不同基因型甘蔗離體培養(yǎng)技術(shù)研究

呂平++張繼++檀小輝++黃秋偉++韋麗君

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.018

摘要：為探討甘蔗不同基因型的組織培養(yǎng)技術(shù)，以ROC22、03-75、02-6和B8品種（系）為試驗(yàn)材料，經(jīng)過(guò)（52±0.2） ℃水浴熱處理及培養(yǎng)后，篩選出適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、愈傷組織分化培養(yǎng)基、芽增殖和苗生根培養(yǎng)基。結(jié)果表明：甘蔗在不同培養(yǎng)階段對(duì)激素種類(lèi)、質(zhì)量濃度有差異，其中MS+3.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)較適宜，愈傷組織的分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基分別為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+005 mg/L TDZ、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L PP333 ，1/2MS改良+4.0 mg/L NAA+1.0 mg/L PP333培養(yǎng)基為最佳的生根培養(yǎng)基，各甘蔗品種（系）的生根率高，根系粗壯。

關(guān)鍵詞：甘蔗；離體培養(yǎng)；基因型；組織培養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào)： S566.104.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0080-04

收稿日期：2015-08-16

基金項(xiàng)目：廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所專(zhuān)項(xiàng)資金（編號(hào)：桂熱研201401、桂熱研201307）；廣西農(nóng)墾科技合作項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：呂平（1978—），男，廣西全州人，碩士，助理研究員，主要從事植物組織培養(yǎng)與生理生化研究。E-mail：plvgx@126.com。

通信作者：韋麗君，博士，助理研究員，主要從事木薯育種與生理方面研究。E-mail：215377275@qq.com。甘蔗（Saccharum officinarum L.）屬禾本科（Poaceae/Gramineae）甘蔗屬（Saccharum）植物，原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶地區(qū)，是高光效C4作物[1]。甘蔗是我國(guó)重要的糖料作物和能源作物。食糖是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的主要農(nóng)產(chǎn)品，甘蔗糖業(yè)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)。中國(guó)是世界第三大甘蔗種植面積的國(guó)家，主要分布在廣西、云南、廣東、海南、福建等12個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)）[2-6]。廣西作為全國(guó)最大的蔗糖生產(chǎn)基地，近20年蔗糖產(chǎn)量已連續(xù)保持在全國(guó)霸主的地位，種植面積和蔗糖量均超過(guò)全國(guó)的60%，居首位，是廣西重要的經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)和優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)[7-8]。甘蔗是無(wú)性繁殖作物，長(zhǎng)期以來(lái)利用自身的蔗莖作為種源繁殖，繁殖速度慢、效率低，尤其是新選育的優(yōu)良品種，擴(kuò)繁速度慢給生產(chǎn)造成一定程度的障礙，特別是需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)姆N莖，給甘蔗良種推廣帶來(lái)不便。此外，連續(xù)種植多年后種莖容易感染或者積累病毒，導(dǎo)致甘蔗優(yōu)良種性退化，其質(zhì)量和產(chǎn)量不斷下降，給生產(chǎn)造成極大的損失，嚴(yán)重威脅甘蔗種植產(chǎn)業(yè)安全[9-12]。采用幼嫩的新葉進(jìn)行組培繁殖，可生產(chǎn)整齊一致的甘蔗種苗提供給廣大種植者，不僅能極大地提高其速度，同時(shí)能減少許多病害，提高甘蔗產(chǎn)量及品質(zhì)，進(jìn)而提高種植者的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)甘蔗良種的繁育、推廣示范起著積極的效應(yīng)。近年來(lái)廣西農(nóng)墾甘蔗研究所選育了幾個(gè)優(yōu)良的甘蔗品種（系），為加快其繁育速度，更早提供給廣大種植者，更好地服務(wù)于生產(chǎn)，提高經(jīng)濟(jì)效益，本研究對(duì)4個(gè)不同基因型甘蔗品種（系）進(jìn)行組織培養(yǎng)，以甘蔗新葉為材料，對(duì)其在愈傷組織誘導(dǎo)、分化、芽增殖、苗生根等階段探討4個(gè)不同基因型甘蔗在不同培養(yǎng)過(guò)程中適宜的外源激素組合與濃度，為快速繁育健康的甘蔗良種種苗提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用甘蔗材料為新臺(tái)糖22號(hào)品種（ROC22）、 B8品種、02-6品系和03-75品系（其中02-6、03-75品系為廣西農(nóng)墾甘蔗研究所選育，正在進(jìn)行品種審定階段；B8品種從巴西引進(jìn)），采集于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所/廣西農(nóng)墾甘蔗研究所甘蔗種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1取材及處理從甘蔗種質(zhì)資源圃取回各參試品種（系）的蔗莖，流水洗凈并砍成雙芽苗段，（52±0.2） ℃水浴30 min，晾干冷卻，再放入34～40 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～20 d，待蔗芽長(zhǎng)至10～20 cm時(shí)，取無(wú)病害、生長(zhǎng)健壯的莖梢，流水沖洗，剝?nèi)ネ鈬~片，在超凈工作臺(tái)上，用70%的乙醇表面消毒，用解剖刀逐層剝?nèi)~，留下生長(zhǎng)點(diǎn)0～2 cm新葉，切成1～2 mm 厚圓片，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（其間進(jìn)行不同質(zhì)量濃度PVP防褐效果的研究），暗培養(yǎng)。待愈傷組織誘導(dǎo)出后，轉(zhuǎn)接到愈傷組織分化培養(yǎng)基、芽增殖培養(yǎng)基和苗生根培養(yǎng)基中進(jìn)行光培養(yǎng)。

1.2.2培養(yǎng)方式及培養(yǎng)條件固體培養(yǎng)基，分光、暗培養(yǎng)，光培養(yǎng)時(shí)光照10 h/d，光強(qiáng)1 000～1 500 lx，避光暗培養(yǎng)，置于溫度為25～28 ℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.2.3試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)時(shí)間與方法觀察和統(tǒng)計(jì)各個(gè)培養(yǎng)階段的情況（每個(gè)階段培養(yǎng)20 d），用Excell軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。外植體褐化率=外植體褐化塊數(shù)/接種外植體塊數(shù)×100%；愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種培養(yǎng)的外植體塊數(shù)×100%；愈傷組織分化率=愈傷組織分化出芽塊數(shù)/接種培養(yǎng)的愈傷組織塊數(shù)×100%；芽增殖系數(shù)=培養(yǎng)后芽的數(shù)量/接種前芽的數(shù)量；生根率=分化出根的數(shù)量/接種前苗的數(shù)量×100%。

1.2.4培養(yǎng)基的配制基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加 30 g/L 蔗糖、6.0 g/L瓊脂粉，pH值為5.8，不同的培養(yǎng)階段添加不同外源激素，3次重復(fù)。培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1不同基因型甘蔗外植體褐化率的差異及PVP處理對(duì)外植體褐化的影響

從對(duì)照組看，4個(gè)甘蔗品種（系）的愈傷組織出愈率與褐化率不同，出愈率最高的為03-75品系，達(dá)65.7%，且其外植體褐化率也較低，其后依次為B8、ROC22品種，最差的為02-6品系，其褐化最嚴(yán)重，達(dá)到85.5%，愈傷組織出愈率低，說(shuō)明不同基因型甘蔗品種的褐化與愈傷組織誘導(dǎo)存在較大的差異。添加PVP（0.1～2.0 g/L）可有效降低甘蔗愈傷組織的褐化，隨著PVP濃度的提高，褐化程度逐漸降低，愈傷組織的出愈率相應(yīng)地提高，當(dāng)PVP的濃度達(dá)到2.0 g/L時(shí)，盡管各甘蔗品種（系）的褐化率都下降，但愈傷出愈率也下降，說(shuō)明過(guò)高的PVP濃度對(duì)甘蔗的褐化和愈傷的誘導(dǎo)都有抑制作用。當(dāng)PVP濃度為1.0 g/L時(shí)，對(duì)甘蔗愈傷組織的防褐和出愈率比較理想（表2）。

2.2不同濃度2，4-D對(duì)4個(gè)基因型甘蔗愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表3可以看出，不同2，4-D的濃度都能誘導(dǎo)出4個(gè)甘蔗品種（系）外植體的愈傷組織，但不同品種（系）間誘導(dǎo)的效果有較大的差異，誘導(dǎo)率在8.5%～82.4%之間。2，4-D濃度從 1.0 mg/L至4.0 mg/L，4個(gè)品種（系）愈傷組織的誘導(dǎo)率都出現(xiàn)低—高—低的變化趨勢(shì)，且最適濃度在2.5～3.5 mg/L 之間。從表3還可以看出，不同基因型品種（系）的最高誘導(dǎo)率配方是有差異的，同一個(gè)濃度梯度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率也不同，其中03-75品系2，4-D濃度為 3.5 mg/L 時(shí)誘導(dǎo)率最高，ROC22和B8品種在3.0 mg/L、 02-6品系在2.5 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率最高，對(duì)照組未誘導(dǎo)出愈傷組織，說(shuō)明2，4-D在愈傷組織誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。綜合誘導(dǎo)率情況看， 4個(gè)品種（系）可以選擇4號(hào)培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基。

2.3不同培養(yǎng)基對(duì)4個(gè)基因型甘蔗愈傷組織分化的影響

從表4可以看出，在相同的生長(zhǎng)素NAA濃度下，隨著細(xì)胞分裂素6-BA的濃度從0.5 mg/L至3.0 mg/L，4個(gè)甘蔗品種（系）愈傷組織的分化率呈現(xiàn)出低—高—低的趨勢(shì)，且不同基因型甘蔗品種（系）有較大的差異，ROC22的愈傷組織較其他品種易分化，分化率較高，4個(gè)甘蔗品種（系）的分化難易程度為ROC22>03-75>B8>02-6，且6-BA的最適濃度為2.0 mg/L。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，02-6、03-75品系在分化過(guò)程中產(chǎn)生的白化苗相對(duì)較多，這可能與甘蔗自身的基因型有一定的關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。此外，20 mg/L 6-BA與0.05 mg/L TDZ組合比單獨(dú)處理分化率明顯提高，ROC22分化率達(dá)到80%，其他3個(gè)甘蔗品種（系）也相應(yīng)地提高了159%、16%、16.8%，說(shuō)明添加TDZ能有效地促進(jìn)這4個(gè)甘蔗品種（系）愈傷組織分化。

2.4不同培養(yǎng)基對(duì)甘蔗芽增殖的影響

從配方8、9、13、10、11比較可以看出，隨著6-BA濃度的升高（0.5～3.0 mg/L），甘蔗芽增殖的系數(shù)變大，芽長(zhǎng)勢(shì)良好，當(dāng)6-BA濃度為3.0 mg/L時(shí)，甘蔗的增殖系數(shù)達(dá)到最大值。相同濃度的6-BA（2.0 mg/L）添加0.5 mg/L PP333（多效唑）比未添加的配方增殖系數(shù)和苗長(zhǎng)勢(shì)好，比較粗壯，說(shuō)明PP333對(duì)甘蔗生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，ROC22、02-6、03-75、B8的增殖系數(shù)最高分別達(dá)到5.0、3.0、4.0、3.3倍，提高了87%、7.1%、14.3%、10%。添加AC（活性炭）的處理比未添加的增殖系數(shù)和苗的長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較差，但發(fā)現(xiàn)其褐化較少（表5）。從試驗(yàn)結(jié)果得出，6-BA的濃度過(guò)低、過(guò)高對(duì)甘蔗的增殖、生長(zhǎng)勢(shì)和苗的質(zhì)量不利，兼顧增殖系數(shù)、生長(zhǎng)勢(shì)及苗質(zhì)等方面，選擇6-BA濃度為2.0 mg/L較適合甘蔗芽增殖，同時(shí)添加PP333 0.5 mg/L有利于甘蔗的生長(zhǎng)、增殖，選擇14號(hào)培養(yǎng)基為芽增殖最佳培養(yǎng)基。

2.5不同培養(yǎng)基對(duì)4個(gè)基因型甘蔗苗生根的影響

選擇長(zhǎng)勢(shì)一致（株高2～3 cm）的4個(gè)甘蔗品種（系）的芽增殖苗接種到16～23培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，從表6可以看出，甘蔗在8種培養(yǎng)基里都能生根，但不同甘蔗品種（系）的生根難易程度不同，03-75品系最易生根，相同生長(zhǎng)素濃度（4.0 mg/L NAA）下的1/2MS培養(yǎng)基比MS生根率高。從16～20培養(yǎng)基配方看，隨著生長(zhǎng)素NAA濃度升高（1.0～5.0 mg/L），各甘蔗品種（系）的生根率不斷提高，但根的粗細(xì)、苗質(zhì)量等有差異。NAA濃度在4.0、5.0 mg/L時(shí)，各品種（系）的生根率差異不明顯。在相同NAA濃度（4.0 mg/L）條件下添加1.0 mg/L PP333，生根率高，根生長(zhǎng)粗，苗長(zhǎng)勢(shì)好，特別是經(jīng)過(guò)改良的配方22在4個(gè)甘蔗品種（系）的生根率分別達(dá)到82.1%、90.5%、100%、64.5%，且根系粗壯、長(zhǎng)勢(shì)好、苗質(zhì)優(yōu)。因此，選擇配方22號(hào)為最佳的生根培養(yǎng)基。

2.6組培苗的假植與移栽

將4個(gè)甘蔗品種（系）的生根苗根長(zhǎng)至2～3 cm、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的瓶苗移到溫室大棚，打開(kāi)組培瓶蓋，煉苗7 d后取出組培苗，流水沖洗干凈培養(yǎng)基，分成 4～5株叢苗，剪去1/3的葉片，用0.1%高錳酸鉀溶液或0.5%多菌靈溶液消毒根系5 min，假植于已消毒大棚中的沙質(zhì)土壤苗床。保持苗床溫度在25～30 ℃、濕度在75%～90%之間，ROC22、02-6、03-75、B8的成活率分別達(dá)85%、70%、82%、76%，其間噴0.1%的多菌靈溶液，待苗高超過(guò)20 cm且生長(zhǎng)旺盛時(shí)，再分單株定植于營(yíng)養(yǎng)袋進(jìn)行假植，40 d左右可以移植到大田中。

3結(jié)論與討論

植物的基因型不同，表現(xiàn)出的遺傳特性有很大的差異，組織培養(yǎng)中也相應(yīng)地表現(xiàn)出不同的性狀特征。通過(guò)對(duì)4個(gè)不同基因型的甘蔗品種（系）離體培養(yǎng)可以看出，4個(gè)甘蔗品種（系）的褐化率、愈傷組織的誘導(dǎo)率、愈傷組織的分化率、芽的增殖率及苗生根率均表現(xiàn)出較大的差異，試驗(yàn)結(jié)果與譚志勇等的試驗(yàn)結(jié)果[13]基本一致。在相同的培養(yǎng)基與培養(yǎng)環(huán)境條件下，4個(gè)甘蔗品種（系）愈傷組織的誘導(dǎo)率、分化率、增殖率和生根率的高低排列順序依次為03-75>ROC22>B8>02-6、ROC22>03-75>B8>02-6、ROC22>03-75>B8>02-6、03-75>02-6>ROC22>B8，結(jié)果表明：甘蔗在組織培養(yǎng)過(guò)程中，基因型不同的品種（系）存在明顯的差異，說(shuō)明基因型在甘蔗組織培養(yǎng)中強(qiáng)烈影響脫分化、再分化和生根速度能力，受其自身的遺傳特性控制。

甘蔗組織培養(yǎng)中，在愈傷組織誘導(dǎo)、芽分化和生根階段，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞分裂、器官建成等起著重要作用。甘蔗不同培養(yǎng)階段，需要不同種類(lèi)、質(zhì)量濃度的調(diào)節(jié)劑。試驗(yàn)結(jié)果表明，在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程中，2，4-D起著關(guān)鍵作用，不添加2，4-D的培養(yǎng)基未能誘導(dǎo)出愈傷組織，2，4-D的濃度在1.0～3.5 mg/L范圍內(nèi)，隨著2，4-D濃度的升高，外植體的出愈率不斷提高，但濃度過(guò)高（4.0 mg/L）誘導(dǎo)率反而下降，針對(duì)不同甘蔗品種選擇適宜的2，4-D濃度是必要的。在愈傷組織分化階段，5種配方都可以分化出芽，但不同配方分化出芽的質(zhì)量、數(shù)量有較大的差異，隨著6-BA濃度（0.5～2.0 mg/L）加大其分化率提高，但高濃度6-BA（3.0 mg/L及以上）分化出的芽長(zhǎng)勢(shì)差，畸形或變異芽多，同時(shí)TDZ與 6-BA 組合對(duì)甘蔗愈傷組織的分化效果優(yōu)于單獨(dú)使用6-BA處理，適宜濃度的TDZ與6-BA配合，對(duì)提高愈傷組織的分化效果是有利的。在芽增殖過(guò)程中，同樣隨著6-BA濃度的提高甘蔗增殖系數(shù)不斷加大，但高濃度對(duì)甘蔗芽生長(zhǎng)有不利的影響，如芽的長(zhǎng)勢(shì)差、苗質(zhì)量不好，在培養(yǎng)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)有畸形、白化或黃化等變異苗出現(xiàn)。在苗的生根培養(yǎng)時(shí)，1/2MS明顯比MS培養(yǎng)基好，特別是改良的培養(yǎng)基更好，說(shuō)明在生根培養(yǎng)中適當(dāng)?shù)亟档弯@態(tài)氮等大量元素更有利于甘蔗苗生根。

甘蔗在組織培養(yǎng)過(guò)程中，普遍出現(xiàn)培養(yǎng)基褐化現(xiàn)象，且不同基因型的甘蔗品種（系）褐化程度不同，差異明顯。從試驗(yàn)結(jié)果可知，4個(gè)甘蔗品種（系）的褐化由輕到重依次為 03-75、ROC22、B8、02-6，說(shuō)明不同的基因型甘蔗對(duì)酚類(lèi)氧化所引起的褐化具有不同承受能力。為減少甘蔗培養(yǎng)過(guò)程中的褐化發(fā)生，在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中添加PVP防褐劑，結(jié)果表明添加PVP處理比未加PVP處理的褐化率普遍降低，且添加濃度不同對(duì)甘蔗褐化程度不同，說(shuō)明PVP處理對(duì)甘蔗褐化有一定的抑制作用，當(dāng)濃度為1.0 g/L時(shí)效果比較好。對(duì)于PVP可降低植物褐化發(fā)生的機(jī)制，主要是能夠鈍化或抑制多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶等酶系統(tǒng)活性的抗氧化劑[14]。此外，加入活性炭同樣也可降低甘蔗褐化，活性炭具有抑制或吸附多酚、醌類(lèi)物質(zhì)從而降低褐化發(fā)生的概率[15]，但芽增殖倍數(shù)下降，同時(shí)在培養(yǎng)后期芽的長(zhǎng)勢(shì)不好、苗質(zhì)差，這可能是活性炭在吸收多酚物質(zhì)同時(shí)也吸附培養(yǎng)基中部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及激素，導(dǎo)致增殖倍數(shù)下降、后期長(zhǎng)勢(shì)差，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究探討。

多效唑（PP333）是一種新型的廣譜植物生長(zhǎng)延緩劑，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中可發(fā)揮促進(jìn)分枝、矮化、提高葉綠素含量，它對(duì)于提高植物分蘗和壯苗生根等有重要的作用[16]。植物組織培養(yǎng)中，PP333作為一種附加成分添加在培養(yǎng)基中已有研究報(bào)道[17-18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在繼代培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L PP333可提高甘蔗的分蘗率，在生根培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L PP333有利于促進(jìn)甘蔗根系粗壯、苗生長(zhǎng)勢(shì)好、質(zhì)優(yōu)，從而更有助于提高移栽成活率。因此，添加適宜濃度的PP333對(duì)甘蔗的生長(zhǎng)、增殖有一定的促進(jìn)作用。

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