗凝血實(shí)驗(yàn)，初步篩選出抗凝活性最好的化合物TI-02[10]，而后建立HPLC測(cè)定大鼠血漿中該化合物濃度的方法[11-12]，為后續(xù)更多化合物血藥濃度測(cè)定提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

肽類抗凝血化合物(經(jīng)測(cè)定含量均在98%以上)，自主合成；甲醇、乙腈(色譜純)，Merck公司；純凈水，屈臣氏公司；其他試劑均為分析純。清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重(250±20)g，購(gòu)于廣東藥科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.2 儀器

1200series高效液相色譜儀，德國(guó)安捷倫；AUY120萬(wàn)分之一電子天平，SHIMADZU；G2170BA高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DZF-6050真空干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DL-360超聲震蕩機(jī)，寧波石浦海天電子儀器廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 肽類抗凝血化合物的活性初篩

實(shí)驗(yàn)前期合成8個(gè)肽類系列化合物(表1)，其母核結(jié)構(gòu)中的苯甲脒基為抗凝活性結(jié)構(gòu)，隨著取代基R1的不同化合物的抗凝血IC50也不同，其中TI-02的IC50值是最低，說(shuō)明可能該化合物的抗凝血活性較強(qiáng)。

表1 肽類TI系各化合物的結(jié)構(gòu)和抗凝血IC50值

為了進(jìn)一步比較8個(gè)化合物的抗凝血活性，采用玻片法，以0.5%低分子肝素鈉作對(duì)照，以生理鹽水為空白，進(jìn)行小鼠的抗凝血測(cè)定，以30 mg/kg的劑量對(duì)小鼠腹腔注射，10 min后從眼底靜脈叢取血，滴于玻片上(用生理鹽水清洗，并晾干)，每隔30 s用針進(jìn)行挑絲，進(jìn)行凝血時(shí)間測(cè)定，匯總實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算各組凝血時(shí)間平均數(shù)(表2)。結(jié)果顯示，化合物TI-02的平均凝血時(shí)間最長(zhǎng)，為57.2 min，結(jié)合IC50的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明其抗凝血活性在該8個(gè)肽類化合物中的抗凝活性最強(qiáng)，因此本實(shí)驗(yàn)選用TI-02進(jìn)行大鼠血漿中濃度的測(cè)定。

表2 肽類化合物的抗凝血活性結(jié)果

2.2 色譜條件

色譜柱為DiamonsilTM鉆石C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)，流動(dòng)相比例見表3，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

表3 流動(dòng)相比例

2.3 溶液的制備

TI-02標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取化合物TI-02 0.002 g，置20 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度(100 μg/mL)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血漿供試品：精密量取TI-02標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，與空白血漿90 μL混勻，加入乙腈500 μL，10000 r/min離心5 min，取上清液真空濃縮，殘?jiān)?00 μL的流動(dòng)相溶解，渦旋10000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)樣，得到濃度為10 μg/mL的血漿供試品。

空白血漿：精密量取空白血漿100 μL，照供試品處理方法制得空白血漿樣品。

2.4 方法專屬性

分別取標(biāo)準(zhǔn)TI-02標(biāo)準(zhǔn)溶液、大鼠血漿供試品以及大鼠空白血漿，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見圖1。TI-02標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間為9.663 min，拖尾因子為0.88，理論塔板數(shù)不低于6000；血漿樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物不干擾TI-02測(cè)定。

圖1 大鼠血漿中TI-02 的HPLC色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取TI-02標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備濃度為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取5 μL，與空白血漿95 μL混合，混勻1 min，得到濃度分別為0.125、0.250、0.500、1.00、2.50、5.00、10.0 μg/mL的TI-02標(biāo)準(zhǔn)系列血漿樣品。同法測(cè)定，以TI-02峰面積(A)為縱坐標(biāo)，TI-02濃度(c)為橫坐標(biāo)，得回歸方程y=32.01x+1.3821，r=0.9964，表明血漿中TI-02在0.125～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。定量下限為0.125 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取高、中、低三個(gè)濃度0.125、1.00、10.0 μg/mL的質(zhì)控樣品，同一天連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算TI-02的日內(nèi)精密度；同一樣品連續(xù)5天進(jìn)樣，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見表4，RSD不超過(guò)2.3%，表明精密度良好。

表4 精密度試驗(yàn)

2.7 回收率試驗(yàn)

方法回收率：配制TI-02濃度為0.125、1.00、10.0 μg/mL的血漿樣品各5份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，高、中、低三個(gè)濃度樣品的方法回收率分別為102.9%±2.14%、98.6%±1.46%、104.5%±2.18%。

絕對(duì)回收率：配制TI-02濃度為0.125、1.00、10.0 μg/mL的血漿樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品，各5份。相同色譜條件下測(cè)定，高、中、低三個(gè)濃度樣品的絕對(duì)回收率分別為52.4%±1.69%、57.4%±0.71%、76.5%±1.09%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.8.1 對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性

取對(duì)照品儲(chǔ)備液，加流動(dòng)相稀釋成0.125，1.00，10.0 μg/mL的對(duì)照品溶液，室溫下放置，于0，4，8，12，18，24 h各測(cè)定1次，3個(gè)濃度樣品的測(cè)定值RSD分別為1.0%，1.0%，0.9%，結(jié)果表明，對(duì)照品溶液在室溫放置24 h是穩(wěn)定的。

2.8.2 血漿樣品日內(nèi)的穩(wěn)定性

配制TI-02濃度為0.125，1.00，10.0 μg/mL的血漿樣品，處理后的樣品于室溫下放置，于0，4，8，12，18，24 h各測(cè)定1次，3個(gè)濃度樣品測(cè)定值的RSD分別為1.8%，1.0%，0.6%，結(jié)果表明大鼠血漿樣品的濃度在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8.3 血漿樣品日間的穩(wěn)定性

配制TI-02濃度為0.125，1.00，10.0 μg/mL的血漿樣品，處理后的樣品于4 ℃放置。連續(xù)測(cè)定6 d。3個(gè)濃度血漿樣品測(cè)定值的RSD分別為3.7%、3.2%、2.7%、2.5%、3.0%、2.6%。結(jié)果表明大鼠血漿樣品的濃度在4 ℃放置6天內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.9 血漿樣品的采集和處理

雌雄SD大鼠各3只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，可自由飲水。給藥后4 h內(nèi)禁食、不禁水。單次尾靜脈注射TI-02 5 mg/kg，于給藥后2，4，6，8，10，20，40，60，120 min于大鼠的眼底靜脈叢取血500 μL，4000 r/min離心5 min，分離得到血漿，按“2.3”項(xiàng)下血漿供試品方法處理得到各時(shí)間點(diǎn)的大鼠血樣。

2.10 單次靜注給藥后血藥濃度

大鼠單次給藥后血藥濃度的測(cè)定結(jié)果見表5，以血藥濃度均值為縱坐標(biāo)，取血時(shí)間為橫坐標(biāo)，血藥濃度-時(shí)間的曲線圖見圖2。

表5 大鼠單次給藥后血藥濃度的測(cè)定結(jié)果

圖2 大鼠單次給藥后的血藥濃度-時(shí)間的曲線圖

3 討 論

3.1 化合物TI-02的選擇

化合物TI系列是SIPI-GYEZ-TI系列中一類具有抗凝血活性的肽類化合物。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該TI化合物中的抗凝活性普遍比低分子肝素鈉高，其中TI-02的抗凝活性尤為突出，小鼠給藥后平均凝血時(shí)間為52 min左右。所以本實(shí)驗(yàn)選擇了抗凝血活性最強(qiáng)的化合物TI-02，對(duì)其進(jìn)行HPLC方法測(cè)定大鼠體內(nèi)的血藥濃度。

3.2 TI-02溶劑和分離提取方法的選擇

比較TI-02在甲醇，乙醇，緩沖鹽，水，乙腈，不同pH的溶劑中溶解性發(fā)現(xiàn)，在乙腈和水中，溶解性相對(duì)較好。考慮到成本、環(huán)保及使用的安全性，選擇純凈水作為TI-02的溶劑。TI-02的極性較強(qiáng)，如果采用液-液萃取的方法的話，其回收率很低。因此本實(shí)驗(yàn)選擇了沉淀蛋白法，比較不同有機(jī)溶劑沉淀蛋白，乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯分離提取效果皆不理想，乙腈沉淀最好，提取回收率高，而且和血漿蛋白分離比較完全，所以最后選擇用乙腈沉淀血漿。

3.3 色譜條件的選擇

流動(dòng)相采用甲醇-水體系時(shí)，TI-02和血漿雜質(zhì)峰的分離效果比較好，但洗脫效果很差。采用乙腈-水體系時(shí)，洗脫效果好，但目標(biāo)鋒和雜質(zhì)峰會(huì)重疊，調(diào)整乙腈和水比例后，兩峰的分離度仍無(wú)法達(dá)到要求。嘗試采用三元流動(dòng)相體系，結(jié)合上述兩種體系各自的優(yōu)勢(shì)，最終找到以0～5.5 min水-甲醇(84:16)，5.5～12 min水-乙腈(81:19)，12～20 min水-甲醇(84:16)的流動(dòng)相體系使色譜峰達(dá)到了最優(yōu)的分離洗脫效果。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)化合物TI-02在大鼠血漿中的濃度測(cè)定建立了HPLC方法，為其他肽類化合物的測(cè)定提供參考。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將對(duì)提高肽類化合物靜脈注射的藥時(shí)曲線的血藥濃度值進(jìn)行進(jìn)一步的摸索，同時(shí)對(duì)TI-02的口服利用度作進(jìn)一步的研究，如采取灌胃等方法觀察該化合物在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和藥代途徑，為該化合物的的口服性研究提供數(shù)據(jù)支持。

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Determination of Content of Anticoagulant Compound TI-02 in Rats*

LIANGKe-jin,LIANGCan-heng,LIWan-hong,ZHENGWei-tao,ZHOUXin

(Guangdong Pharmaceutical University, Guangdong Guangzhou 510006, China)

The anticoagulant activity in a class of peptide compounds was preliminary screened, and a HPLC method of determination plasma concentrations of anticoagulant peptides compound TI-02 in rat was established. The separation was performed on a C18chromatographic column (250 mm×4.6 mm, 10 μm) by a gradient elution using ternary system of methanol-acetonitrile-water, at a flow rate of 1 mL/min, detection wavelength was 240 nm, column temperature was 30 ℃, injection volume was 20 μL. The linear range of the plasma concentration of the compound TI-02 was 0.125～10.0 μg/mL (r=0.9964). The extraction recoveries were 97.1%～106.7%, intra-day precision and inter-day precision RSD was less than 2.3%. The blood samples were stable at room temperature for 24 h, RSD was less than 1.0%. The HPLC determination method has high sensitivity, good precision, stable and reliable results and can be used for determination of the blood concentrations of the peptides commands in rats.

anticoagulant compounds; anticoagulant activity; determination

2015年廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510573029)。

梁可槿(1993-)，男，專業(yè)：藥物化學(xué)。

周欣(1982-)，女，實(shí)驗(yàn)師，從事藥物分析研究。

R914 1

A

1001-9677(2016)024-0084-04