李敏++馬祥建++李玉娟++王瑩++談峰+++張健

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.025

摘要：將蘇云金芽孢桿菌Cry3A類抗蟲基因經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切后與植物表達載體pCAMBIA1304-C6連接，構建pCAMBIA1304-C6-Cry3A重組表達載體，將其轉化到農(nóng)桿菌LBA4404中，同時進行雙酶切、測序及PCR鑒定。結果表明：雙酶切及測序產(chǎn)物與預期擴增片段相符，重組表達載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A構建成功；農(nóng)桿菌LBA4404中含有重組質粒，成功構建了Cry3A農(nóng)桿菌基因工程菌株。

關鍵詞：柳樹；抗蟲基因；Cry3A；表達載體構建

中圖分類號： S722.3+6文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0108-02

收稿日期：2015-08-25

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（14）5094]；江蘇省南通市科技局科技創(chuàng)新計劃（編號：HL2013028）。

作者簡介：李敏（1981—），女，江蘇如東人，碩士，副研究員，主要從事耐鹽林木育種與栽培研究。E-mail：alice04@163.com。

通信作者：張健，博士，副研究員。E-mail：yjnkyy@sohu.com。柳樹是我國沿海灘涂重要的綠化造林樹種之一，當單品種大面積造林時，會造成柳樹害蟲大面積發(fā)生。在江蘇南通地區(qū)對柳樹造成嚴重危害的是食葉害蟲柳藍葉甲（Plagiodera versicolora），它屬鞘翅目葉甲科，成蟲咬食柳樹葉片造成缺刻或孔洞；幼蟲多聚集危害幼嫩葉片，高齡幼蟲少有單獨為害成熟葉片，發(fā)生嚴重時葉片幼蟲可高達30多頭/張，危害嚴重時能食光柳樹初生的嫩芽及嫩葉，影響柳樹正常生長，造成嚴重的經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)的化學防治方法存在很多弊端，如污染環(huán)境，能使害蟲產(chǎn)生耐藥性[1]。在基因工程技術飛速發(fā)展的今天，轉基因技術已成為柳樹害蟲防治的關注焦點。

本研究針對柳樹嚴重的蟲害現(xiàn)象，選用Cry3A類抗鞘翅目害蟲基因[2]，構建抗蟲植物表達載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A，重組表達載體經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定正確后轉入農(nóng)桿菌制備基因工程菌，為今后進行轉基因抗蟲耐鹽柳樹育種和耐鹽柳樹抗蟲效用研究奠定堅實基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒和菌種大腸桿菌DH5α，根癌農(nóng)桿菌LBA4404、pCAMBIA1304-C6植物表達載體均由北京林業(yè)大學生物科學與技術學院提供，含有目的基因的質粒pUC57-Cry3A由中美泰和生物技術（北京）有限公司合成。

1.1.2酶和生化試劑限制性內切酶BamHⅠ和SalⅠ，T4 DNA連接酶、Taq DNA酶[購自生工生物工程（上海）股份有限公司]。膠回收試劑盒及PCR產(chǎn)物回收試劑盒[購自寶生物工程（大連）有限公司]?？敲顾嘏cLB培養(yǎng)基所用的胰蛋白胨（trypton）、酵母浸膏（yeast extract）、氯化鈉瓊脂等[購于生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.2方法

1.2.1重組表達載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A的構建pUC57-Cry3A質粒和pCAMBIA1304-C6質粒載體經(jīng)大量提取與純化后，分別用BamHⅠ、SalⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%TAE瓊脂糖凝膠電泳，分別回收pUC57-Cry3A小片段和pCAMBIA1304-C6大片段，通過T4 DNA連接酶連接這2個片段，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB 固體平板上篩選轉化菌落。用Cry3A基因特異的引物（正向5′-CACACAGCCAGGGTCGTATT-3′，反向5′-AGCACGGTAAGGGTCATCTC-3′）進行菌落PCR篩選陽性菌株。在含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，提取質粒，BamHⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定轉化子[3]。經(jīng)鑒定的重組子命名為pCAMBIA1304-C6-Cry3A。并將相應的克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2農(nóng)桿菌pCAMBIA1304-C6-Cry3A重組菌株的構建用液氮凍融法將構建的表達載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A轉化到農(nóng)桿菌LBA4404中，在含有卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（50 μg/mL）的YEB固體平板上培養(yǎng)后，隨機挑取7個單菌落，分別接種于3 mL 含有卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（50 μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 搖床過夜培養(yǎng)[4]。各取2 μL菌液為模板，用引物F1、R1進行PCR鑒定。

2結果與分析

2.1重組表達載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A的構建

采用BamHⅠ和SalⅠ分別對質粒pUC57-Cry3A和pCAMBIA1304-C6進行雙酶切，切膠回收長度為1 806 bp的Cry3A基因片段和長度為15 140 bp的pCAMBIA1304-C6載體骨架。通過T4 DNA連接酶將目的片段連接到載體上，經(jīng)過大腸桿菌中的菌落PCR，質粒酶切（圖1）和測序等過程，表明成功構建了重組表達質粒（圖2）。

2.2重組表達載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A轉化農(nóng)桿菌的驗證

將pCAMBIA1304-C6-Cry3A重組質粒，按“1.2.2”節(jié)方法轉化農(nóng)桿菌并進行PCR驗證。各菌液和陽性對照pCAMBIA1304-C6-Cry3A質粒均能擴增出目的基因片段，而陰性對照LBA4404菌液未能擴增出目的片段（圖3）。表明pCAMBIA1304-C6-Cry3A質粒已成功轉入農(nóng)桿菌LBA4404，成功構建農(nóng)桿菌基因工程菌株，可進行后續(xù)的轉基因試驗。

3結論與討論

1981年第1個編碼蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因被Schnepf等成功克隆[5]，從此揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。隨著分子生物學的迅速發(fā)展，利用轉基因技術將Bt殺蟲基因轉入各種Bt野生菌株構建具有使殺蟲機制多樣化[6]、擴大殺蟲譜[7]、降低害蟲抗藥率[8]等優(yōu)勢的殺蟲工程菌的方法已廣泛應用于害蟲生物防治領域[9-10]。武漢大學高梅影等就曾從中國土壤中分離出2株產(chǎn)近菱形的薄扁伴孢晶體的殺鞘翅目昆蟲的蘇云金芽孢桿菌YM-03及SHQ11-10，生物毒力試驗中其稀釋400倍的制劑噴霧對柳藍葉甲（Plagiodera versicolora）及馬鈴薯甲蟲防治效果達94.6%[11]。到目前為止已報道的編碼cry蛋白的基因超過300個，其中cry3、cry5、 cry7、cry8和cry18A系列的蛋白基因對鞘翅目昆蟲具有專一毒性，并且當中cry3Aa基因專一性和毒性最高，從細胞營養(yǎng)期開始即可不依賴芽孢的產(chǎn)生較長時間表達，且表達的蛋白多肽分子量較小，易于被昆蟲中腸液降解為 55 ku 的毒性多肽，而且遺傳背景也最清楚，因此國內外一般都優(yōu)先選用cry3Aa基因作為抗蟲基因轉入微生物，構建具有抗鞘翅目昆蟲殺蟲活性的重組Bt殺蟲劑[12-13]。

綜合考慮，筆者選擇了BtCry3A類基因，成功構建抗蟲植物表達載體pCAMBIA1304-C6-Cry3A，為下一步進行轉基因抗蟲柳樹育種研究奠定了基礎。在后續(xù)的試驗中，將構建雙價抗蟲植物表達載體，對轉單價和雙價柳樹植株抗蟲性方面進行比較，以期為耐鹽柳樹害蟲綠色防控提供方法及獲得具有高效廣譜抗蟲性的轉Bt基因柳樹植株。

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