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      蘇姜豬RPL10a假基因第2外顯子多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性

      2017-02-05 01:39:05張偉陳章言王利紅仝蒙
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期
      關(guān)鍵詞:產(chǎn)仔數(shù)

      張偉++陳章言++王利紅+++仝蒙

      摘要:為深入探討豬核糖體蛋白L10a假基因(RPL10a pseudogene)的多態(tài)性及其與產(chǎn)仔數(shù)性狀間的相關(guān)性,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)檢測方法,分析蘇姜豬RPL10a假基因第2個(gè)外顯子區(qū)的多態(tài)性。檢測結(jié)果顯示:引物P1擴(kuò)增區(qū)存在AA和AB等2種基因型,引物P4擴(kuò)增區(qū)存在4種SSCP型;經(jīng)核酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),在27 389 415、27 389 835、27 389 946位分別存在C→G、G→A、A→G的突變,27 389 851位為堿基A的插入突變。經(jīng)群體遺傳學(xué)分析,各基因分布符合哈迪-溫伯格定律,處于群體平衡狀態(tài)。將各基因型與蘇姜豬5個(gè)胎次的平均產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果表明,RPL10a假基因引物P1和P4各擴(kuò)增區(qū)不同SSCP類型與蘇姜豬平均產(chǎn)仔數(shù)性狀間無顯著差異(P>0.05)。將2個(gè)擴(kuò)增區(qū)不同SSCP型綜合分析,結(jié)果顯示,同時(shí)存在AB型與SSCP-1型蘇姜豬的第1胎平均產(chǎn)仔數(shù)顯著高于同時(shí)具有AA型與SSCP-1、SSCP-2型的蘇姜豬(P<0.05)。

      關(guān)鍵詞:蘇姜豬;RPL10a假基因;PCR-SSCP;產(chǎn)仔數(shù)

      中圖分類號(hào):S828.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2016)10-0062-04

      收稿日期:2016-02-23

      基金項(xiàng)目:江蘇省科技支撐計(jì)劃(編號(hào):BE2014381);江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院院級(jí)課題(編號(hào):NSFPT201505)。

      作者簡介:張偉(1973—),男,高級(jí)畜牧師,主要從事動(dòng)物遺傳繁育研究。E-mail:hdjgzhangwei001@163.com。核糖體是所有生物細(xì)胞中合成蛋白質(zhì)的重要細(xì)胞器,由蛋白質(zhì)和RNA組成。真核生物的核糖體約有80種核糖體蛋白亞基[1],分為大亞基和小亞基。大亞基(60S)核糖體蛋白命名為L1-L44,小亞基(40S)核糖體蛋白命名為S1-S31[2-3]。核糖體蛋白L10a(ribosomal protein L10a,RPL10a)即屬于核糖體60S大亞基的蛋白[4]。核糖體蛋白的功能較多,不僅在蛋白質(zhì)的合成中發(fā)揮作用,還參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復(fù)等過程,在細(xì)胞增殖、凋亡、發(fā)育的多種調(diào)控和惡性轉(zhuǎn)化等方面也發(fā)揮著重要作用[2]。隨著生物基因組研究的不斷深入,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種生物存在假基因,即所謂的“垃圾”DNA,其中包括很多看家基因,如肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、金屬硫蛋白、免疫球蛋白、核糖體等。這些假基因可通過DNA調(diào)控或RNA調(diào)控方式,調(diào)節(jié)同源功能基因的表達(dá)、蛋白翻譯、基因沉默等[5]。目前,對(duì)假基因的檢測分析已成為生物進(jìn)化及基因調(diào)控研究的新熱點(diǎn)。本研究首次檢測分析位于10號(hào)染色體的豬RPL10a假基因第2外顯子的多態(tài)性,并分析其與產(chǎn)仔數(shù)生產(chǎn)性狀間的相關(guān)性,為深入探討豬RPL10a假基因的功能、擴(kuò)展豬分子輔助選育研究提供依據(jù)。

      1材料與方法

      1.1試驗(yàn)材料

      隨機(jī)選取50頭蘇姜豬母豬,剪取耳組織,采用酚-三氯甲烷抽提法提取組織中的DNA,用超純水稀釋至100 ng/μL,于 -20 ℃ 下保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

      根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中豬RPL10a假基因NC_010452.3第2個(gè)Exon的核酸信息,采用Primer premiers 5.0軟件設(shè)計(jì)4對(duì)引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

      1.3PCR-SSCP分析

      樣本DNA擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,54~56 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min,4 ℃保存。PCR擴(kuò)增后,將產(chǎn)物進(jìn)行變性處理,采用12%非變性聚丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺(29 ∶1)凝膠電泳 8~12 h,銀染顯帶并拍照分析,將不同基因型PCR產(chǎn)物送至上?;瞪锛夹g(shù)有限公司測序。

      1.4統(tǒng)計(jì)分析

      采用SPSS 13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析。

      2結(jié)果與分析

      2.1RPL10a假基因第2外顯子與RPL10a功能基因序列相似度分析

      采用GenBank網(wǎng)站的BLAST軟件比對(duì)分析RPL10a假基因第2外顯子與RPL10a功能基因核酸序列(表2)。結(jié)果顯示,RPL10a假基因有5處核酸序列區(qū)段與功能基因的5個(gè)外顯子相似(RPL10a基因有6個(gè)外顯子),且相似度較高,表明RPL10a假基因第2外顯子區(qū)可作為分析假基因調(diào)控功能基因表達(dá)的主要區(qū)段。

      2.2引物P1~P4 PCR擴(kuò)增結(jié)果

      將RPL10a假基因4對(duì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(圖1)檢測,電泳條帶清晰,表明引物P1~P4 PCR擴(kuò)增特異性好。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后,進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST分析,結(jié)果顯示,所擴(kuò)增序列與豬(Sus scrofa)RPL10a假基因第2個(gè)外顯子序列有高度相似性,分別為98%、99%、99%、98%,表明本試驗(yàn)擴(kuò)增的核酸序列位于所檢測基因區(qū)。

      2.3PCR-SSCP分析結(jié)果

      將RPL10a假基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析,結(jié)果顯示,引物P1擴(kuò)增產(chǎn)物存在2種SSCP條帶類型,分別為AA型和AB型(圖2);引物P2、P3擴(kuò)增產(chǎn)物不存在單鏈構(gòu)象多態(tài)性(圖3);引物P4擴(kuò)增產(chǎn)物存在4種SSCP條帶類型(圖4)。

      2.4引物P1、P4擴(kuò)增產(chǎn)物不同基因型序列分析

      引物P1的不同PCR-SSCP樣本經(jīng)核酸序列測定并與NC_010452.3比對(duì)分析,結(jié)果顯示,在27 389 415位存在 C→G 的突變(圖5)。

      將引物P4的不同PCR-SSCP樣本經(jīng)核酸序列測定并與NC_010452.3比對(duì)分析,結(jié)果顯示,在27 389 835、27 389 946位分別存在G→A、A→G的突變,27 389 851位存在堿基A的插入(圖6)。

      2.5蘇姜豬RPL10a假基因群體遺傳分析

      蘇姜豬RPL10a假基因引物P1、P4擴(kuò)增區(qū)不同SSCP型頻率以及基因頻率見表3、表4。由表3可知,引物P4擴(kuò)增區(qū)SSCP-1型所占比例最高,為50%,SSCP-4個(gè)體數(shù)最少,僅占6%;由表4可知,27 389 415、27 389 835、27 389 946堿基突變位點(diǎn)均為野生純合型高于雜合型,但均未在蘇姜豬群體中檢測到突變純合型。根據(jù)哈迪-溫伯格定律,經(jīng)卡方檢驗(yàn)各基因群體平衡性(表5),結(jié)果表明,2對(duì)引物擴(kuò)增區(qū)在 27 389 415、27 389 835、27 389 946位點(diǎn)的堿基突變均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著級(jí)別(P>0.05),表明各基因分布符合哈迪-溫伯格定律,處于群體平衡狀態(tài)。

      2.6蘇姜豬RPL10a假基因不同SSCP型與產(chǎn)仔數(shù)間的相關(guān)性分析

      對(duì)有產(chǎn)仔數(shù)生產(chǎn)記錄的蘇姜豬進(jìn)行5個(gè)胎次的平均產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果(表6、表7)表明,RPL10a假基因引物P1、P4擴(kuò)增區(qū)不同SSCP類型的平均產(chǎn)仔數(shù)性狀間無顯著差異(P>0.05)。綜合分析引物P1、P4擴(kuò)增區(qū)不同SSCP類型,結(jié)果(表8)表明,同時(shí)存在AB型與SSCP-1型的蘇姜豬第1胎平均產(chǎn)仔數(shù)顯著高于同時(shí)具有AA型與SSCP-1、SSCP-2型的蘇姜豬(P<0.05),其他類型的各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

      3結(jié)論與討論

      隨著現(xiàn)代生物科技的快速發(fā)展,現(xiàn)已通過基因組測序和轉(zhuǎn)錄過程中mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后以cDNA的方式重新整合進(jìn)入基因組,在生物長期進(jìn)化選擇過程中由于隨機(jī)突變積累而喪失功能[5]。本研究通過PCR-SSCP 方法檢測到

      引物擴(kuò)增區(qū)突變位點(diǎn)(位)χ2值P127 389 4152.75P427 389 8350.2027 389 9465.56注:“*”表示在0.05水平下差異顯著,未標(biāo)注者為差異不顯著(P>0.05);χ2(2,0.05)=5.99。

      基因克隆鑒定技術(shù)發(fā)現(xiàn)生物體基因組中存在大量的假基因,如人類基因組中約97%為非表達(dá)序列,即所謂的“垃圾”DNA[5]。假基因的產(chǎn)生主要有2種類型,一種是正?;虻膹?fù)制或基因之間的不平衡交換,產(chǎn)生點(diǎn)突變、插入、缺失、移碼突變等,導(dǎo)致復(fù)制后的基因無法進(jìn)行正常編碼;另一種類型是蘇姜豬群體中RPL10a假基因第2個(gè)外顯子區(qū)存在多態(tài)性,經(jīng)序列比對(duì),在27 389 415、27 389 835、27 389 946位點(diǎn)存在C→G、G→A、A→G堿基突變,在27 389 851位點(diǎn)檢測到堿基表6引物P1不同PCR-SSCP類型蘇姜豬各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)

      SSCP類型各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)(頭)第1胎第2胎第3胎第4胎第5胎AA9.47±2.91(30)11.21±2.92(28)9.94±1.98(17)11.29±2.31(17)11.69±2.72(13)AB11.61±2.71(18)11.22±2.37(18)10.71±2.46(14)11.00±2.31(13)11.64±2.37(14)注:同一胎次不同SSCP類型間,數(shù)據(jù)后未標(biāo)字母和字母相同者表示在0.05水平下差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,字母不同者表示在0.05水平下差異顯著。下表同。

      A的插入突變,表明豬RPL10a假基因的產(chǎn)生符合假基因產(chǎn)生的第1種類型。通過群體遺傳學(xué)分析突變位點(diǎn)各基因頻率的平衡性,發(fā)現(xiàn)各基因頻率均符合哈迪-溫伯格定律,表明這些基因在蘇姜豬群體中已處于群體平衡狀態(tài)。

      2003年,日本研究小組發(fā)現(xiàn)第1個(gè)有功能的假基因,并培育出插入makorin1基因的變異體,即makorin1-p1的假基因(致死基因)小鼠;該假基因不編碼蛋白質(zhì),但當(dāng)其損壞后對(duì)應(yīng)的真基因也不工作,最終導(dǎo)致小鼠死亡[6],表明假基因表7引物P4不同PCR-SSCP類型蘇姜豬各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)

      表8同。

      在生物體內(nèi)具有重要的調(diào)控機(jī)能。此后,有關(guān)假基因的研究報(bào)道進(jìn)一步證實(shí),假基因的作用具有序列專一性,只影響與基因本身相似的序列,通過DNA和RNA指導(dǎo)調(diào)控功能基因的表達(dá),參與基因沉默、催化、發(fā)育調(diào)控等[5]。RPL10a基因表達(dá)核糖體60S大亞基上的蛋白,不僅在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用,還參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯,調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化等。已有研究報(bào)道,RPL10a蛋白基因突變與自閉癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[7-8]。豬RPL10a基因位于第10號(hào)染色體,有6個(gè)外顯子,而RPL10a假基因位于第7號(hào)染色體,有2個(gè)外顯子。通過比對(duì)功能基因和假基因第2外顯子核酸序列,發(fā)現(xiàn)有5個(gè)相似區(qū)均位于功能基因的外顯子區(qū),表明RPL10a假基因可能參與功能基因的表達(dá)調(diào)控過程。本研究檢測出的蘇姜豬RPL10a假基因27 389 415、27 389 835位點(diǎn)的突變,對(duì)應(yīng)于功能基因第1、第4外顯子區(qū)內(nèi),但在蘇姜豬群體中均未檢測到突變純合型,表明RPL10a假基因上述突變位點(diǎn)的突變純合型可能會(huì)影響功能基因的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致個(gè)體生理功能異常,使胚胎早期死亡。27 389 946、27 389 851位點(diǎn)均不對(duì)應(yīng)于功能基因的外顯子區(qū),雖然27 389 851位點(diǎn)為堿基插入突變,可能不會(huì)影響功能基因的表達(dá),但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制有待后續(xù)研究。

      為深入研究假基因的功能,近年來,通過SSCP方法開展假基因多態(tài)性與生物性狀間相關(guān)性的研究也逐步增加,如楊愛初等對(duì)多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶假基因多態(tài)性與苯中毒的相關(guān)性進(jìn)行了研究[9],以及唐錄英等對(duì)聚腺苷二磷酸核糖聚合酶假基因多態(tài)性分布及其與肺癌易感性關(guān)系進(jìn)行了研究等[10]。本研究將PCR-SSCP方法檢測獲得的蘇姜豬RPL10a假基因第2外顯子區(qū)多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)生產(chǎn)性狀進(jìn)行相關(guān)分析,結(jié)果顯示,不同SSCP型同一胎次平均產(chǎn)仔數(shù)間差異不顯著(P>0.05)。以蘇姜豬個(gè)體為對(duì)象,將引物P1和P2不同SSCP多態(tài)性進(jìn)行綜合分析,在檢測出的6頭 SSCP-3型蘇姜豬個(gè)體中無一兼具AA型,表明27 389 415位點(diǎn)的堿基突變與其他3個(gè)突變位點(diǎn)間可能存在一定影響,特別是27 389 835位點(diǎn)的突變影響可能較大;27 389 415、27 389 835 位點(diǎn)均對(duì)應(yīng)于功能基因第1、第4外顯子區(qū)內(nèi),表明與RPL10a功能基因外顯子區(qū)相對(duì)應(yīng)的假基因核酸序列上的堿基突變,對(duì)功能基因的表達(dá)可能存在影響。對(duì)各類型蘇姜豬同一胎次平均產(chǎn)仔數(shù)間的差異顯著性進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果表明,兼有AB型與SSCP-1型的蘇姜豬第1胎平均產(chǎn)仔數(shù)[(12.30±1.70)頭]顯著高于兼有AA型與SSCP-1[(9.62±2.14)頭]、SSCP-2型[(9.33±3.68)頭]的蘇姜豬(P<0.05),其他類型的各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)間差異不顯著(P>0.05)??梢?,27 389 415位點(diǎn)堿基突變可能與其他位點(diǎn)的堿基變化具有協(xié)同作用,共同影響蘇姜豬產(chǎn)仔數(shù)性狀,但RPL10a假基因影響功能基因表達(dá)進(jìn)而影響豬繁殖力性狀的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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