史宗勇++路超++唐中偉++趙成萍++陳衛(wèi)國++馬艷琴++袁建琴

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.080

摘要：以SD大鼠為試驗動物模型，分別飼喂含轉CP4-EPSPS基因大豆和常規(guī)大豆飼料，以轉基因大豆飼料飼喂大鼠為試驗組，常規(guī)大豆飼料飼喂大鼠為對照組，擇期進行精子畸變試驗、顯性致死試驗和致畸試驗。結果表明：試驗組和對照組相比精子畸變率無顯著差異（P>0.05），二者與陽性對照組差異顯著（P<0.05）；顯性致死試驗中試驗組與對照組胚胎死亡率無顯著差異（P>0.05）；致畸試驗中2組活胎同性別間的體質量、體長、尾長、前肢長度均無顯著差異，經(jīng)活胎外表檢查、骨骼檢查、內(nèi)臟檢查無畸形。結果說明，喂食轉CP4-EPSPS基因大豆飼料對大鼠精子畸變、胚胎致死、胎仔畸形無不良影響，不存在生殖毒性。

關鍵詞：轉CP4-EPSPS基因大豆；精子畸變；顯性致死；致畸試驗

中圖分類號： S565.101文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0286-03

收稿日期：2015-08-13

基金項目：山西省自然科學基金（編號：2013011028-2）；山西省科技攻關基金（編號：20140311025-3）。

作者簡介：史宗勇（1970—），男，山西太谷人，碩士，副教授，從事動物生理與轉基因生物安全的研究。E-mail：zongyongtg@sohu.com。1988年世界第一例轉基因大豆誕生[1]，自1996年美國首次批準Monsanto（孟山都）公司抗草甘磷轉基因大豆商業(yè)化種植19年以來，其種植面積在全球范圍內(nèi)不斷擴大，2014年全球轉基因大豆種植面積達0.90億hm2，占當年轉基因作物總面積1.815億hm2的近50%，更是占全球大豆種植面積的82%[2]。抗除草劑大豆GTS-40-3-2累計獲得26個國家和歐盟28個成員國的52次批準，是全球獲得監(jiān)管機構批準頻次最多的作物，也是應用最為廣泛的轉基因作物之一[3]。抗除草劑大豆GTS-40-3-2是在Soy-bean A5403大豆中導入從天然農(nóng)桿菌菌系CP4中分離出的具有抗草甘膦功能的EPSPS酶，使植株對草甘膦不敏感，能夠忍受正常劑量或更高劑量的草甘膦而不被殺死，從而獲得重大效益。

目前，國內(nèi)外對轉基因大豆食用性安全的研究集中在其營養(yǎng)成分方面[4-5]，而動物試驗主要集中在日常行為、臟器系數(shù)、組織病理學、血液學和血清化學等分析，大多數(shù)研究結果顯示轉基因大豆是安全的[6-7]。Qi等以復合性狀轉基因大豆（35 423×40-3-2）喂養(yǎng)SD大鼠90 d后，發(fā)現(xiàn)大鼠的臟器系數(shù)、血常規(guī)和血生化等指標存在少數(shù)顯著性差異，但這些差異與轉基因成分無關且變量數(shù)值在正常范圍內(nèi)[8]。由于近年來關于轉基因作物安全性的深入研究，轉基因食品評價的實質等同性原則受到質疑，從手性D-氨基酸（DAA）角度考量，轉基因食品和傳統(tǒng)食品的安全性不實質等同[9-10]，轉基因食品的食用安全性受到了社會和公眾的廣泛關注。

哺乳動物生殖過程中，精子的形成和胚胎的發(fā)育對外界剌激極為敏感，易受化學、環(huán)境因素的影響而發(fā)生畸變，而且這些潛在的生殖毒性對生物個體和種群的影響是長期的。當前關于轉CP4-EPSPS基因大豆致畸效應研究和報道較少。本試驗以SD大鼠為動物模型，評估喂食轉CP4-EPSPS基因大豆對大鼠生殖過程致畸性的影響，進而探討轉CP4-EPSPS基因大豆的潛在生殖毒性作用。

1材料與方法

1.1實驗動物分組及處理

雄、雌各60只30日齡SD大鼠購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心，按性別分類組群，分籠飼喂。適應性喂食7 d后，各群內(nèi)隨機取30只，喂食含轉基因大豆豆粕加工的飼料（GM組），其余30只喂食含常規(guī)大豆豆粕的飼料（CK組），按國家實驗動物飼養(yǎng)標準喂食，根據(jù)試驗進程隨機挑選大鼠進行試驗。

1.2飼料

試驗用轉基因大豆豆粕為孟山都遠東有限公司抗農(nóng)達GTS40-3-2大豆加工品，對照組常規(guī)大豆豆粕為其親本 Soy-bean A5403大豆加工品。轉基因豆粕經(jīng)農(nóng)業(yè)部轉基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗測試中心（太原）檢測確認含CP4-EPSPS外源基因。大鼠飼料委托山西醫(yī)科大學實驗動物中心加工，2種飼料組成成分配比相同，其中豆粕成分占比20%，除豆粕外其余成分來源一致，飼料經(jīng)檢測符合GB 149243—2010《實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分》要求。

1.3主要試劑與器材

磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、甲醇、伊紅、絲裂霉素C（MMC）、乙醇、氫氧化鉀、茜素紅、冰醋酸、甘油、水合氯醛、氫氧化鉀、鮑音（Bouin）氏液；生物顯微鏡、解剖刀、剪刀、鑷子、眼科剪、眼科鑷、單面刀片、注射器等。

1.4方法

1.4.1精子畸變試驗取70 d齡體質量相近的雄性大鼠共15只，其中CK組10只，平均分為2組，設為陽性對照組和正常對照組，GM組5只設為試驗組。陽性對照組大鼠腹腔注射絲裂霉素C（MMC）1.1 mg/（kg·d）連續(xù)處理5 d，給藥劑量參照傅劍云等小鼠精子致畸數(shù)據(jù)結合藥理實驗等效劑量系數(shù)折算法換算確定[11]。正常對照組和試驗組不做任何處理。處理期間和處理后各組仍按試驗設計分組進行飼喂。喂食42 d后頸椎脫臼法處死大鼠，剪開腹腔，分離并摘取雙側附睪置于生理鹽水中，用剪刀剪碎，用吸管輕輕吹打懸浮液5～6次后靜置3～5 min，用4層擦鏡紙過濾組織碎片，取濾液滴于潔凈載玻片上，均勻推片。晾干后用甲醇固定5 min，伊紅染色1 h，用水輕輕沖洗，干燥后進行鏡檢。在高倍鏡下觀察500個精子的形態(tài)，計算精子畸變率。精子畸變率=畸變精子數(shù)/總檢測精子數(shù)×100%。

1.4.2顯性致死試驗在CK組、GM組內(nèi)選取70 d齡體質量相當?shù)拇笫?，每組選取雌性15只，雄性5只，組內(nèi)按雌雄比3 ∶1交配，下午18：00同籠，次日08：00雌雄分籠，隨即沖洗雌鼠陰道制做涂片檢查精子，以查到精子為受孕0 d，受孕 21 d 剖腹取出即將分娩孕鼠的子宮，辨認子宮內(nèi)的活胎、死胎、吸收胎數(shù)。

1.4.3胚胎生長發(fā)育情況每組隨機選取顯性致死試驗雌性孕鼠3只，稱量胎鼠體質量，測體長、尾長、前肢長。將胎仔按子宮內(nèi)位置順序編號。單數(shù)的胎仔放入80%的乙醇溶液中固定5 d，用1%的氫氧化鉀溶液浸泡5 d，至肌肉透明可見骨骼，然后用茜素紅染色3 d至骨骼染成紫色，置于透明液中2 d，做骨骼畸形檢查。編號雙數(shù)的胎仔放入鮑音（Bouin）氏液中固定10 d后，取出標本用自來水洗去固定液，用單面刀片沿口經(jīng)耳做水平切面查口腔；將切下的顱頂部，沿眼球前緣垂直作額狀切面查鼻道；然后沿著眼球正中垂直作第二額狀切面，檢查眼球、腦室；沿眼球后緣垂直作第三額狀切面，檢查腦、腦室。之后沿胸、腹壁中線和肋下緣水平線作“十”字切口，暴露胸腔、腹腔及盆腔內(nèi)的器官，做內(nèi)臟畸形檢查。

2結果與分析

試驗期間，各組試驗動物活動正常，生長發(fā)育良好，被毛濃密有光澤，未見外觀體征、行為活動和飲食方面異常，也未發(fā)生死亡現(xiàn)象。

2.1轉CP4-EPSPS基因大豆對大鼠精子畸變的影響

試驗組、對照組和陽性對照組在喂食42 d后取附睪精子進行試驗，發(fā)現(xiàn)3組均有畸變精子，由圖1可知，異常精子表現(xiàn)為胖頭、雙頭及無頭等。

將精子鏡檢結果進行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，試驗組、正常對照組與陽性對照組精子畸變率具有極顯著性差異（P<0.01），說明陽性對照顯著，結果成立。試驗組和正常對照組相比，采用t檢驗P值為0.147（P>0.05），無統(tǒng)計學意義（表1）。

2.2顯性致死試驗

剖腹取出即將分娩母鼠的子宮，辨認子宮內(nèi)的活胎、死胎、吸收胎數(shù)。檢查發(fā)現(xiàn)活胎胎仔完整成形，肉紅色，能自然運動，對機械刺激有運動反應；胎盤較大呈紅色，發(fā)育正常。晚死胎胎仔完整成形、灰紅色、無自然運動，對機械刺激無反應；胎盤灰紅色、較小。吸收胎呈暗紫或淺色點塊，不能辨認胚胎和胎盤。對各受孕組統(tǒng)計分析表明：試驗組和正常對照組平均著床數(shù)（P=0.688）、胚胎死亡率（P=0.994）差異不顯著（表2）。

2.3致畸試驗

解剖母鼠子宮逐一詳細察看，行胎仔外部檢查，發(fā)現(xiàn)全部胎仔外觀檢查正常無畸形。測量活胎體質量、體長、尾長和前肢長度（圖2），各組按胎仔性別歸類，經(jīng)統(tǒng)計學分析，2組間雄性胎仔、雌性胎仔各指標t檢驗P值全部大于0.05，表明兩組間同性胎仔生長發(fā)育無顯著差異。

用放大鏡檢查處理好的胎仔骨骼透明標本，可見試驗組、對照組均有少數(shù)胸骨、顱骨發(fā)育不全，肋骨、椎骨、四肢骨數(shù)量正常，各骨形態(tài)、大小未見異常。

經(jīng)內(nèi)臟檢查，發(fā)現(xiàn)活胎仔口腔無腭裂、舌缺或分叉；鼻道無擴大、單鼻道等畸形；眼球形態(tài)正常成雙；無腦水腫積水，無腦室擴大；胸腔、腹腔內(nèi)心臟和呼吸、消化、泌尿、生殖等主要器官數(shù)目、形態(tài)、位置無異常，大小勻稱無異常。內(nèi)臟檢查無畸形。

3討論與結論

精子畸變試驗通過觀察精子形態(tài)的變化，檢測受試物對實驗動物精子形成過程的影響，在可引起生殖細胞遺傳性損傷的因素作用下，動物睪丸產(chǎn)生的畸形精子數(shù)可大量增加，雄性動物接觸受試物后精子畸變率的改變，可反映該受試物的生殖毒性和對生殖細胞的致突變性。試驗結果發(fā)現(xiàn)，試驗組精子畸變率2%，處于大鼠的精子正?；兎秶?.8%～3.4%[12]，與對照組相比亦無明顯差異，表明喂食含轉CP4-EPSPS基因大豆飼料不會影響實驗大鼠的精子畸形率，與張奕等對轉GL融合蛋白基因大米對SD大鼠的亞慢性毒性試

驗研究的精子畸變結果[13]一致。本試驗精子畸變結果也與蘆春斌等喂食轉基因大豆對小鼠精子存活率與畸形率影響的研究結果[14]相似。

顯性致死試驗通過觀察大鼠胚胎死亡情況，檢測受試物誘發(fā)哺乳動物生殖細胞的染色體畸變，反映受試物對哺乳動物生殖細胞的致突變性。試驗結果顯示，試驗組與對照組的平均著床數(shù)和胚胎死亡率均無顯著差異，表明CP4-EPSPS基因大豆未導致實驗大鼠染色體結構異?；蛉旧w數(shù)目變化。蘆春斌等研究也表明，喂食轉基因大豆對大鼠早期胚胎發(fā)育無不良影響[15]。

致畸試驗是應用實驗動物鑒定外來受試物致畸性的試驗，母體在孕期如受到可通過胎盤屏障的有害物質作用，就會影響胚胎的正常發(fā)育與器官分化，導致胚胎結構和機能的缺陷，表現(xiàn)出畸胎，從而檢測受試物導致胚胎結構畸形及生長遲緩等毒性作用。參考余夢瑤等對轉基因棉籽殼栽培毛木耳安全性評價時采用在動物的器官敏感期進行染毒的檢測方法對轉基因大豆進行檢測[16]。試驗未發(fā)現(xiàn)轉基因大豆對胎鼠的形成、發(fā)育、外觀、骨骼及內(nèi)臟等有致畸作用。本試驗結果與張珍譽等對轉Bt基因稻谷的研究結果[17]相同。

本試驗研究結果表明，喂食轉CP4-EPSPS基因大豆飼料對雄性大鼠精子畸變、孕鼠胚胎致死、胎仔畸變效應無明顯影響，說明轉CP4-EPSPS基因大豆對大鼠無明顯生殖毒性。

參考文獻：

[1]Hinchee M W，Connor-Ward D V，Newell C A，et al. Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer[J]. Biotechnology，1988（6）：915-922.

[2]劉定富. 圖解全球轉基因作物商業(yè)化[EB/OL]. （2015-03-17）[2015-08-6]. http：//www.agrogene.cn/info-2321.shtml.

[3]James C.2014年全球生物技術/轉基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J]. 中國生物工程雜志，2015，35（1）：1-14.

[4]Novak W K，Haslberger A G. Substantial equivalence of antinutrients and inherent plant toxins in genetically modified novel foods[J]. Food and Chemical Toxicology，2000，38（6）：473-483.

[5]朱元招，王鳳來，尹靖東. 抗草甘膦大豆及豆粕營養(yǎng)成分和抗營養(yǎng)因子研究[J]. 營養(yǎng)學報，2010，32（2）：178-182.

[6]張力，程呈，何寧，等. 轉基因高油酸大豆對大鼠的亞慢性毒性研究[J]. 毒理學雜志，2011，25（5）：391-394.

[7]Dolaǐchuk O P，F(xiàn)edoruk R S，Kovalchuk I I. The impact of components of conventional and genetically modified soybeans on parameters of the immune and reproductive systems in female rats[J]. Fiziolohichnyi Zhurnal，2013，59（2）：65-70.

[8]Qi X，He X，Luo Y，et al. Subchronic feeding study of stacked trait genetically-modified soybean （35423 × 40-3-2） in Sprague-Dawley rats[J]. Food and Chemical Toxicology，2012，50（9）：3256-3263.

[9]Magaa-Gómez J A，de la Barca A M. Risk assessment of genetically modified crops for nutrition and health[J]. Nutrition Reviews，2009，67（1）：1-16.

[10]張志昆，袁龍飛，劉慶菊，等. 基于手性D-氨基酸的毒理性對轉基因食品安全性的研究[J]. 中國科學：化學，2015，45（1）：98-108.

[11]傅劍云，趙碩，徐彩菊，等. 甲基磺酸甲酯、環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C對小鼠畸形影響的研究[J]. 癌變·畸變·突變，1998，10（4）：223-226.

[12]王岳飛. 茶兒茶素制劑毒理學安全性評價與保健功效研究[D]. 杭州：浙江大學，2004.

[13]張奕，董英，周興華，等. 轉GL融合蛋白基因大米的急性毒性與遺傳毒性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2012，40（3）：268-271.

[14]蘆春斌，周文，劉標. 喂食轉基因大豆對子代雄鼠生殖系統(tǒng)的影響[J]. 大豆科學，2013，32（1）：119-123.

[15]蘆春斌，鄭建新，蔡娟，等. 轉基因大豆對雌鼠胚胎發(fā)育及受精能力的影響[J]. 大豆科學，2014，33（4）：578-582.

[16]余夢瑤，鄭林用，許曉燕，等. 轉基因棉籽殼栽培毛木耳的安全性評價初報[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報，2010，23（3）：644-649.

[17]張珍譽，顏亨梅. 轉Bt基因稻谷對小鼠生理與生殖的影響[J]. 激光生物學報，2011，20（1）：50-53.鐘翠紅，安永福，常雙雙，等. 運輸應激對育成奶牛血液生化免疫指標影響及中草藥調(diào)控研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016，44（10）：289-290.