蘇姜豬RPL10a假基因第2外顯子多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性

張偉++陳章言++王利紅+++仝蒙

摘要：為深入探討豬核糖體蛋白L10a假基因（RPL10a pseudogene）的多態(tài)性及其與產(chǎn)仔數(shù)性狀間的相關(guān)性，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）檢測方法，分析蘇姜豬RPL10a假基因第2個(gè)外顯子區(qū)的多態(tài)性。檢測結(jié)果顯示：引物P1擴(kuò)增區(qū)存在AA和AB等2種基因型，引物P4擴(kuò)增區(qū)存在4種SSCP型；經(jīng)核酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，在27 389 415、27 389 835、27 389 946位分別存在C→G、G→A、A→G的突變，27 389 851位為堿基A的插入突變。經(jīng)群體遺傳學(xué)分析，各基因分布符合哈迪-溫伯格定律，處于群體平衡狀態(tài)。將各基因型與蘇姜豬5個(gè)胎次的平均產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，RPL10a假基因引物P1和P4各擴(kuò)增區(qū)不同SSCP類型與蘇姜豬平均產(chǎn)仔數(shù)性狀間無顯著差異（P>0.05）。將2個(gè)擴(kuò)增區(qū)不同SSCP型綜合分析，結(jié)果顯示，同時(shí)存在AB型與SSCP-1型蘇姜豬的第1胎平均產(chǎn)仔數(shù)顯著高于同時(shí)具有AA型與SSCP-1、SSCP-2型的蘇姜豬（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：蘇姜豬；RPL10a假基因；PCR-SSCP；產(chǎn)仔數(shù)

中圖分類號(hào)：S828.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0062-04

收稿日期：2016-02-23

基金項(xiàng)目：江蘇省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：BE2014381）；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院院級(jí)課題（編號(hào)：NSFPT201505）。

作者簡介：張偉（1973—），男，高級(jí)畜牧師，主要從事動(dòng)物遺傳繁育研究。E-mail：hdjgzhangwei001@163.com。核糖體是所有生物細(xì)胞中合成蛋白質(zhì)的重要細(xì)胞器，由蛋白質(zhì)和RNA組成。真核生物的核糖體約有80種核糖體蛋白亞基[1]，分為大亞基和小亞基。大亞基（60S）核糖體蛋白命名為L1-L44，小亞基（40S）核糖體蛋白命名為S1-S31[2-3]。核糖體蛋白L10a（ribosomal protein L10a，RPL10a）即屬于核糖體60S大亞基的蛋白[4]。核糖體蛋白的功能較多，不僅在蛋白質(zhì)的合成中發(fā)揮作用，還參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復(fù)等過程，在細(xì)胞增殖、凋亡、發(fā)育的多種調(diào)控和惡性轉(zhuǎn)化等方面也發(fā)揮著重要作用[2]。隨著生物基因組研究的不斷深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種生物存在假基因，即所謂的“垃圾”DNA，其中包括很多看家基因，如肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、金屬硫蛋白、免疫球蛋白、核糖體等。這些假基因可通過DNA調(diào)控或RNA調(diào)控方式，調(diào)節(jié)同源功能基因的表達(dá)、蛋白翻譯、基因沉默等[5]。目前，對(duì)假基因的檢測分析已成為生物進(jìn)化及基因調(diào)控研究的新熱點(diǎn)。本研究首次檢測分析位于10號(hào)染色體的豬RPL10a假基因第2外顯子的多態(tài)性，并分析其與產(chǎn)仔數(shù)生產(chǎn)性狀間的相關(guān)性，為深入探討豬RPL10a假基因的功能、擴(kuò)展豬分子輔助選育研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

隨機(jī)選取50頭蘇姜豬母豬，剪取耳組織，采用酚-三氯甲烷抽提法提取組織中的DNA，用超純水稀釋至100 ng/μL，于 -20 ℃ 下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中豬RPL10a假基因NC_010452.3第2個(gè)Exon的核酸信息，采用Primer premiers 5.0軟件設(shè)計(jì)4對(duì)引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3PCR-SSCP分析

樣本DNA擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54～56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增后，將產(chǎn)物進(jìn)行變性處理，采用12%非變性聚丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺（29 ∶1）凝膠電泳 8～12 h，銀染顯帶并拍照分析，將不同基因型PCR產(chǎn)物送至上?；瞪锛夹g(shù)有限公司測序。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析。

2結(jié)果與分析

2.1RPL10a假基因第2外顯子與RPL10a功能基因序列相似度分析

采用GenBank網(wǎng)站的BLAST軟件比對(duì)分析RPL10a假基因第2外顯子與RPL10a功能基因核酸序列（表2）。結(jié)果顯示，RPL10a假基因有5處核酸序列區(qū)段與功能基因的5個(gè)外顯子相似（RPL10a基因有6個(gè)外顯子），且相似度較高，表明RPL10a假基因第2外顯子區(qū)可作為分析假基因調(diào)控功能基因表達(dá)的主要區(qū)段。

2.2引物P1～P4 PCR擴(kuò)增結(jié)果

將RPL10a假基因4對(duì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（圖1）檢測，電泳條帶清晰，表明引物P1～P4 PCR擴(kuò)增特異性好。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST分析，結(jié)果顯示，所擴(kuò)增序列與豬（Sus scrofa）RPL10a假基因第2個(gè)外顯子序列有高度相似性，分別為98%、99%、99%、98%，表明本試驗(yàn)擴(kuò)增的核酸序列位于所檢測基因區(qū)。

2.3PCR-SSCP分析結(jié)果

將RPL10a假基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析，結(jié)果顯示，引物P1擴(kuò)增產(chǎn)物存在2種SSCP條帶類型，分別為AA型和AB型（圖2）；引物P2、P3擴(kuò)增產(chǎn)物不存在單鏈構(gòu)象多態(tài)性（圖3）；引物P4擴(kuò)增產(chǎn)物存在4種SSCP條帶類型（圖4）。

2.4引物P1、P4擴(kuò)增產(chǎn)物不同基因型序列分析

引物P1的不同PCR-SSCP樣本經(jīng)核酸序列測定并與NC_010452.3比對(duì)分析，結(jié)果顯示，在27 389 415位存在 C→G 的突變（圖5）。

將引物P4的不同PCR-SSCP樣本經(jīng)核酸序列測定并與NC_010452.3比對(duì)分析，結(jié)果顯示，在27 389 835、27 389 946位分別存在G→A、A→G的突變，27 389 851位存在堿基A的插入（圖6）。

2.5蘇姜豬RPL10a假基因群體遺傳分析

蘇姜豬RPL10a假基因引物P1、P4擴(kuò)增區(qū)不同SSCP型頻率以及基因頻率見表3、表4。由表3可知，引物P4擴(kuò)增區(qū)SSCP-1型所占比例最高，為50%，SSCP-4個(gè)體數(shù)最少，僅占6%；由表4可知，27 389 415、27 389 835、27 389 946堿基突變位點(diǎn)均為野生純合型高于雜合型，但均未在蘇姜豬群體中檢測到突變純合型。根據(jù)哈迪-溫伯格定律，經(jīng)卡方檢驗(yàn)各基因群體平衡性（表5），結(jié)果表明，2對(duì)引物擴(kuò)增區(qū)在 27 389 415、27 389 835、27 389 946位點(diǎn)的堿基突變均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著級(jí)別（P>0.05），表明各基因分布符合哈迪-溫伯格定律，處于群體平衡狀態(tài)。

2.6蘇姜豬RPL10a假基因不同SSCP型與產(chǎn)仔數(shù)間的相關(guān)性分析

對(duì)有產(chǎn)仔數(shù)生產(chǎn)記錄的蘇姜豬進(jìn)行5個(gè)胎次的平均產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表6、表7）表明，RPL10a假基因引物P1、P4擴(kuò)增區(qū)不同SSCP類型的平均產(chǎn)仔數(shù)性狀間無顯著差異（P>0.05）。綜合分析引物P1、P4擴(kuò)增區(qū)不同SSCP類型，結(jié)果（表8）表明，同時(shí)存在AB型與SSCP-1型的蘇姜豬第1胎平均產(chǎn)仔數(shù)顯著高于同時(shí)具有AA型與SSCP-1、SSCP-2型的蘇姜豬（P<0.05），其他類型的各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)無顯著差異（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

隨著現(xiàn)代生物科技的快速發(fā)展，現(xiàn)已通過基因組測序和轉(zhuǎn)錄過程中mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA的方式重新整合進(jìn)入基因組，在生物長期進(jìn)化選擇過程中由于隨機(jī)突變積累而喪失功能[5]。本研究通過PCR-SSCP 方法檢測到

引物擴(kuò)增區(qū)突變位點(diǎn)（位）χ2值P127 389 4152.75P427 389 8350.2027 389 9465.56注：“*”表示在0.05水平下差異顯著，未標(biāo)注者為差異不顯著（P>0.05）；χ2（2，0.05）=5.99。

基因克隆鑒定技術(shù)發(fā)現(xiàn)生物體基因組中存在大量的假基因，如人類基因組中約97%為非表達(dá)序列，即所謂的“垃圾”DNA[5]。假基因的產(chǎn)生主要有2種類型，一種是正?；虻膹?fù)制或基因之間的不平衡交換，產(chǎn)生點(diǎn)突變、插入、缺失、移碼突變等，導(dǎo)致復(fù)制后的基因無法進(jìn)行正常編碼；另一種類型是蘇姜豬群體中RPL10a假基因第2個(gè)外顯子區(qū)存在多態(tài)性，經(jīng)序列比對(duì)，在27 389 415、27 389 835、27 389 946位點(diǎn)存在C→G、G→A、A→G堿基突變，在27 389 851位點(diǎn)檢測到堿基表6引物P1不同PCR-SSCP類型蘇姜豬各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)

SSCP類型各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)（頭）第1胎第2胎第3胎第4胎第5胎AA9.47±2.91（30）11.21±2.92（28）9.94±1.98（17）11.29±2.31（17）11.69±2.72（13）AB11.61±2.71（18）11.22±2.37（18）10.71±2.46（14）11.00±2.31（13）11.64±2.37（14）注：同一胎次不同SSCP類型間，數(shù)據(jù)后未標(biāo)字母和字母相同者表示在0.05水平下差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，字母不同者表示在0.05水平下差異顯著。下表同。

A的插入突變，表明豬RPL10a假基因的產(chǎn)生符合假基因產(chǎn)生的第1種類型。通過群體遺傳學(xué)分析突變位點(diǎn)各基因頻率的平衡性，發(fā)現(xiàn)各基因頻率均符合哈迪-溫伯格定律，表明這些基因在蘇姜豬群體中已處于群體平衡狀態(tài)。

2003年，日本研究小組發(fā)現(xiàn)第1個(gè)有功能的假基因，并培育出插入makorin1基因的變異體，即makorin1-p1的假基因（致死基因）小鼠；該假基因不編碼蛋白質(zhì)，但當(dāng)其損壞后對(duì)應(yīng)的真基因也不工作，最終導(dǎo)致小鼠死亡[6]，表明假基因表7引物P4不同PCR-SSCP類型蘇姜豬各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)

表8同。

在生物體內(nèi)具有重要的調(diào)控機(jī)能。此后，有關(guān)假基因的研究報(bào)道進(jìn)一步證實(shí)，假基因的作用具有序列專一性，只影響與基因本身相似的序列，通過DNA和RNA指導(dǎo)調(diào)控功能基因的表達(dá)，參與基因沉默、催化、發(fā)育調(diào)控等[5]。RPL10a基因表達(dá)核糖體60S大亞基上的蛋白，不僅在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用，還參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化等。已有研究報(bào)道，RPL10a蛋白基因突變與自閉癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[7-8]。豬RPL10a基因位于第10號(hào)染色體，有6個(gè)外顯子，而RPL10a假基因位于第7號(hào)染色體，有2個(gè)外顯子。通過比對(duì)功能基因和假基因第2外顯子核酸序列，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)相似區(qū)均位于功能基因的外顯子區(qū)，表明RPL10a假基因可能參與功能基因的表達(dá)調(diào)控過程。本研究檢測出的蘇姜豬RPL10a假基因27 389 415、27 389 835位點(diǎn)的突變，對(duì)應(yīng)于功能基因第1、第4外顯子區(qū)內(nèi)，但在蘇姜豬群體中均未檢測到突變純合型，表明RPL10a假基因上述突變位點(diǎn)的突變純合型可能會(huì)影響功能基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致個(gè)體生理功能異常，使胚胎早期死亡。27 389 946、27 389 851位點(diǎn)均不對(duì)應(yīng)于功能基因的外顯子區(qū)，雖然27 389 851位點(diǎn)為堿基插入突變，可能不會(huì)影響功能基因的表達(dá)，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制有待后續(xù)研究。

為深入研究假基因的功能，近年來，通過SSCP方法開展假基因多態(tài)性與生物性狀間相關(guān)性的研究也逐步增加，如楊愛初等對(duì)多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶假基因多態(tài)性與苯中毒的相關(guān)性進(jìn)行了研究[9]，以及唐錄英等對(duì)聚腺苷二磷酸核糖聚合酶假基因多態(tài)性分布及其與肺癌易感性關(guān)系進(jìn)行了研究等[10]。本研究將PCR-SSCP方法檢測獲得的蘇姜豬RPL10a假基因第2外顯子區(qū)多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)生產(chǎn)性狀進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示，不同SSCP型同一胎次平均產(chǎn)仔數(shù)間差異不顯著（P>0.05）。以蘇姜豬個(gè)體為對(duì)象，將引物P1和P2不同SSCP多態(tài)性進(jìn)行綜合分析，在檢測出的6頭 SSCP-3型蘇姜豬個(gè)體中無一兼具AA型，表明27 389 415位點(diǎn)的堿基突變與其他3個(gè)突變位點(diǎn)間可能存在一定影響，特別是27 389 835位點(diǎn)的突變影響可能較大；27 389 415、27 389 835 位點(diǎn)均對(duì)應(yīng)于功能基因第1、第4外顯子區(qū)內(nèi)，表明與RPL10a功能基因外顯子區(qū)相對(duì)應(yīng)的假基因核酸序列上的堿基突變，對(duì)功能基因的表達(dá)可能存在影響。對(duì)各類型蘇姜豬同一胎次平均產(chǎn)仔數(shù)間的差異顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，兼有AB型與SSCP-1型的蘇姜豬第1胎平均產(chǎn)仔數(shù)[（12.30±1.70）頭]顯著高于兼有AA型與SSCP-1[（9.62±2.14）頭]、SSCP-2型[（9.33±3.68）頭]的蘇姜豬（P<0.05），其他類型的各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)間差異不顯著（P>0.05）?？梢?，27 389 415位點(diǎn)堿基突變可能與其他位點(diǎn)的堿基變化具有協(xié)同作用，共同影響蘇姜豬產(chǎn)仔數(shù)性狀，但RPL10a假基因影響功能基因表達(dá)進(jìn)而影響豬繁殖力性狀的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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