蔣雨函, 許廣波, 梁運(yùn)江, 李太元, 李美善, 李艷茹

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

雞爪苓菌絲體與子實(shí)體的全長cDNA文庫構(gòu)建及部分EST序列分析

蔣雨函, 許廣波, 梁運(yùn)江, 李太元, 李美善, 李艷茹*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

構(gòu)建長白山藥用真菌雞爪苓菌絲體和子實(shí)體cDNA文庫并測序，發(fā)掘雞爪苓菌絲體和子實(shí)體發(fā)育中差異表達(dá)的基因；通過同源性比對，分析與陜西豬苓的親緣關(guān)系，確立長白山雞爪苓的分類地位。結(jié)果表明：雞爪苓菌絲體和子實(shí)體cDNA文庫滴度分別為1.504×1010pfu/mL和1.094×1010pfu/mL。從菌絲體cDNA文庫選取500個克隆，經(jīng)測序獲得452個高質(zhì)量表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，序列拼接出的單一基因簇包含310個單一基因；從子實(shí)體cDNA文庫中選取的500個克隆，經(jīng)測序獲得472個高質(zhì)量表達(dá)序列標(biāo)簽，序列拼接出的單一基因簇包含350個單一基因。從菌絲體和子實(shí)體cDNA文庫中發(fā)掘的單一基因簇中，分別有39.3%和35.4%的基因與已知功能基因具有同源性，這些基因涉及細(xì)胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)錄、抗逆反應(yīng)以及能量代謝等。

雞爪苓；全長cDNA文庫；表達(dá)序列標(biāo)簽；功能注釋

豬苓(Polyponusumbellatus(Pers.) Fr)是一種藥用真菌，分地下生長的菌核和露出地表的子實(shí)體2部分[1]。我國陜西、云南、四川等省和東北長白山區(qū)是豬苓主要分布區(qū)域。從菌核的形態(tài)上可把豬苓劃分為豬苓和雞爪苓；豬苓菌核體形較大、形似豬糞、分枝少、表面較光滑；而雞爪苓菌核塊細(xì)小，形似雞爪、分枝多、呈餅狀[2-5]。Xing等(2013年)[6]對產(chǎn)自吉林長白山和陜西秦嶺的豬苓菌核進(jìn)行了 nrDNA ITS 和 28S rRNA(LSU)序列的比對分析，認(rèn)為產(chǎn)于長白山的雞爪苓和產(chǎn)于陜西等地的豬苓之間存在種內(nèi)遺傳差異，提出長白山雞爪苓應(yīng)列為單獨(dú)類群。

表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags，EST)是從已構(gòu)建的cDNA文庫中隨機(jī)選擇克隆，進(jìn)行5′-端和3′-端測序獲得的短片段cDNA序列，是一個完整基因的一小部分[7-9]。廖鏖等(2014年)[10]和欒換東等(2015年)[11]對雞爪苓菌絲體和子實(shí)體分別進(jìn)行了cDNA文庫構(gòu)建，并在Nr/Nt數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了Blast初步分析，找到了一小部分同源性基因。目前，關(guān)于豬苓cDNA文庫構(gòu)建和EST序列分析方面的研究還很少，在NCBI數(shù)據(jù)庫可查尋的豬苓EST只有264條。

本研究擬在構(gòu)建雞爪苓菌絲體和子實(shí)體2個生長階段的高質(zhì)量全長cDNA文庫的基礎(chǔ)上，通過測序獲得表達(dá)序列標(biāo)簽，并對其進(jìn)行功能注釋，為闡明雞爪苓菌絲體和子實(shí)體2個生長發(fā)育中基因表達(dá)的差異、發(fā)掘參與雞爪苓菌絲體生長發(fā)育與子實(shí)體發(fā)生相關(guān)的重要基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雞爪苓菌絲體由采自吉林省安圖縣的雞爪苓菌核經(jīng)組織分離后培養(yǎng)獲得，經(jīng)純化擴(kuò)繁后保存于延邊大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。雞爪苓子實(shí)體采自吉林省蛟河市天南鄉(xiāng)解放村，新鮮的子實(shí)體經(jīng)冷藏保鮮帶回實(shí)驗(yàn)室后用液氮冷凍處理備用。

1.2 雞爪苓菌絲體和子實(shí)體全長cDNA文庫的構(gòu)建及其測序

菌絲體和子實(shí)體總RNA的提取參照 Trizol reagent 說明書進(jìn)行操作；用改進(jìn)的SMARTTM法[12]合成cDNA，通過LD-PCR擴(kuò)增cDNA；經(jīng)蛋白酶K消化、Sfi I酶切和CHROMA SPIN-400分級分離cDNA和構(gòu)建雞爪苓菌絲體和子實(shí)體全長cDNA文庫。用 λ Triple × 2噬菌體包裝，統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)和藍(lán)白菌落數(shù)，對原始文庫進(jìn)行文庫滴度和重組率的測定。再分別從菌絲體和子實(shí)體cDNA文庫中各隨機(jī)挑取500個克隆送至上海生工生物工程股份有限公司(長春分公司)進(jìn)行測序。

1.3 EST序列的預(yù)處理

利用Chromas軟件分析cDNA序列峰圖，手動去掉800 bp下游序列部分；再利用NCBI網(wǎng)站中的VecScreen工具快速去除cDNA中的載體序列部分后，再使用Seqman程序?qū)τ行蛄羞M(jìn)行聚類拼接。

1.4 EST的功能注釋

將聚類拼接得到的EST有效序列，利用NCBI網(wǎng)站的核酸庫Nt和蛋白庫Nr進(jìn)行BLASTN或BLASTX比對，E值設(shè)為1e-5。使用GO(Gene Ontology，基因本體論)數(shù)據(jù)庫對雞爪苓菌絲體和子實(shí)體全長cDNA文庫的EST進(jìn)行功能分類注釋，獲得分子功能、生物學(xué)過程和細(xì)胞組分等3方面的注釋信息。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

雞爪苓系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，采用MEGA6.05軟件中的NJ法。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞爪苓菌絲體和子實(shí)體全長cDNA文庫的質(zhì)量鑒定

構(gòu)建的雞爪苓菌絲體和子實(shí)體全長cDNA文庫，經(jīng)測定，菌絲體的cDNA原始文庫滴度為1.66×106pfu/mL，重組率為96.7%；擴(kuò)增后，文庫的滴度為1.50×1010pfu/mL，插入片段長度主要在500～2 000 bp(圖1)。子實(shí)體的cDNA原始文庫滴度為5. 63×106pfu/mL，重組率為98.7%；擴(kuò)增后文庫的滴度為1. 10×1010pfu/mL，插入片段長度主要在500～2 000 bp(圖2)。說明構(gòu)建的雞爪苓菌絲體和子實(shí)體全長cDNA文庫均達(dá)到建庫的預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-23：分別為文庫中隨機(jī)挑選出來的克隆

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-24：分別為文庫中隨機(jī)挑選出來的克隆

2.2 測序

從雞爪苓菌絲體和子實(shí)體cDNA文庫中分別隨機(jī)挑選500個克隆進(jìn)行單向測序，共獲得452和472條高質(zhì)量序列，平均長度為561和555 bp(表1)。

表1 菌絲體和子實(shí)體cDNA文庫的ESTs

Table 1 ESTs from cDNA library of mycelium and fruit body

描述項(xiàng)數(shù)目菌絲體子實(shí)體ESTs總數(shù)/條500500 空載體序列/條251 低質(zhì)量序列/條2327 有效的ESTs/條452472有效ESTs平均長度/bp561555包含contigs的ESTs數(shù)目/條207201重疊群/條6579單拷貝EST/條245271單基因簇/條310350冗余度/%3126

通過聚類并對同一重疊群進(jìn)行拼接，菌絲體文庫中一共獲得了65個含1條以上EST的重疊群和245條僅含1條EST的單一序列，即代表了310條單基因簇，文庫的冗余度為31%；子實(shí)體文庫中一共獲得了79個含1條以上的EST的重疊群和271條僅含1條EST的單一序列，即代表了350條單基因簇，文庫的冗余度為26%。

2.3 EST序列注釋

按高瑞娟(2003)、[13]崔永蘭(2004)[14]、cason等(2002)[15]和Crookshankst等(2001)[16]的EST序列注釋法，根據(jù)BLAST所得序列一致性，將EST劃分為3大類，E值 < 10-5且編碼己知蛋白的屬于“功能己知基因”類 ；編碼推測的和未知蛋白質(zhì)的EST屬于功能未定的“假定蛋白質(zhì)” 類 ； 而E值>10-5及注釋結(jié)果為缺乏顯著相似性的EST被認(rèn)為是可能的新基因片段，納入“無顯著相似性”基因(表2)。

表2 EST的BLAST搜索及其同源蛋白分類

功能已知基因其功能涉及細(xì)胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)錄、抗逆反應(yīng)以及能量代謝，選擇覆蓋率95%以上或95%的EST列入表中(表3，4)。

對基因的功能注釋結(jié)果表明，雞爪苓菌絲體和子實(shí)體全長cDNA文庫中參與蛋白質(zhì)合成和能量代謝的基因較多，而且同源物種多數(shù)為真菌。

表3 已知功基因同源的菌絲體ESTs

表4 已知功基因同源的子實(shí)體ESTs

續(xù)表4 已知功基因同源的子實(shí)體ESTs

2.4 基因功能分類

雞爪苓菌絲體的基因GO注釋結(jié)果見圖3。

由圖3可知，僅有175條獲得1條或1條以上GO術(shù)語，包括細(xì)胞組分、分子功能和生化過程3個層次。細(xì)胞組分包括8個部分，分子功能包括2個部分，生化過程包括17個部分。雞爪苓子實(shí)體的基因GO注釋結(jié)果，僅有188條獲得1條或1條以上GO術(shù)語，亦包括細(xì)胞組分、分子功能和生化過程3個層次。細(xì)胞組分包括6個部分，分子功能包括3個部分，生物學(xué)過程包括19個部分(圖3)。在細(xì)胞組分(cellular component)中，菌絲體在包膜(envelope)和細(xì)胞器(organelle part)上單獨(dú)表達(dá)，子實(shí)體在胞外部分(extracellular region part)上單獨(dú)表達(dá)。在分子功能(molecular function)中，子實(shí)體在輸送體(transporter)上單獨(dú)表達(dá)。在生化過程中(biological Process)中，子實(shí)體在生物附著(biological adhesion)和生長(growth)上單獨(dú)表達(dá)?？梢?，雞爪苓在菌絲體和子實(shí)體的2個生長階段存在著基因表達(dá)上的差異。

圖3 雞爪苓菌絲體和子實(shí)體基因的GO功能注釋

2.5 雞爪苓的進(jìn)化親緣關(guān)系

從雞爪苓的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系(圖4)來看，長白山雞爪苓(chicken-claw-shapedPolyporusumbellatus)與云芝(TrametesversicolorFP-101664SS1)、革菌(PunctulariastrigosozonataHHB-11173SS5)、污叉絲孔菌(DichomitussqualensLYAD-421SS1)和灰蓋傘菌(Coprinopsiscinereaokayama7*130)的進(jìn)化關(guān)系較近；而陜西豬苓(Polyporusumbellatus)和立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniAG-1IA)的進(jìn)化關(guān)系較近。雖然長白山雞爪苓與陜西豬苓在傳統(tǒng)分類學(xué)上都劃歸豬苓，但本研究中所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中處于不同的遞進(jìn)分枝中(圖4)；說明長白山雞爪苓和陜西豬苓在進(jìn)化上存在較大分化，2者之間在遺傳上存在較大差異。

圖4 不同真菌系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論與結(jié)論

亞種通常是一個物種因地理隔離導(dǎo)致缺乏基因流所致，若進(jìn)一步分化，甚至成為新的物種。從系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系來看(圖4)，長白山區(qū)雞爪苓和陜西豬苓分別位于不同的分枝中，長白山區(qū)雞爪苓菌與云芝、革菌、污叉絲孔菌及灰蓋傘菌在進(jìn)化上關(guān)系較近，而與陜西豬苓在進(jìn)化上關(guān)系較遠(yuǎn)，這與Xing等(2013)的研究結(jié)果一致。說明雞爪苓是長白山區(qū)特異的豬苓種質(zhì)資源，不僅在菌核形態(tài)上與陜西豬苓差別很大，而且在遺傳上也存在較大差異。

本研究成功構(gòu)建了雞爪苓菌絲體和子實(shí)體2個cDNA文庫，分別獲得452和472條高質(zhì)量EST序列，并分別發(fā)掘出310和350條單一基因(unigene)。在菌絲體文庫中267條單一基因和子實(shí)體文庫中316條單一基因與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)基因有同源性；但有13.9%的雞爪苓菌絲體單一基因(43個)和9.7%的雞爪苓子實(shí)體單一基因(34個)在NCBI公共數(shù)據(jù)庫中未能搜索到與之相關(guān)的基因。由于NCBI數(shù)據(jù)庫中包含的基因數(shù)量和信息量非常龐大，本研究中所發(fā)掘的未知基因很有可能是雞爪苓特異表達(dá)的基因，在雞爪苓生長過程中具有重要功能?？傊?，目前在共享生物信息數(shù)據(jù)庫中關(guān)于豬苓的基因和基因組序列信息相對較少，本研究通過EST分析結(jié)果進(jìn)一步豐富了雞爪苓基因組信息，為全面了解雞爪苓菌絲和子實(shí)體形成的分子機(jī)制奠定了理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Construction and EST sequence analysis of full-length cDNA library of mycelia and fruit body of medicinal fungus chicken-claw-shaped Polyporus umbellatus in the Changbai Mountain area

JIANG Yuhan, XU Guangbo， LIANG Yunjiang， LI Taiyuan， LI Meishan， LI Yanru*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

The cDNA library from the mycelia and fruit body of medicinal fungus chicken-claw-shapedPolyporusUmbellatusin Changbai Mountains was constructed and sequenced, and the genes differentially expressed between mycelium and fruit body were explored.In addition, by homologous analysis, its genetic relationship to ShǎnxiPolyporusUmbellatuswas determined and, its taxonomical status was established. The results showed that the titers for cDNA libraries of mycelium and fruit body were 1.504×1010pfu/mL and 1.094×1010pfu/mL,respectively. A total of 500 clones randomly selected from the cDNA library of mycelium producted 452 high quality ESTs and, from which 310 unigenes were annotated, whereas a total of 500 clones randomly selected from the cDNA library of fruit body produced 472 high quality ESTs and, from which 350 unigenes were annotated. Among the unigenes from cDNA libraries of mycelium and fruit body, approximately 44.5% and 42.6% of unigenes were homologous to the known genes concerned with cell development, signal transduction, protein synthesis, transcription, tolerance response to stress and energy metabolism.

chicken-claw-shaped polyporus umbellatus；cDNA library；EST；annotation

2016-10-20 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160014)

蔣雨函(1993—)，女，吉林四平人，在讀碩士，研究方向?yàn)樗幱谜婢鷮W(xué)。李艷茹為通信作者，

E-mail：gbxu@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)04-0277-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.001

S567.3

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