熱水與贛南臍橙皮對(duì)意大利青霉孢子的致死作用

劉姬欒++閔偉恩++林麗萍

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.107

摘要：為驗(yàn)證熱水處理贛南臍橙預(yù)防贛南臍橙青霉病害的有效性，對(duì)熱水與臍橙皮共同處理對(duì)意大利青霉孢子致死作用進(jìn)行了研究，以不加贛南臍橙皮的同樣熱水處理的意大利青霉孢子為對(duì)照，采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)霉菌孢子死亡率；用蝸牛酶去除霉菌孢子壁制備原生質(zhì)體，經(jīng)Hoechst 33342/PI雙熒光染色法染色，檢測(cè)霉菌孢子細(xì)胞膜損傷程度。結(jié)果顯示，55 ℃ 8 min處理組的霉菌孢子死亡率為（88±2.12）%，對(duì)照組霉菌孢子死亡率為（60±2.78）%；熒光染色結(jié)果顯示熱處理組有更多的原生質(zhì)體細(xì)胞膜受到了破壞。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，熱水與贛南臍橙皮成分對(duì)意大利青霉孢子有協(xié)同抑殺作用。

關(guān)鍵詞：贛南臍橙皮；熱水處理；意大利青霉孢子；致死作用

中圖分類號(hào)：TS205 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0367-02

收稿日期：2015-11-29

基金項(xiàng)目：江西省教育廳青年基金（編號(hào)：GJJ14315）；江西農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201410410043）。

作者簡(jiǎn)介：劉姬欒（1992—），女，江西吉安人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：349401861@qq.com。

通信作者：林麗萍，碩士，講師，主要從事食品微生物方向的教學(xué)與研究。E-mail：jialin1543@163.com。柑橘采后極易遭受意大利青霉與指狀青霉污染，引起柑橘青、綠霉病害[1]，這2種霉菌繁殖速度非?？?，正常自然條件下，它們主要靠產(chǎn)生大量的無(wú)性孢子進(jìn)行繁殖。熱處理（35～55 ℃）這種物理保鮮方法，可延長(zhǎng)采后果蔬的貨架期[2]，還可以適當(dāng)調(diào)整果肉品質(zhì)，增加一定糖分[3]，因其無(wú)污染、無(wú)殘留、安全環(huán)保等特點(diǎn)而受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注[4-5]。熱處理包括熱水處理、熱空氣處理和蒸汽加熱法[6]。熱水沉浸處理相較于熱空氣保鮮處理，操作更簡(jiǎn)便，方法更易獲得，所以試驗(yàn)選熱水處理為研究方法。

前期試驗(yàn)結(jié)果證明熱水與贛南臍橙皮共同處理柑橘青霉孢子可降低其生活力[7]。所以，熱與橙皮共同作用可能會(huì)對(duì)霉菌孢子結(jié)構(gòu)造成損傷。細(xì)胞死亡或者壞死是正常的細(xì)胞受到各種損傷或者細(xì)菌病毒的感染導(dǎo)致的不正常死亡，是病理性的，會(huì)有細(xì)胞壁破裂、內(nèi)含物外泄的現(xiàn)象，是由外界條件引起的。熒光Hoechst 33342/PI雙染色試劑染色法，結(jié)合了細(xì)胞膜通透低毒的Hoechst 33342染料與無(wú)法進(jìn)入正常細(xì)胞膜的PI核熒光染料，可以準(zhǔn)確判斷熱水處理是否破壞霉菌細(xì)胞膜的完整性。為去除細(xì)胞壁障礙，試驗(yàn)選用具有代表性的酶用量為研究霉菌孢子去壁的條件，優(yōu)選出適合的酶用量。

本試驗(yàn)以對(duì)環(huán)境耐受性更好的意大利青霉孢子為研究對(duì)象，采用熱水與贛南臍橙皮共同處理意大利青霉孢子，平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)其死亡率及Hoechst 33342/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性，探究熱水與贛南臍橙皮共同處理對(duì)意大利青霉的致死作用，為揭示熱處理抑殺柑橘青霉病原菌的機(jī)制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病原菌意大利青霉（Penicillium italicum）為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2贛南臍橙紐荷爾臍橙。果實(shí)大小、成熟度均勻一致，表皮完好，無(wú)傷口。

1.1.3主要培養(yǎng)基及試劑PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，瓊脂20 g，pH值自然，121 ℃滅菌 20 min。作病原菌的活化、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)用。

蝸牛消化酶（90 U/g，上海研域生物科技有限公司）；Hoechst33342/PI雙染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.4主要儀器自動(dòng)立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40B型，上海申安醫(yī)療器械廠）；生化培養(yǎng)箱（SHP-160型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；水浴恒溫振蕩器（SHY-2型，金壇市精達(dá)儀器制造廠）；數(shù)顯恒溫循環(huán)水浴鍋（HH-6型，國(guó)華電器有限公司）；漩渦混合器（Vortex-Genie2型，上海琪特分析儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（HC-2518R型，安徽中科中佳學(xué)儀器有限公司）；熒光顯微鏡（ZEISS Ver.A1型，德國(guó)卡爾蔡司光學(xué)儀器公司）；數(shù)碼生物顯微鏡（BK5000型，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1意大利青霉孢子懸液制備刮取經(jīng)過(guò)活化復(fù)壯[8-9]的意大利青霉菌，轉(zhuǎn)入加有玻璃珠和50 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，充分振蕩，菌懸液經(jīng)2～3層的無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾于另一個(gè)無(wú)菌三角瓶中，得到霉菌孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)，對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂?，保證懸液孢子濃度為n×108個(gè)/mL（n<10）。

1.2.2意大利青霉孢子熱水處理方法用涼開(kāi)水清洗新鮮橙子，用次氯酸對(duì)其表面消毒并清洗。橙子瀝干水后，用 3 mm 無(wú)菌打孔器獲得大小均勻的橙皮。處理組：將20片臍橙皮加入到新制備的10 mL霉菌孢子懸液中，將加橙皮的菌懸液放入不同溫度水浴鍋，同時(shí)做溫度指示，待溫度指示達(dá)到處理溫度，開(kāi)始計(jì)時(shí)，然后移出至冰浴，使溫度降至10 ℃以下。不加贛南臍橙皮的同樣熱水處理的意大利青霉孢子為對(duì)照組，檢測(cè)霉菌孢子死亡率并進(jìn)行熒光染色。

1.2.3意大利青霉孢子去壁條件研究取未加臍橙皮熱水處理后的霉菌孢子懸液5 mL，8 000 r/min離心8 min，去除上清液，加入滲透壓穩(wěn)定劑（0.1 mol /L pH值5.5～6.0磷酸緩沖液配制0.7 mol/L NaCl）5 mL，分別加蝸牛酶液（10 mg/mL，以滲透壓穩(wěn)定劑配制）15、35、55、75 μL，置恒溫振蕩器50～60 r/min、33 ℃振蕩酶解3 h[10]。觀察酶解后孢子形態(tài)的變化，并記錄。以未進(jìn)行熱處理的霉菌孢子懸液為對(duì)照組。

1.2.4熱水與臍橙皮處理的意大利青霉孢子死亡率將熱水處理后的霉菌孢子懸液做梯度稀釋，用移液槍分別取菌懸液200 μL于PDA平板上，涂勻，放入30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)72 h左右，待霉菌長(zhǎng)至清晰可見(jiàn)時(shí)，觀察并記錄霉菌孢子菌落數(shù)，計(jì)算其死亡率。

死亡率 = （未熱處理平板菌落數(shù)-熱處理平板菌落數(shù)）/未熱處理平板菌落數(shù)×100%（相同稀釋倍數(shù)下）

1.2.5熱水與臍橙皮處理的意大利青霉孢子原生質(zhì)體熒光染色取熱水處理的霉菌孢子懸液，加入一定量的蝸牛酶液，放置于恒溫振蕩器50～60 r/min、33 ℃振蕩酶解3 h。按Hoechst 33342/PI雙熒光染色試劑盒步驟對(duì)原生質(zhì)體染色，取1滴染色后的原生質(zhì)體懸液于載玻片，熒光顯微鏡觀察。

2結(jié)果與分析

2.1霉菌孢子去壁條件的研究

由圖1可見(jiàn)，當(dāng)蝸牛酶液用量為35 μL時(shí)，開(kāi)始產(chǎn)生一定量的原生質(zhì)體，蝸牛酶液用量達(dá)到55 μL時(shí)，產(chǎn)生大量原生質(zhì)體，蝸牛酶液用量為75 μL時(shí)，出現(xiàn)了酶解過(guò)度現(xiàn)象，產(chǎn)生了很多變形增大的原生質(zhì)體。熱處理與未熱處理對(duì)照組，蝸牛酶去壁效果沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明熱處理對(duì)于蝸牛酶解條件沒(méi)有影響，所以后續(xù)試驗(yàn)霉菌孢子去壁蝸牛酶用量選擇 55 μL。

2.2熱水與臍橙皮對(duì)意大利青霉孢子死亡率的影響

由圖2可見(jiàn)，加了臍橙皮熱水處理組的意大利青霉孢子死亡率明顯高于對(duì)照組孢子死亡率。55 ℃、8 min處理霉菌孢子死亡率最高，處理組孢子死亡率為（88±2.12）%，對(duì)照組孢子死亡率為（60±2.78）%。

2.3熱水與臍橙皮處理對(duì)意大利青霉孢子細(xì)胞膜的影響

試驗(yàn)以熱致死效率最高的55 ℃、8 min熱處理?xiàng)l件，進(jìn)一步研究熱水與臍橙皮對(duì)意大利青霉孢子細(xì)胞膜的影響。對(duì)熱處理后的意大利青霉孢子原生質(zhì)體熒光雙染色后，從結(jié)果可以看出，對(duì)照組的原生質(zhì)體熒光染色中有大量藍(lán)色熒光（圖3-A），說(shuō)明霉菌孢子原生質(zhì)體還保持一定活性或逐漸走向凋亡；處理組的原生質(zhì)體出現(xiàn)大量紅色熒光（圖3-B），說(shuō)明經(jīng)過(guò)熱處理霉菌孢子多數(shù)已經(jīng)走向死亡，成壞死細(xì)胞。綜合霉菌孢子死亡率結(jié)果，說(shuō)明熱水與贛南臍橙皮對(duì)意大利孢子有協(xié)同抑殺作用。

3結(jié)論與討論

現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)于霉菌去壁研究大多是針對(duì)霉菌營(yíng)養(yǎng)體的，而本試驗(yàn)所用孢子材料與營(yíng)養(yǎng)體不同。蝸牛酶的用量是去壁條件的決定性因素，所以優(yōu)選這個(gè)條件作為去壁依據(jù)。而優(yōu)化霉菌孢子去壁條件，除了本試驗(yàn)考慮蝸牛酶液量，還可以從霉菌的菌齡、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解菌量等因素考慮，結(jié)合這些因素得到更完整的去壁最優(yōu)條件，值得后期繼續(xù)探索。

熒光染料Hoechst 33342能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜，使其染上淺藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞膜通透性增加，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞的Hoechst 33342比正常細(xì)胞多，熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞高。而PI染料不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞中，即活細(xì)胞對(duì)PI拒染，而壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已被破壞，可被PI染料染色。根據(jù)這些特點(diǎn)，用Hoechst 33342結(jié)合

PI染料對(duì)凋亡細(xì)胞雙染色，可以進(jìn)一步借助于流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞進(jìn)行定量。

本試驗(yàn)在沒(méi)有流式細(xì)胞儀的情況下，采用了簡(jiǎn)便易行的定量方法——平板菌落計(jì)數(shù)法，測(cè)定熱處理后霉菌孢子的死亡率，結(jié)合熒光染色結(jié)果，充分證明了熱水與臍橙皮共同處理破壞了霉菌孢子的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，徹底造成了大部分霉菌孢子死亡。后續(xù)將進(jìn)一步研究該熱處理?xiàng)l件對(duì)贛南臍橙品質(zhì)的影響，深入研究熱處理抑制意大利青霉的具體機(jī)制，期望能夠更全面地了解贛南臍橙熱處理保鮮機(jī)制。

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