食品中抗生素耐藥基因研究進(jìn)展

唐惠玲 尹鴻萍

摘要：隨著養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)入規(guī)模化階段，抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用。盡管抗生素本身在動物體內(nèi)積累量很低，但由抗生素誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥基因會殘留在肉制品等食品中，并通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人體。結(jié)合最新文獻(xiàn)，對食品中抗生素耐藥基因的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移進(jìn)行綜述，闡明抗生素耐藥基因古已有之，大致可分為固有耐藥基因和獲得性耐藥基因，固有耐藥基因一般通過代際遺傳在同一種屬細(xì)菌間傳遞，具有較小的傳播風(fēng)險；而獲得性耐藥基因的傳播與抗生素或環(huán)境壓力有關(guān)，可以在不同種屬細(xì)菌間傳播，推定其是食品中抗生素耐藥基因轉(zhuǎn)移和傳播的主要原因；還介紹了食品中抗生素耐藥基因的檢驗(yàn)方法和原理，提出建立食品中殘留抗生素耐藥基因檢測規(guī)范體系的必要性。

關(guān)鍵詞：食品；抗生素耐藥基因；轉(zhuǎn)移；檢測

中圖分類號： S853.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）10-0034-04

收稿日期：2015-08-15

基金項(xiàng)目：江蘇省淮安市科技局科技支撐計劃（工業(yè)）（編號：HAG2013045）。

作者簡介：唐惠玲（1985—），女，江蘇張家港人，博士研究生，講師，主要從事生物藥物研究。E-mail：tanghuilingyaya@126.com。

通信作者：尹鴻萍，博士，副教授，主要從事生物藥物研究。E-mail：yinhongping@cpu.edu.cn。

[ZK）]

抗生素耐藥已經(jīng)成為威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。隨著新型抗生素的研發(fā)進(jìn)入瓶頸期，從臨床范圍以外降低抗生素耐藥性的研究越來越受到重視。隨著世界養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)入規(guī)?；图s化發(fā)展階段，抗生素使用量和使用范圍不斷擴(kuò)大，不僅用于治療感染性疾病，還被廣泛用作飼料添加劑以加快畜禽生長速度和提高飼料轉(zhuǎn)化效率[1-2]。

歐洲國家對抗生素濫用的危害認(rèn)識相對較早，[JP2]并對此作出了嚴(yán)格的管控。2006年1月1日起，歐盟全面禁止在飼料中添加以保健或促進(jìn)生長為目的抗生素類添加劑[3]。中國的抗生素濫用問題極為嚴(yán)重，各類抗生素原料藥產(chǎn)量約 21萬t，其中46.1%用于養(yǎng)殖業(yè)，達(dá)美國養(yǎng)殖業(yè)使用量的4倍之多[4]。

據(jù)2014年WHO報道，歐洲每年由抗生素耐藥導(dǎo)致的死亡人數(shù)多達(dá)2.5萬人，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)150億歐元；美國CDC估計，美國每年至少有200萬人受耐藥致病菌感染，并導(dǎo)致至少2.3萬人死亡[5]?？股啬退幓蜃鳛橐环N環(huán)境污染物，已受到科學(xué)界的重視，它對動植物和人體健康的潛在生態(tài)風(fēng)險也逐漸被揭示[6]。

1抗生素耐藥基因概述

1.1食品中抗生素耐藥性的分布[HT]

抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的濫用，是耐藥性廣泛擴(kuò)散的主要原因之一。被攝入動物體內(nèi)的抗生素只有小部分被吸收，殘留在動物體各組織或器官中；大部分抗生素以原藥的形式直接排泄。郝宏珊等對576份白條雞樣品中分離出的390株沙門氏菌（Salmonella）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在248株萘啶酮酸耐藥菌中[CM（25]，aac（6′）-Ib-cr、qnrA、qnrB、qnrS基因檢出率分別為[CM）][LM] 20.16%、10.89%、10.08%、1.61%；在83株環(huán)丙沙星耐藥菌株中，共檢出199個gyrA和parC基因突變點(diǎn)[7]。

部分抗生素經(jīng)代謝后的產(chǎn)物也可能具有生物活性，在自然環(huán)境中亦可轉(zhuǎn)化為原藥[4]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，人們不加區(qū)別地使用含有抗生素殘留的動物糞便來增強(qiáng)土壤肥力，這使得環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中殘留的抗生素分布更趨廣泛。抗生素進(jìn)入環(huán)境中無可避免帶來一系列負(fù)面影響，它們破壞土壤的原有微生態(tài)環(huán)境，使土壤中產(chǎn)生耐藥菌群，并通過地表和地下水轉(zhuǎn)移到其他地方[8]。Yang等2010年3月至2011年2月間對中國河南省新鄉(xiāng)市周邊11所養(yǎng)雞場以及使用這些養(yǎng)雞場雞糞作為肥料的大棚蔬菜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在使用抗生素的養(yǎng)雞場中，堆肥雞糞中細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性和多藥耐藥的比例分別為2091%～65.9%和8.24%～20.63%；而在使用中藥材的養(yǎng)雞場中，堆肥雞糞出現(xiàn)耐藥性和多藥耐藥的比例分別僅為064%～26.87%和0.02%～4.13%[9]。在使用抗生素的養(yǎng)雞場所產(chǎn)雞糞為肥料的大棚蔬菜中，白菜、芹菜和黃瓜內(nèi)生菌都具有較強(qiáng)的氨芐西林耐藥性。這揭示了環(huán)境中導(dǎo)致耐藥性的因素有可能會通過某些途徑轉(zhuǎn)移到農(nóng)作物的內(nèi)生菌中。

[JP2]抗生素耐藥基因的快速進(jìn)化導(dǎo)致食品中正常菌群或條件致病菌也出現(xiàn)普遍的耐藥性，對人類健康產(chǎn)生了重大而復(fù)雜的威脅。發(fā)酵食品中的重要原料乳酸桿菌（Lactobacillus）、鏈球桿菌（Streptococeus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）等都有耐藥性或耐藥基因檢出。Devirgiliis等總結(jié)了近年來對乳酸桿菌和乳酸乳球菌的耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)這2類乳酸菌均可以作為抗生素耐藥基因“集散地”，借此將耐藥基因轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌體內(nèi)；絕大部分的乳酸桿菌和乳酸乳球菌具有四環(huán)素和紅霉素耐藥性，并攜帶耐藥基因tet（M）和erm（B），也有部分?jǐn)y帶耐藥基因 tet（S）、（W）、（K）、（L）、（O），以及erm（C）和msr（C）[10]。

1.2抗生素耐藥基因溯源

抗生素耐藥性的產(chǎn)生雖屬自然現(xiàn)象，但也有證據(jù)表明，人類的某些行為加快了抗生素耐藥性的出現(xiàn)和蔓延。抗生素耐藥機(jī)制是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域，大致可分為以下類型：（1）產(chǎn)生抗生素滅活酶；（2）修改或保護(hù)抗生素作用靶標(biāo)蛋白；（3）改變細(xì)胞膜或革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜通透性；（4）通過外排泵將抗生素排出細(xì)胞外[11]。隨著研究進(jìn)一步深入，抗生素耐藥機(jī)制研究仍不斷有新突破[12-14]。在自然選擇過程中，細(xì)菌基因結(jié)構(gòu)的可塑性與復(fù)雜性使其能夠進(jìn)化出相應(yīng)的耐藥機(jī)制以適應(yīng)環(huán)境中出現(xiàn)的各類抗生素。

WHO報告指出，抗生素耐藥性是多個互相關(guān)聯(lián)因素共同造成的復(fù)雜問題，單一、孤立的干預(yù)措施難以取得理想效果[15]。Wright課題組將宏基因組（metagenomics）的研究思路引入抗生素耐藥基因研究，提出用耐藥基因組（resistome）這一新概念來描述多樣化的耐藥基因[16]。耐藥基因組是病原菌、抗生素產(chǎn)生菌以及環(huán)境微生物中一切抗生素耐藥基因的集合。耐藥性由編碼“管家”或代謝蛋白的前體基因轉(zhuǎn)化而來，雖然這些前體基因本來與耐藥性并無太大關(guān)系，但廣義的耐藥基因組也應(yīng)該包括這些“前體耐藥基因”。此外，從細(xì)菌的整體水平來看，機(jī)體接觸毒性分子會引發(fā)自身的某些基因與其表達(dá)產(chǎn)物之間的相互作用，導(dǎo)致機(jī)體對抗生素產(chǎn)生耐藥性。因此，耐藥基因組還應(yīng)該包含那些能令細(xì)菌耐受抗生素殺傷作用的與生俱來的基因系統(tǒng)[17-18]。

對一系列采集于抗生素發(fā)明以前細(xì)菌的研究表明，抗生素耐藥基因先于抗生素藥物存在[19]。Wright課題組分別從人跡罕至的加拿大Yukon地區(qū)3萬年前的永凍土以及美國Carlsbad洞穴、Lechuguilla洞穴中距今400萬～700萬年的地質(zhì)斷層中獲取了多株細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)這些從未與人類或抗生素接觸過的細(xì)菌大多都具有多種耐藥基因[20-21]。土壤中細(xì)菌的存活必須以能夠耐受土壤微生物產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)為前提，因此，土壤微生物也天然地具有多重耐藥性，土壤微生物是抗生素耐藥基因庫。不過在沒有抗生素選擇壓力的情況下，土壤細(xì)菌的耐藥基因不會那么容易轉(zhuǎn)移到致病菌中，F(xiàn)orsberg等采集美國明尼蘇達(dá)州和密歇根州的18個農(nóng)牧業(yè)土壤樣本，發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌的抗生素耐藥基因與特定細(xì)菌種屬密切關(guān)聯(lián)，不同種屬間的耐藥基因轉(zhuǎn)移很少發(fā)生[22]。

1.3耐藥基因在抗生素壓力下的選擇與進(jìn)化

李顯志將抗生素產(chǎn)生后70多年間耐藥性的產(chǎn)生與傳播稱為“抗生素耐藥性的現(xiàn)代進(jìn)化”[23]。在無抗生素時代，細(xì)菌的抗生素耐藥基因組就已存在；不過抗生素藥物的出現(xiàn)與泛濫加快了耐藥基因的進(jìn)化。耐藥性在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移可以通過水平基因轉(zhuǎn)移（HTG），越來越多細(xì)菌具有的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）編碼基因便是通過水平轉(zhuǎn)運(yùn)基因?qū)崿F(xiàn)的。在青霉素類和頭孢菌素類抗生素的選擇性壓力下，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）編碼基因在細(xì)菌間快速且廣泛傳播，給全世界醫(yī)療保健帶來前所未有的嚴(yán)重問題[24]。從生物進(jìn)化論的角度看，在抗生素環(huán)境中，敏感細(xì)菌被殺滅，通過突變或轉(zhuǎn)移等手段獲得耐藥基因的細(xì)菌才能存活下來。

[JP2]細(xì)菌暴露在抗生素壓力下有不同的自然進(jìn)化方式，但結(jié)果都是產(chǎn)生耐藥性。Zhang等通過對含環(huán)丙沙星環(huán)境中的野生型和GASP突變型大腸桿菌（Eescherichia coli）菌群的基因組測序發(fā)現(xiàn)，不同方式的基因變異可以產(chǎn)生相似的耐藥性[25]。

2食物鏈中抗生素耐藥性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)

抗生素耐藥性可分為固有耐藥性（intrinsic resistance）和獲得性耐藥性（acquired resistance）[26]，普遍認(rèn)為后者是抗生素耐藥基因在環(huán)境和食物鏈中轉(zhuǎn)移和傳播的主要原因。

2.1食品中細(xì)菌固有耐藥基因的代際遺傳

固有耐藥性指細(xì)菌自身染色體上天然耐藥基因的代際遺傳。固有耐藥性特定于某1種（屬）的細(xì)菌，因此，在確定固有耐藥性時首先應(yīng)將該細(xì)菌鑒定到種（屬）水平。若該種（屬）中一些具有代表性的菌株均顯示對某一類抗生素表現(xiàn)耐藥性，可認(rèn)為該種（屬）細(xì)菌對這一類抗生素具有固有耐藥性。固有耐藥性不是在抗生素選擇性壓力下產(chǎn)生的，與是否接觸過抗生素?zé)o關(guān)，一般只針對一類抗生素耐藥[27]。

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種常見的食源性致病菌，它幾乎對除青霉素類以外的所有抗生素都敏感。Chiou等研究表明，副溶血弧菌的青霉素耐藥性源于新發(fā)現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺酶編碼基因[WTBX][STBX]blaCARB-17[WTBZ][STBZ]，在GenBank中的293株以及從食品中分離出的91株副溶血弧菌基因序列中都有該基因存在，故推斷青霉素耐藥性為其固有耐藥性[28]。[JP2]

歐洲食品安全局（EFSA）有系統(tǒng)的食品及飼料工業(yè)細(xì)菌耐藥性評價體系，該體系是國際上細(xì)菌耐藥性評價的參考標(biāo)準(zhǔn)[29-30]。[JP3]EFSA認(rèn)為，固有耐藥性的耐藥基因傳播風(fēng)險最小，所以攜帶固有耐藥基因的細(xì)菌菌株可用作食品或飼料添加劑[31]。

2.2食物鏈中細(xì)菌獲得性耐藥基因的種屬間轉(zhuǎn)移

獲得性耐藥性多由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或整合子介導(dǎo)，亦可由染色體介導(dǎo)，是通過基因轉(zhuǎn)移而獲得的耐藥基因表型[32]。染色體介導(dǎo)的獲得性耐藥基因多是在抗生素或某種外界條件壓力下產(chǎn)生，細(xì)菌改變自身代謝途徑，避免被抑制或殺滅。在自然條件下，細(xì)菌染色體發(fā)生抗生素耐藥突變比例不高，發(fā)生耐藥突變的細(xì)菌生長繁殖速度較慢，染色體突變型耐藥菌在自然界屬于“少數(shù)派”[33]。EFSA認(rèn)為，染色體突變引起的獲得性耐藥基因同樣具有很低的耐藥基因傳播風(fēng)險，該類菌株也可作為食品或飼料添加劑。但是，由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、基因盒以及插入序列共同區(qū)（ISCR）介導(dǎo)，通過轉(zhuǎn)入外源性基因引起的獲得性耐藥性具有較高的耐藥基因傳播風(fēng)險，該類菌株不能用作食品或飼料添加劑?？梢哉f，除染色體介導(dǎo)以外的各種獲得性耐藥性是食物鏈中抗生素耐藥基因廣泛傳播并帶來公共衛(wèi)生危害的主要原因。

藥物流行病學(xué)研究顯示，抗生素可以同時增加病原菌和共生菌的耐藥性。在某些條件下，共生菌作為抗生素的耐藥基因庫和轉(zhuǎn)移中介，通過食物鏈將抗生素耐藥基因傳遞至人類腸道內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)耐藥基因在食品和人體之間的轉(zhuǎn)移[34]。隨著研究的深入，腸道微生物菌群與人類健康的關(guān)系不斷被揭示，醫(yī)學(xué)界已經(jīng)普遍認(rèn)識到，腸道菌群的獲得性耐藥基因可能是人體通過食物鏈獲得抗生素耐藥性的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

有學(xué)者對丹麥、西班牙和中國健康人群腸道細(xì)菌基因組中的耐藥基因進(jìn)行了研究，從162名健康人的腸道細(xì)菌采集約400萬個基因，建立基因數(shù)據(jù)庫；從中鑒別出 1 093 個耐藥基因。通過與其他不同環(huán)境中細(xì)菌基因組比較發(fā)現(xiàn)，人體腸道細(xì)菌中耐藥基因比例最高，而且更趨于集中在某些特定的細(xì)菌種屬。根據(jù)這些耐藥基因序列和耐受抗生素種類的差別，這1 093個耐藥基因可進(jìn)一步分成149種。結(jié)果顯示中國人、丹麥人和西班牙人腸道中的耐藥基因分別為70種、45種和49種。丹麥人和西班牙人的耐藥基因型比較相似，中國人耐藥基因型與上述兩國人群差別較大。這種差異一方面是由于腸道菌群差異，另一方面則源于抗生素使用的差異[35]。

在抗生素濫用未真正受到嚴(yán)格管控前，自然環(huán)境中不斷富集的抗生素殘留必將誘導(dǎo)產(chǎn)生各種新類型耐藥基因，這些耐藥基因也將不可避免地通過食物鏈、水源等途徑進(jìn)入人體腸道?？股啬退幖?xì)菌的進(jìn)化和選擇受到細(xì)菌群落所處環(huán)境營養(yǎng)狀況的影響，人體腸道中的高代謝活性和高細(xì)胞密度可以促進(jìn)細(xì)菌群落進(jìn)化，因此，人體腸道是抗生素耐藥基因發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移的天然最佳場所[36-37]。

3食品中抗生素耐藥基因的檢測方法

3.1聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及其衍生技術(shù)[38]

耐藥基因的檢測方法不僅應(yīng)該有良好的敏感性和特異性，還應(yīng)有較快的速度，PCR技術(shù)可以良好地滿足上述需求。通過瓊脂糖電泳、探針雜交技術(shù)或DNA序列測定確定擴(kuò)增片段，PCR技術(shù)可以對細(xì)菌耐藥基因進(jìn)行篩查和驗(yàn)證；用限制性內(nèi)切酶將DNA進(jìn)行酶切消化，由于堿基不同會產(chǎn)生不同長度的酶切片段，經(jīng)瓊脂糖電泳分離即可與已知耐藥基因組序列進(jìn)行比對分析；經(jīng)PCR擴(kuò)增后的DNA單鏈，進(jìn)行聚丙酰胺凝膠電泳分離，根據(jù)單鏈核苷酸因序列突變或單個堿基變化導(dǎo)致電泳速率差異可判斷是否有耐藥基因突變存在。

3.2基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)又稱基因微陣列，將基因探針固定在芯片表面，用熒光標(biāo)記的靶分子與芯片上的探針分子雜交，檢測熒光信號強(qiáng)弱，可以對雜交結(jié)果進(jìn)行量化分析。

3.3核酸雜交法

提取細(xì)菌質(zhì)粒通過電泳、轉(zhuǎn)膜后用特異性耐藥基因探針雜交，根據(jù)質(zhì)粒在電泳圖譜上是否存在雜交信號可判斷質(zhì)粒上是否存在耐藥基因。Sunde等用9種抗生素耐藥基因特異性探針對10頭健康豬的正常腸道菌群進(jìn)行了分析，測定出豬腸道中的大腸埃希菌中具有sulI、sulII、dfrI、dfrIIb、dfrIX、strA-strB等耐藥基因[39]。

3.4酶切克隆法

酶切克隆法可用于檢測不確定的耐藥基因。從具有抗生素耐藥性的細(xì)菌中選擇酶切片段接入載體，通過抗生素篩選重組子獲得攜帶耐藥基因的質(zhì)粒，對該質(zhì)粒測序就可確定耐藥基因信息。

3.5全基因測序技術(shù)

[JP2]隨著測序技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用全基因組測序進(jìn)行細(xì)菌耐藥性研究已經(jīng)取得良好效果，掌握耐藥菌株的全基因序列可以深入了解耐藥基因的進(jìn)化和轉(zhuǎn)移機(jī)制。Kser等利用全基因組測序技術(shù)認(rèn)定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株是某醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房院內(nèi)感染發(fā)生的主要原因[40]。當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)技術(shù)往往無法快速鑒別MRSA菌株，全基因組測序恰好可在短時間內(nèi)提供精確信息，為耐藥機(jī)制研究提供了強(qiáng)大的工具。

4結(jié)語

我國對抗生素耐藥性的研究重點(diǎn)主要在臨床醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對食品中抗生素耐藥性的研究起步較晚。在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中濫用抗生素已經(jīng)給人類健康帶來諸多不利影響，人通過食物鏈獲得的抗生素耐藥性使得感染類疾病的病程明顯延長，菌血癥感染率和死亡率均有上升趨勢[41]。丹麥的經(jīng)驗(yàn)表明，在禁止使用預(yù)防性抗生素一段時間后，畜禽動物種群體內(nèi)細(xì)菌的抗生素耐藥性會明顯下降[42]。

我國已經(jīng)將部分食品中抗生素殘留和耐藥性試驗(yàn)納入強(qiáng)制檢測項(xiàng)目，但是對食品中種類繁多的抗生素耐藥基因尚未作系統(tǒng)性強(qiáng)制性檢測要求。面對食品中殘留抗生素耐藥基因可能帶來的食品安全和公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，需要更多的科研工作者投入食品中耐藥基因轉(zhuǎn)移的研究，推動我國的食品中殘留抗生素耐藥基因評價體系的規(guī)范化。

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