賀源+肖凱夫+王智

摘 要：為研究東亞鉗蝎毒素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2增殖的影響，以不同濃度的東亞鉗蝎毒素（10、20、40 μg/mL）干預(yù)體外培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞，分別于24、48 h后，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法，觀察毒素對(duì)Caco-2細(xì)胞的增殖抑制作用，運(yùn)用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗(yàn)檢測(cè)蝎毒素對(duì)Caco-2細(xì)胞的作用途徑。結(jié)果表明：東亞鉗蝎毒素不僅能抑制Caco-2細(xì)胞的增殖而且能促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且毒素對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖的抑制作用具有濃度和時(shí)間的依賴關(guān)系，隨濃度加大和時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：Caco-2人結(jié)腸癌細(xì)胞；東亞鉗蝎毒；細(xì)胞增殖；抗腫瘤

中圖分類號(hào)：Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）12-0136-06

Abstract The effects of Buthus martensii Karsch venom on proliferation of human colon adenocarcinoma cell line Caco-2 were investigated in this study. The test used different concentrations （10， 20， 40 μg/mL） of Buthus martensii Karsch venom to interfere the Caco-2 cells cultured in vitro for 24 and 48 hours， then the proliferation inhibition effects was observed by means of MTT assay. The mechanism of venom on Caco-2 cells was measured by lymphocyte transformation and lactate dehydrogenase release assays. The data indicated that Buthus martensii Karsch venom could inhibit the Caco-2 cell proliferation and promote the lymphocyte transformation. Besides， the inhibition effects were closely related to the treatment time and venom concentration， which enhanced with the extension of treatment time and increase of venom concentration.

Keywords Human colon adenocarcinoma cell line Caco-2； Buthus martensii Karsch； Cell proliferation； Antitumor

癌癥已經(jīng)成為威脅人類健康的第一殺手[1]，也是死亡率最高的疾病之一[2，3]，癌癥的預(yù)防與治療任務(wù)十分艱巨[4]。根據(jù)目前癌癥的發(fā)病趨勢(shì)，2020年全世界癌癥發(fā)病率將比現(xiàn)在增加50%[5]。因此，找到并運(yùn)用新的抗癌藥物成為人類戰(zhàn)勝癌癥的關(guān)鍵。

現(xiàn)有研究表明，蝎毒對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用，能有效地導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡[6]。蝎毒在抗腫瘤的同時(shí)還具有明顯的調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，是一種理想的抗腫瘤藥物[7-10]。目前，關(guān)于蝎毒抗腫瘤研究的報(bào)道很多，對(duì)蝎毒素的分離、純化及藥理作用等也進(jìn)行了深入研究[11-16]。本研究就是在前人工作的基礎(chǔ)上，以常見的東亞鉗蝎（Buthus martensii Karsch）毒素作為研究材料，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法，觀察不同濃度東亞鉗蝎毒素處理不同時(shí)間對(duì)Caco-2細(xì)胞的增殖抑制作用，同時(shí)通過(guò)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)考察蝎毒是否具有免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞受損程度，從而探討該毒蝎毒素對(duì)Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用途徑，以豐富蝎目動(dòng)物在毒理學(xué)和藥理學(xué)等方面的理論內(nèi)涵，為東亞鉗蝎毒素的開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 東亞鉗蝎毒素，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物研究室提取，-20℃長(zhǎng)期保存，完全培養(yǎng)液溶解，細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾滅菌，按試驗(yàn)要求加入完全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

青霉素和鏈霉素，華北制藥股份有限公司產(chǎn)品；DMEM（高糖）培養(yǎng)基，Hyclone產(chǎn)品；0.1%胰蛋白酶（含EDTA）、谷氨酰胺（1 mL/支）和0.01 mol/L等滲PBS液（pH 7.4），均為湘雅第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心分裝配置；胎牛血清（FCS），杭州四季青生物工程材料公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（dimethylsulfoxid，DMSO），合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；四甲基氮唑鹽（3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT），Sigma公司國(guó)產(chǎn)分裝；刀豆素Con-A（Cat.No.C8110），為Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)胞裂解液（Cat#RT1220），北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 分析天平，上海天平儀器廠；細(xì)菌過(guò)濾器，日本NIPPON公司；25 cm2培養(yǎng)瓶（Cat-NO.：690 170），德國(guó)Greiner Bio-One GmbH產(chǎn)品；96孔培養(yǎng)板，美國(guó)COSTAR公司；移液槍（20、200、1 000 μL），湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室提供；Tips，Hlue Light Biiolab 技術(shù)公司；冰箱（BCD-213型），海爾集團(tuán)；低溫冰箱（MDF-328E型），日本SANYO公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)板，上海天光玻璃儀器廠；CO2培養(yǎng)箱，Thermo Forma；倒置相差顯微鏡（LH-50A型），日本OLYMPUS公司；超凈工作臺(tái)，Thermo Electron Corporation；低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，Thermo Labsystems。

1.1.3 動(dòng)物與細(xì)胞株 昆明種小鼠，購(gòu)自湖南思萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。Caco-2人結(jié)腸癌細(xì)胞，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院熊友健惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Caco-2細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)：將冷凍管迅速由-80℃低溫冰柜轉(zhuǎn)入37℃恒溫水浴箱中，搖動(dòng)使其快速溶解， 將解凍后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含4℃預(yù)平衡培養(yǎng)液的試管中；75%乙醇消毒凍存管，立即移入超凈工作臺(tái)中，在無(wú)菌條件下打開凍存管，用吸管吸取細(xì)胞懸液于無(wú)菌離心管中；蓋好蓋子，輕輕搖勻，細(xì)胞懸液在4℃下500×g離心10 min；棄上清，向沉淀中加入5 mL含150 U/mL青霉素、鏈霉素和10% FCS的DMEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到25 cm3無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：每2～3 d，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Caco-2細(xì)胞從CO2培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺(tái)中倒掉瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗2遍；加入少許0.1%胰蛋白酶消化液（含EDTA）進(jìn)行預(yù)消化，后加入1 mL胰酶，于37℃靜置2～3 min。在倒置顯微鏡下觀察被消化細(xì)胞，如果細(xì)胞邊緣變圓，相互之間不再連接成片，立即在超凈臺(tái)中將胰蛋白酶消化液倒掉，加入2 mL含血清新鮮培養(yǎng)液終止消化，用吹打管吹打200～300次，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液各吸出1 mL分別加到另4個(gè)培養(yǎng)瓶中，并向每個(gè)瓶中分別加3～4 mL培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存：在收集細(xì)胞24 h前更換培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按比例（培養(yǎng)液∶血清∶DMSO=7∶2∶1）配置凍存液；倒掉瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗2遍；加入少許0.1%胰蛋白酶消化液（含EDTA）消化2～3 min，滴加DMEM培養(yǎng)液，制成1 mL細(xì)胞懸液，4℃條件下900×g離心5 min；將沉淀的細(xì)胞重新懸浮在凍存液中（約1×107個(gè)細(xì)胞/mL凍存液），制成細(xì)胞懸液；每個(gè)冷凍管中加入1.5 mL細(xì)胞懸液，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽（MTT）藥敏試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，用0.1%胰酶（含EDTA）消化，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用高糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，終密度約為3×104個(gè)/mL。將懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，并分別加入陰性對(duì)照PBS緩沖液、陽(yáng)性對(duì)照Con-A及不同濃度的東亞鉗蝎毒素（10、20、40 μg/mL）各200 μL，每處理重復(fù)3個(gè)孔。另設(shè)只加DMEM培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白對(duì)照。置于飽和濕度、溫度37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h，各培養(yǎng)孔加入1 mg/mL MTT 10 μL，4 h后棄去培養(yǎng)上清，PBS緩沖液充分洗滌細(xì)胞，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器上振蕩10 min，充分溶解甲臜（formazan）結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度A值，測(cè)定波長(zhǎng)λ=570 nm，參考波長(zhǎng)λ=630 nm。計(jì)算相對(duì)于陰性對(duì)照的生長(zhǎng)抑制率。

抑制率（CI，%）=（陰性對(duì)照組A值-試驗(yàn)組A值）/陰性對(duì)照組A值×100

1.2.3 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 小鼠脾細(xì)胞的制備：將小鼠折頸處死后，立即用75%乙醇溶液浸泡消毒體表；無(wú)菌條件下取脾臟，置于D-hanks緩沖液中，用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單細(xì)胞懸液；400目篩網(wǎng)過(guò)濾，用PBS緩沖液洗3次，每次離心10 min（800×g），棄上清液；加入5～7 mL紅細(xì)胞裂解液使紅細(xì)胞溶解，37℃水浴5～10 min，800×g離心10 min，棄上清；加入適量PBS緩沖液吹吸混勻，800×g離心10 min，棄上清；將細(xì)胞懸浮于2 mL完全培養(yǎng)液中，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，高糖DMEM完全培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)成5×105個(gè)/mL。

試驗(yàn)分組：陽(yáng)性對(duì)照組（在小鼠脾細(xì)胞懸液中加入濃度為10 μg/mL的Con A溶液）；陰性對(duì)照組（在小鼠脾細(xì)胞懸液中加入濃度為10 μg/mL的PBS緩沖液）；試驗(yàn)組（在小鼠脾細(xì)胞懸液中分別加入濃度為10、20、40 μg/mL東亞鉗蝎毒素）。

試驗(yàn)程序：調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，24 h后棄舊培基，分別加入各組溶液，重復(fù)6孔。將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μL 1 mg/mL MTT，4 h后棄去上清，PBS緩沖液充分洗滌細(xì)胞，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器上振蕩10 min，充分溶解甲臜結(jié)晶。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度A值，測(cè)定波長(zhǎng)λ=570 nm，參考波長(zhǎng)λ=630 nm。計(jì)算轉(zhuǎn)化指數(shù)。

轉(zhuǎn)化指數(shù)（%）=（加Con A孔A值-不加Con A孔A值）/加Con A孔A值×100

1.2.4 乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗(yàn) 將Caco-2細(xì)胞以3×104個(gè)/mL濃度接種于24孔培養(yǎng)板，37℃、5%CO2孵育24 h，無(wú)血清同步化處理后隨機(jī)分組，對(duì)照組和試驗(yàn)組細(xì)胞處理及細(xì)胞分組同上，每份樣品重復(fù)3孔。常規(guī)條件下孵育后于24、48 h后收集上清液，用紫外分光光度計(jì)比色法檢測(cè)LDH釋放量，計(jì)算LDH釋放率。

LDH釋放率（%）=（LDH上清液釋放量-LDH原標(biāo)本量釋放量）/LDH原標(biāo)本釋放量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 Caco-2細(xì)胞的體外培養(yǎng)

日常細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，Caco-2細(xì)胞進(jìn)行傳代的標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)即長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底70%～80%；倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)24 h的細(xì)胞為鋪路石狀（圖1）：細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)完整，細(xì)胞連接緊密，數(shù)量多。由于該細(xì)胞貼壁較強(qiáng)、胞間連接較緊密，所以在胰酶作用消化時(shí)間和細(xì)胞吹打上，可以考慮稍加延長(zhǎng)，即消化3 min，吹打300次為宜。

2.2 東亞鉗蝎毒素對(duì)Caco-2人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制作用的量效關(guān)系

MTT藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照比較，處理Caco-2細(xì)胞24 h后，蝎毒處理組貼壁細(xì)胞數(shù)量稀少，且隨蝎毒處理濃度增加越來(lái)越少，細(xì)胞形態(tài)也變得欠清晰（圖2）；不同濃度東亞鉗蝎毒素對(duì)Caco-2細(xì)胞均有抑制作用，且抑制率隨毒素濃度升高而遞增，具有良好的量效關(guān)系（圖3）。

2.3 東亞鉗蝎毒素對(duì)Caco-2人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制作用的時(shí)效關(guān)系

MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，各濃度毒素對(duì)Caco-2細(xì)胞的增殖抑制率均為48 h時(shí)高于24 h時(shí)，即隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，可見各濃度毒素對(duì)Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)具有時(shí)間依賴性（圖4）。

2.4 Caco-2人結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)毒素作用后淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果

由表1可知，與陰性對(duì)照相比， 20、40 μg/mL東亞鉗蝎毒素可以顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化（P<0.05）。

2.5 乳酸脫氫酶（LDH）釋放率檢測(cè)

由圖5可見， 隨著東亞鉗蝎毒素濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，Caco-2細(xì)胞中LDH的釋放率逐漸增加。

3 討論

3.1 MTT藥敏試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性

本研究使用Caco-2人結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)，這是篩選和研究抗腫瘤藥物常用的重要手段，通常采用定量反應(yīng)亞致死損傷性四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測(cè)細(xì)胞活性。MTT分析法以代謝還原MTT為基礎(chǔ)。MTT是一種能接受含氫原子的染料，可被水溶解和透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。有核活性細(xì)胞，特別是增殖期細(xì)胞，其線粒體內(nèi)存在NADP相關(guān)的脫氫酶（琥珀酸脫氫酶），通過(guò)線粒體的能量代謝能將黃色的MTT還原成不溶的藍(lán)紫色甲臜，沉積在細(xì)胞周圍。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)甲臜結(jié)晶物形成量與活細(xì)胞數(shù)目和功能狀態(tài)呈正相關(guān)。用DMSO將甲臜溶解后，可用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定其吸光度（A值），即可測(cè)出存活細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出細(xì)胞抑制率[17]。

MTT法可進(jìn)行高通量檢測(cè)，并且定量檢測(cè)靈活簡(jiǎn)便，與其他檢測(cè)細(xì)胞活力的方法有良好的相關(guān)性，也常用于新研制抗癌藥物的體外抗癌活動(dòng)及抗癌譜篩選。但它容易受到藥物的影響，由于藥物和MTT溶液會(huì)生成有色復(fù)合物——甲臜，甲臜有時(shí)易聚成團(tuán)干擾對(duì)結(jié)果的測(cè)試，使測(cè)定的A值不能反映實(shí)際的活細(xì)胞數(shù)。

本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，東亞鉗蝎毒素隨著濃度加大和作用時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，即該抑制作用具有濃度和時(shí)間的依賴關(guān)系。

3.2 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法的選擇

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是細(xì)胞免疫試驗(yàn)的一種，又稱T細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。T細(xì)胞在體外經(jīng)某種物質(zhì)刺激，細(xì)胞代謝和形態(tài)相繼發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞表面電荷即起變化，數(shù)小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)酶活化，在24～48 h細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，從而產(chǎn)生一系列增殖變化，如細(xì)胞變大、細(xì)胞漿擴(kuò)大、出現(xiàn)空泡、核仁明顯、染色質(zhì)疏松、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變成母細(xì)胞等[18]。因此，這種淋巴細(xì)胞增殖又稱淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況可反應(yīng)機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低則表示細(xì)胞免疫水平低。當(dāng)T淋巴細(xì)胞受Con A、PHA等致分裂原或特異性抗原刺激后發(fā)生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞通過(guò)線粒體水解將MTT分解為藍(lán)紫色的甲臜結(jié)晶而顯色，其光密度值能夠反映細(xì)胞的增殖情況[19]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，東亞鉗蝎蝎毒能促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。可見促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化是該蝎毒的抗腫瘤機(jī)制之一，同時(shí)也是研發(fā)一種既能殺傷腫瘤細(xì)胞又能促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的新藥物的根據(jù)之一。

3.3 LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生化指標(biāo)的改變

LDH是廣泛存在于細(xì)胞漿內(nèi)的一種生物酶，它在細(xì)胞漿內(nèi)的濃度是細(xì)胞外濃度的約500倍，在正常生理?xiàng)l件下，它不能透過(guò)細(xì)胞膜釋放，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷，即細(xì)胞受到毒性作用時(shí)，它可以進(jìn)入細(xì)胞外液，升高細(xì)胞外LDH濃度。該分析在實(shí)驗(yàn)前不需要標(biāo)記細(xì)胞，不需要處理放射性廢棄物，可揭示早期、低水平的不能被其它方法檢測(cè)到的細(xì)胞膜損壞，所以測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液LDH的釋放率是一個(gè)穩(wěn)定而實(shí)用的指標(biāo)。因此，該法常用于監(jiān)測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用[20]與衡量細(xì)胞的受損程度，也是進(jìn)行藥物篩選的一個(gè)有效方法。

LDH是一種極為穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)酶，在外界刺激下，如果細(xì)胞膜破裂，LDH就會(huì)被釋放。乳酸與氧化型輔酶Ⅰ（NAD）在LDH催化作用下生成丙酮酸和還原型輔酶Ⅰ（NADH），丙酮酸再和2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2，4-二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈棕紅色，釋放出的乳酸脫氫酶存在于培養(yǎng)物上清中，LDH釋放量與裂解細(xì)胞的數(shù)目呈正比，用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀30 min內(nèi)測(cè)量丙酮酸含量推算出LDH活力。

4 結(jié)論

經(jīng)MTT法、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、LDH釋放試驗(yàn)可知，10、20、40 μg/mL東亞鉗蝎毒素對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖都有抑制作用以及良好的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。東亞鉗蝎毒素（20、40 μg/mL）對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)有一定刺激作用，可見該蝎毒的抗腫瘤機(jī)制之一是促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，東亞鉗蝎毒素（10、20、40 μg/mL）對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性作用使細(xì)胞膜受損、LDH釋放率增加，結(jié)果呈濃度和時(shí)間依賴關(guān)系。

總之，研究一種藥物的抗腫瘤機(jī)制，不僅要以該藥對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用為依據(jù)，還需從促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡和引起細(xì)胞周期阻滯等多個(gè)途徑進(jìn)行探究，從而為蝎毒素作為多肽類生化抗腫瘤藥物提供多方面的理論參考。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 王琨， 崔博淼， 李燕， 等. 人體微生物組的腫瘤誘導(dǎo)作用及機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)， 2015， 27（9）： 1155-1159.

[2] 譚莉， 王琳， 巴亞斯古楞， 等. 一種新的腫瘤標(biāo)志物TU M2-PK的研究進(jìn)展[J]. 中外醫(yī)學(xué)研究， 2011， 9（34）： 159-161.

[3] 張?zhí)欤?孫素紅. 調(diào)節(jié)性 B 細(xì)胞在癌癥中的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述， 2015，21（2）：236-238.

[4] 周翠娥. 癌癥的預(yù)防與治療進(jìn)展[J]. 實(shí)用醫(yī)技雜志， 2010， 17（6）： 537-538.

[5] 劉瑩瑩， 鄧皖利， 劉文先， 等. 異常黑膽質(zhì)成熟劑治療腫瘤的研究進(jìn)展[J]. 中華中醫(yī)藥雜志（原中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)）， 2015，30（1）：156-158.

[6] 李建偉， 胡靜， 張桂榮， 等. 東亞鉗蝎蝎毒多肽組分Ⅲ對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2006， 32（4）： 625-629.

[7] 韋曉謀， 韋柳華， 周定球. 蝎毒抗癌多肽對(duì)肝癌細(xì)胞株中癌癥高表達(dá)蛋白 Hec1 的抑制作用[J]. 中藥藥理與臨床 2015，31（2）：154-155.

[8] Hoffman R. Potent inhibition of breast cancer cell lines by the isoflaconoid kievitone：comparison with genistein[J]. Biochem. Biophys. Res. Commun.， 1995， 211（2）： 600-602.

[9] Ooi V， Liu F. Immune modulation and anti-cancer activity of polysaccharide protein complexes[J]. Curr. Med. Chem.， 2000， 7（7）： 715-729.

[10]胡熙明. 中華本草（第一版）[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1998， 699-1148.

[11]Bagdny M，Batista C V，Valdez-Cruz N A，et al. Anuroctoxin， a new scorpion toxin of the alpha-KTx 6 subfamily， is highly selective for Kv1.3 over IKCa1 ion channels of human T lymphocytes[J]. Mol. Phamacol.， 2005， 67（4）：1034-1044.

[12]趙燦國(guó)， 董偉華， 孔天翰. 蝎毒及其分離組分對(duì)4種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用[J]. 廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2006， 34（1）： 26-29.

[13]王燕， 張維東， 賈青， 等. 蝎毒多肽提取物對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲力影響的體外研究[J]. 中華腫瘤防治雜志， 2008， 15（14）： 1045-1048.

[14]孔天翰， 林山， 韓雪飛， 等. 蝎毒多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志， 2004， 20（6）： 968-972.

[15]Liu Y F， Ma R L， Wang S L， et al. Expression of an antitumor-analgesic peptide from the venom of Chinese scorpion Buthus martensii Karsch in Escherichia coli[J]. Protein Expr. Purif.， 2003， 27（2）： 253-258.

[16]馬培奇. 全球抗腫瘤藥物市場(chǎng)發(fā)展動(dòng)態(tài)[J]. 藥學(xué)進(jìn)展， 2006， 30（3）： 141-144.

[17]Abe R，Ueo H，Akiyoshi T. Evaluation of MTT assay in agarose for cemosensitivity testing of human cancers： comparison with MTT assay[J]. Oncology， 1994， 51（5）： 416-425.

[18]李儀奎. 中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 上海： 上?？萍技夹g(shù)出版社， 1985：197-202.

[19]司徒鎮(zhèn)強(qiáng)， 吳軍正. 細(xì)胞培養(yǎng)[M]. 西安： 世界圖書出版公司， 2004： 25-43， 44-57， 84-89， 251-291.

[20]洪慶濤， 宋岳濤， 唐一鵬， 等. 細(xì)胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶漏出率的比色測(cè)定及其應(yīng)用[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志， 2004， 26（1）： 89-92.