李峰

（山西糧食質(zhì)量監(jiān)測中心，山西太原030024）

糧食中赭曲霉毒素A提取方法的改進

李峰*

（山西糧食質(zhì)量監(jiān)測中心，山西太原030024）

赭曲霉毒素（Ochratoxins）是由真菌產(chǎn)生的一組結構類似的、有毒的次級代謝產(chǎn)物，主要危害人和動物的腎臟。赭曲霉毒素有A、B、C、D 4種化合物，其中毒性最大、分布最廣、產(chǎn)毒最高，對農(nóng)作物污染最重，與人類健康密切相關的是赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)。OTA的主要產(chǎn)生菌是赭曲霉（Asperillus ochraceus）和純綠青霉（Penicillium verrucosum）。OTA對食品污染范圍較廣，包括谷物、咖啡豆、豆類、可可豆、葡萄干、啤酒和葡萄汁等，OTA還可通過母親的血液轉(zhuǎn)入到乳汁中。1993年國際癌癥研究機構（The Interna-tional A-gency for Research on cancer，IARC）已將OTA列為可能的人類致癌物。

本文以小麥中OTA的提取方法為例進行探究，主要參考標準包括：GB/T 2761—2011《食品安全國家標準食品中真菌毒素的限量》、GB/T 23502—2009《食品中赭曲霉毒素A的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法》、GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》、GB/T 5009.1—2003《食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分總則》。GB/T 23502—2009中給定的提取方法得到的回收率較低，因此本試驗結合國標方法和免疫親和柱操作手冊對GB/T 23502—2009中提取OTA的方法進行了改進，使回收率得到提高。本方法凈化效果好、準度高、重現(xiàn)性好，可以滿足糧食中OTA的限量檢測要求。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

日立L-2000四元梯度高效液相色譜儀，包含日立L-2485包含熒光檢測器、日立L-2200自動進樣器、日立L-2300柱恒溫箱、日立L-2130泵；高速分散均質(zhì)機，IKA T25 digital ULTRA-TURRAX；YP402N電子天平；TGC-16WS臺式高速離心機；氮吹儀，北京斯珀特科技有限公司；250 mL三角瓶。

1.2 試劑

乙腈、甲醇，均為色譜級；乙酸、氯化鈉、碳酸氫鈉，均為分析純；超純水，艾科浦超純水系統(tǒng)生產(chǎn)。

真菌標準品：OTA標準溶液，質(zhì)量濃度100 μg/mL，由Pribolab Pte.Ltd生產(chǎn)。

標準工作液：質(zhì)量濃度分別為1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L。

提取液：1%碳酸氫鈉-甲醇-水（80%甲醇+20%水）混合溶液。

免疫親和柱：IAC-SEP OTA免疫親和柱，由中檢維康生產(chǎn)，柱體積3 mL（適用于手工加液，以自然流速流下），柱容量100 ng。

1.3 色譜條件

色譜柱：依利特-C18，4.6 mm×150 mm(5 μm)；流動相：乙腈∶水∶乙酸（99∶99∶2）；流速：0.9 mL/min；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長477 nm；進樣體積：30 μL；柱溫：40℃。

1.4 加標量的確定

根據(jù)GB 2761—2011中各產(chǎn)品OTA的限量點為5 μg/kg，加標量點確定為限量點的25%、50%、100%，即25 g樣品中加入OTA的量分別為31.2 ng、62.5 ng、125.0 ng。

1.5 優(yōu)化條件確定

1.5.1 洗脫時間對回收率的影響

以小麥中OTA限量點的100%加標，按照GB/T 23502—2009中的要求加入1.5 mL無水甲醇進行洗脫，平均回收率為54.7%，改良方法中甲醇體積增加到2 mL，平均回收率提高至63.1%，結果見表1。

表1 不同洗脫體積加標回收率

1.5.2 堿液質(zhì)量濃度對回收率的影響

OTA易溶于極性有機溶劑和堿性溶液，向GB/T23502—2009中提取液甲醇-水混合液加入一定量的堿液進行試驗，取3個水平質(zhì)量濃度的碳酸氫鈉-甲醇-水混合液質(zhì)量濃度分別為0.5%、0.7%、1.0%進行提取，并用1.5 mL洗脫液洗脫，其中1.0%的碳酸氫鈉-甲醇-水混合液已達到飽和狀態(tài)。結果顯示，在0.5%、0.7%的堿性溶液中，加標回收率并沒有提高，但堿液質(zhì)量濃度加大到1.0%時，回收率顯著提高，結果見表2。

表2 各水平質(zhì)量濃度加標回收率

1.5.3 均質(zhì)時間對回收率的影響

GB/T23502—2009中規(guī)定樣品均質(zhì)時間為3min，對兩組加標樣分別均質(zhì)3 min、4 min，均質(zhì)機轉(zhuǎn)速均為10 000 r/min，結果見表3。由表3可知，加標回收率在均質(zhì)4 min時有大幅度提高。

表3 不同均質(zhì)時間加標回收率

1.5.4 過濾優(yōu)化

國標方法中規(guī)定過濾OTA提取液時要用玻璃纖維濾紙，但是玻璃纖維濾紙成本高，普通濾紙易吸附目標物，且在過濾粉狀樣品時易堵塞，液體難以流下。因此，本試驗采用離心法分離OTA提取液，效果良好。

1.5.5 優(yōu)化條件結論

小麥OTA測定加標回收試驗中，提取液為質(zhì)量濃度1%的碳酸氫鈉-甲醇-水混合液，均質(zhì)時間4 min，均質(zhì)機轉(zhuǎn)速10 000 r/min，洗脫液體積取2 mL為最終改進試驗條件。

1.6 提取與凈化

準確稱取25 g樣品置于250 mL的三角瓶中并加標，加入140 mL提取液，在轉(zhuǎn)速10 000 r/min的均質(zhì)機中提取4 min，靜置5 min。吸取8 mL上層液置于10 mL離心管中，10 000 r/min離心10 min。

取5 mL離心后上清液，加入20 mL超純水混勻，靜置5 min后，取10 mL混合液通過免疫親和柱，流速控制在1～2滴/s，液體全部流出后，再用20 mL超純水以流速1～2滴/s清洗柱子，并將最后一滴水全部吹出。

最后用2 mL無水甲醇洗脫免疫親和柱并收集洗脫液，將最后一滴甲醇全部吹入至收集管中，在60℃下用氮氣吹干，加入1 mL流動相定容，混勻后利用高效液相色譜儀進行測定。

2 結果與分析

2.1 標準色譜圖和線性范圍

在上述色譜條件下，OTA的標準品色譜圖如圖1所示。

圖1 OTA的標準品色譜圖

將配制好的標準工作液做線性回歸分析，以峰面積Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X為橫坐標得到OTA的線性方程和相關系數(shù)，Y=26 055X+2 377.9，R2= 0.999 9，線性范圍1 μg/L～50 μg/L，OTA標準曲線如圖2所示。

圖2 OTA標準曲線圖

2.2 樣品加標回收測定

2.2.1 樣品加標色譜圖

本試驗以小麥OTA限量點為基準，分別向3組樣品添加OTA，加標量分別為31.2 ng、62.5 ng、125.0 ng，每組樣品做3個平行。小麥空白基質(zhì)及加標樣品色譜圖分別見圖3、圖4、圖5、圖6。

圖3 小麥空白基質(zhì)色譜圖

圖4 小麥OTA加標量為31.2 ng色譜圖

圖5 小麥OTA加標量為62.5 ng色譜圖

圖6 小麥OTA加標量為125.0 ng色譜圖

2.2.2 回收率試驗

向小麥基質(zhì)中添加OTA的量分別為31.2 ng、62.5 ng、125.0 ng，三組平行加標回收率結果見表4。

表4 小麥基質(zhì)不同加標量的回收率

同時按照此方法還做了玉米、大豆、小麥粉、玉米的OTA加標回收試驗，OTA的平均回收率（%）見表5。

表5 各種產(chǎn)品基質(zhì)不同加標量的回收率

3 結論

本文主要對糧食中OTA的提取和凈化方法進行了對比、研究。在GB/T 23502—2009中OTA提取凈化的基礎上結合試驗中的具體操作進行了優(yōu)化和改進，最終將OTA回收率從54.8%提高到95.0%。本方法凈化效果好，分析靈敏、可靠、準確度和精密度較高，能夠應用于糧食中OTA的檢測工作，滿足分析要求，有參考應用價值。

［1］RATOLA N，MARTINS L，ALVES A.Ochratoxin A in winesassessing global uncertainty associated with the results［J］. Analytica Chimica Acta，2004，513:319-324.

［2］LEITNER A，ZOLLENER P，PAOLILLO A，et al.Comparison of methods for the determination.of ochratoxin A in wine［J］.Analytica Chimica Acta，2002，453:319-324.

Study on extraction method of ochratoxin Ain crop

LI Feng*
（Shanxi crop monnitoring center，Shanxi Taiyuan 030024，China）

根據(jù)赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）易溶于極性有機溶劑和堿性溶液的特性，利用堿性甲醇-水混合液提取糧食中的OTA，并通過免疫親和柱提取純化，采用高效液相色譜法進行測定。試驗結果表明，方法改進后OTA的回收率提高到80%～96%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》規(guī)定要求。

赭曲霉毒素A；高效液相法；回收率

Ochratoxin A easily dissolved in organic solvent and alkaline solution,so the method was developed for the determination of ochratoxin A in crop by high performance liquid chromatography after alkaline methanol-water mixed solution extraction,immunoaffinity column clean-up.The results showed that the average recovery rate of ochratoxin A wereimproved to80%～96%.Theimproved method compliedwith specified requirementsofGB/T27404-2008.

ochratoxin A；high performance liquid chromatography；average recovery rate

表4 3種質(zhì)量濃度加標回收率

TS207.5+3

A

1673-6044（2016）04-0055-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.04.015

*李峰，男，1984年出生，2009年畢業(yè)于河南工業(yè)大學食品科學與工程專業(yè)，助理工程師。

2016-10-21