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      山羊miR—27a靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析

      2017-02-05 19:59:20陶虎索效軍李曉峰熊琪張年
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期
      關(guān)鍵詞:前體山羊調(diào)控

      陶虎++索效軍++李曉峰++熊琪++張年++楊前平++劉洋++陳明新

      doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.016

      摘要:繁殖力是決定羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)效益最重要的因素,卵泡的生長發(fā)育決定了排卵數(shù),進(jìn)而直接影響母羊的繁殖力。miRNA是由內(nèi)源性基因編碼的單鏈非編碼RNA,參與靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。本研究通過對山羊miR-27a的靶基因進(jìn)行預(yù)測及功能分析,為進(jìn)一步研究其在山羊繁殖功能中的作用提供新途徑。利用靶基因預(yù)測軟件分析miR-27a的靶基因,將靶基因進(jìn)行GO富集分析及KEGG信號通路分析。結(jié)果表明,預(yù)測靶基因集合分別富集在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、調(diào)控RNA代謝、正調(diào)控信號傳導(dǎo)等分子功能上以及ErbB、MAPK、mTOR等信號通路中。

      關(guān)鍵詞:山羊;miR-27a;靶基因;信號通路;GO分析

      中圖分類號: S827.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2016)10-0073-03

      收稿日期:2016-04-08

      基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(編號:31501932);湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科學(xué)基金(編號:2015NKYJJ14);湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競爭性計(jì)劃(編號:2016jzxjh030)。

      作者簡介:陶虎(1986—),男,安徽合肥人,博士,助理研究員,主要從事草食家畜分子育種研究。Tel:(027)87380139;E-mail:taohu1986@hotmail.com。

      通信作者:陳明新,研究員,主要從事草食家畜育種研究。E-mail:316824556@qq.com。我國是養(yǎng)羊大國,羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在畜牧業(yè)中占有重要地位。繁殖和生長是決定規(guī)模化養(yǎng)殖產(chǎn)出的兩大主要經(jīng)濟(jì)性狀。在山羊中,母羊繁殖效益在總效益中占據(jù)較大比例,因此繁殖力是決定羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)效益最重要的因素之一。排卵率是產(chǎn)仔數(shù)性狀的重要組分性狀,卵巢中卵泡的生長發(fā)育決定了排卵數(shù)[1]。探索卵巢中的基因表達(dá)情況、發(fā)育規(guī)律、調(diào)控因素,對于揭示排卵率的遺傳調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

      microRNA(miRNA)是由內(nèi)源性基因編碼的單鏈非編碼RNA,長度一般為21~25個核苷酸(nucleotide,nt),通過與靶基因mRNA的3′-UTR互補(bǔ)配對來調(diào)控其轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平[2]。已有研究表明,miR-21、miR-212、miR-132在小鼠顆粒細(xì)胞中呈顯著的上調(diào)表達(dá),且當(dāng)miR-21表達(dá)量降低時會導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡[3]。在小鼠顆粒細(xì)胞中篩選出多個受TGF-β1信號調(diào)控的miRNA,其中miR-224可靶向作用于Smad4基因來調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖[4]。前體miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)經(jīng)Dicer加工形成成熟的miRNA[5]。Dicer1-/-雌鼠的卵母細(xì)胞中紡錘體發(fā)生異常,導(dǎo)致其不能完成第1次減數(shù)分裂[6-7]。對于顆粒細(xì)胞而言,miRNA是一類發(fā)揮重要調(diào)控作用的小分子調(diào)控物。miR-27a是miR-27家族的重要成員,該家族是 miRNA 中功能較為明顯的家族之一。眾多研究表明,miR-27a在疾病尤其在腫瘤中發(fā)揮重要作用,而在生殖領(lǐng)域鮮見報道。研究miR-27a及其靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控,對進(jìn)一步揭示miRNA對山羊母性繁殖的調(diào)控作用具有重要意義。

      1材料與方法

      1.1獲取miRNA

      從miRNA信息公共數(shù)據(jù)庫miRBase(http://www.mirbase.org/)中獲取不同物種的miR-27a前體序列和成熟序列。

      1.2同源性比對

      利用miR-27a的前體序列,比較前體序列在不同物種間的保守程度。利用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對,運(yùn)用Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)軟件制作不同物種間miR-27a前體序列的進(jìn)化樹。

      1.3靶基因預(yù)測

      分別利用miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)、miRDB(http://mirdb.org/miRDB/index.html)、TargetScan(http://www.targetscan.org/)等靶位點(diǎn)分析軟件分析miR-27a的靶基因和靶位點(diǎn)的保守性。將結(jié)果的交集作為進(jìn)一步研究的基因集合,篩選3個軟件均能預(yù)測到且在4種物種中均保守的靶基因作為候選靶基因。通過分析靶基因的功能進(jìn)一步分析miR-27a的生物學(xué)功能。

      1.4靶基因的分析

      利用Gene Ontology(http://geneontology.org/)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)數(shù)據(jù)庫對預(yù)測得到的miR-27a靶基因進(jìn)行功能富集分析,利用KEGG(http://www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號通路分析,預(yù)測結(jié)果在GO類別上的高頻率注釋以及有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號調(diào)控通路。

      2結(jié)果與分析

      2.1miR-27a序列的獲得和同源性比對

      利用miRBase數(shù)據(jù)庫檢索到miR-27a的成熟序列,利用Clustal X在線軟件進(jìn)行序列比對,發(fā)現(xiàn)該序列在人、小鼠、大鼠、豬、馬中完全一致,在牛、山羊、狗中只相差最后1個堿基,因此miR-27a的成熟序列具有很高的保守性(圖1)。利用Clustal Omega軟件分析上述物種的miR-27a前體序列,構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn),小鼠、大鼠、豬的miR-27a前體序列比較接近,牛與山羊的比較接近(圖2)。

      2.2miR-27a靶基因預(yù)測

      利用miRNA靶基因預(yù)測軟件miRanda、miRDB、TargetScan(表1)進(jìn)行靶基因聯(lián)合預(yù)測,分別得到miR-27a靶基因?yàn)? 902、697、786個。篩選3種軟件預(yù)測結(jié)果的交集(共390個),作為進(jìn)一步分析的基因集合(圖3)。

      3結(jié)論與討論

      miRNA是一種非編碼的小RNA,通過與靶基因3′-UTR特異性結(jié)合,從而抑制轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá),在調(diào)控細(xì)胞周期、基因表達(dá)、生殖發(fā)育等過程中具有重要作用[8]。miRBase數(shù)據(jù)庫至今已收錄的miRNA達(dá)24 521條,為本研究奠定了基礎(chǔ)。

      目前,miRNA的研究已取得了很大進(jìn)展,對于各種生命活動的調(diào)控作用也進(jìn)行了大量研究。GO富集分析、KEGG信號通路分析等生物信息學(xué)分析技術(shù)的出現(xiàn)對miRNA的研究起到了關(guān)鍵性的支持作用,幫助研究者從海量的miRNA數(shù)據(jù)中篩選出有價值的信息。Gene Ontology可分為分子功能、生物過程、細(xì)胞組成3個部分。蛋白質(zhì)或基因可通過ID對應(yīng)或序列注釋的方法找到與之對應(yīng)的GO號,從而進(jìn)行功能類別或細(xì)胞定位[9]。KEGG信號通路分析能夠?qū)⑻囟╩iRNA靶基因的信號通路進(jìn)行整合歸類,也可設(shè)定相關(guān)參數(shù),根據(jù)實(shí)際需要對結(jié)果進(jìn)行提取[10]。

      miR-27a研究的常規(guī)思路是通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站(miRGen、TargetScan等),利用已知的miRNA來預(yù)測下游靶基因。利用上述預(yù)測手段得到可能與之作用的miRNA,通過合成miRNA的類似物和抑制物,與所構(gòu)建靶基因的熒光載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,確定能夠被miR-27a顯著下調(diào)的靶基因,從而完成驗(yàn)證。

      miR-27a的靶基因參與了細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、調(diào)控RNA代謝、正調(diào)控信號傳導(dǎo)等一系列重要的生命活動過程,預(yù)示miR-27a在山羊繁殖過程中可能發(fā)揮著重要的作用。

      參考文獻(xiàn):

      [1]張春艷. 山羊繁殖性狀的影響因素和遺傳規(guī)律及分子調(diào)控機(jī)制研究[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

      [2]Gu S,Jin L,Zhang F,et al. Biological basis for restriction of microRNA targets to the 3′untranslated region in mammalian mRNAs[J]. Nat Struct Mol Biol,2009,16(2):144-150.

      [3]Carletti M Z,F(xiàn)iedler S D,Christenson L K. MicroRNA 21 blocks apoptosis in mouse periovulatory granulosa cells[J]. Biol Reprod,2010,83(2):286-295.

      [4]Yao G,Yin M,Lian J,et al. MicroRNA-224 is involved in transforming growth factor-beta-mediated mouse granulosa cell proliferation and granulosa cell function by targeting Smad4[J]. Mol Endocrinol,2010,24(3):540-551.

      [5]Park J E,Heo I,Tian Y,et al. Dicer recognizes the 5′ end of RNA for efficient and accurate processing[J]. Nature,2011,475(7355):201-205.

      [6]Murchison E P,Stein P,Xuan Z,et al. Critical roles for Dicer in the female germline[J]. Genes Dev,2007,21(6):682-693.

      [7]Tang F,Kaneda M,OCarroll D,et al. Maternal microRNAs are essential for mouse zygotic development[J]. Genes Dev,2007,21(6):644-648.

      [8]Ambros V. The functions of animal microRNAs[J]. Nature,2004,431:350-355.

      [9]崔曉鋼. 基于RNA-seq與small RNA-seq進(jìn)行奶牛產(chǎn)奶性狀功能基因挖掘及生物信息學(xué)預(yù)測牛新miRNA[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

      [10]楊洋,闞清,張盼,等. miRNA-126*靶基因預(yù)測及其相關(guān)信號通路的生物信息學(xué)分析[J]. 中國當(dāng)代兒科雜志,2013,15(3):227-232.

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