侯立娟++丁成龍++林金盛++宋金俤++曲紹軒++李輝平++蔣寧++李鳳玉++馬林
doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.129
摘要:為解決秸稈飼料化轉(zhuǎn)化中消化率低的難題,開(kāi)發(fā)秸稈分解與軟化技術(shù),優(yōu)先分解纖維素和半纖維素,促進(jìn)秸稈資源的飼料化利用與推廣,以真菌菌株為中間載體,以小麥秸稈為原料,將秸稈轉(zhuǎn)化為菌絲體飼料,并進(jìn)行秸稈飼料化規(guī)模生產(chǎn)的效果評(píng)價(jià)研究。以顯色反應(yīng)和生長(zhǎng)速度為指標(biāo)進(jìn)行菌株初篩,篩選發(fā)菌生長(zhǎng)速度快并且適合規(guī)?;a(chǎn)菌絲體飼料的菌株,并進(jìn)一步對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),篩選降解纖維素和半纖維素能力強(qiáng)的菌株,為菌絲體飼料規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明,紅平菇具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)速度,在Bavendamm平板上和RB亮藍(lán)平板上生長(zhǎng)速度最快,分別在6 d和9 d長(zhǎng)滿平板,紅平菇對(duì)麥秸的纖維素降解率高達(dá)54.8%,粗蛋白降解率高達(dá)86.58%,以紅平菇開(kāi)發(fā)的菌絲體飼料具有較好的應(yīng)用效果。
關(guān)鍵詞:麥草;紅平菇;降解;菌絲體蛋白
中圖分類(lèi)號(hào): S816.5+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2016)10-0448-03
收稿日期:2015-12-03
基金項(xiàng)目:2015年江蘇省“博士-企業(yè)集聚計(jì)劃”項(xiàng)目;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào):CX(13)5012、CX(12)1002];江蘇省自然科學(xué)基金青年基金(編號(hào):BK20140742);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金(編號(hào):CARS24)。
作者簡(jiǎn)介:侯立娟(1981—),女,吉林松原人,博士,副研究員,從事食用菌栽培和菌糠綜合利用研究。E-mail:mybailinggu@126.com。我國(guó)年產(chǎn)各類(lèi)秸稈約9億t,除部分機(jī)械還田外,大部分被焚燒,用作飼料的不足10%,秸稈利用率不高,國(guó)家和地方政府開(kāi)始重視秸稈的綜合利用[1]。秸稈作為農(nóng)作物的主要副產(chǎn)品,是一種重要的可再生資源,秸稈綜合利用中,將秸稈轉(zhuǎn)化為反芻動(dòng)物可利用飼料具有較高價(jià)值。隨著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展,畜牧飼料所需粗蛋白缺口龐大,開(kāi)發(fā)高品質(zhì)的秸稈飼料具有極廣闊的市場(chǎng)前景。 本試驗(yàn)采用室內(nèi)分析和室外栽培相結(jié)合的方法,選出8種適合用小麥秸稈栽培的不同菌株為試驗(yàn)材料,采用Bavendamm顯色、RB亮藍(lán)顯色反應(yīng)進(jìn)行初篩降解木質(zhì)纖維素能力強(qiáng)的菌株,再結(jié)合室外栽培試驗(yàn),縮小并鎖定優(yōu)良菌株,通過(guò)營(yíng)養(yǎng)成分分析和降解指標(biāo)確定在小麥秸稈上具有高效降解木質(zhì)纖維素的專(zhuān)一品種,為開(kāi)發(fā)秸稈飼料奠定理論基礎(chǔ),同時(shí)為麥草資源化利用提供有效途徑。
1材料與方法
1.1菌株
適合小麥秸稈生料栽培的菌株共8個(gè),包括紅平菇、雜3、蘇5、雞腿1號(hào)、雞腿2號(hào)、棕蘑、雙孢蘑菇W2000和W192。均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所食用菌項(xiàng)目組提供。
1.2栽培配方
栽培基質(zhì)組成為:80%小麥秸稈、10%餅肥和10%麩皮。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1菌株培養(yǎng)方法
1.3.1.1菌種活化供試菌株在PDA培養(yǎng)基的斜面上接種進(jìn)行活化培養(yǎng)。被活化了的菌種再接種于PDA培養(yǎng)基平板上,25 ℃培養(yǎng),7 d后備用。
1.3.1.2菌絲的顯色試驗(yàn)(1)PDA-Bavendamm 顯色試驗(yàn)(漆酶鑒定培養(yǎng)基):在純培養(yǎng)中,加入0.4 mmol/L的鞣酸,pH值5.5,用打孔器制成菌塞,定量接種于平板上,25 ℃條件下培養(yǎng)。記錄菌落周?chē)袩o(wú)褐色輪環(huán)產(chǎn)生及顯色程度,有褐色輪環(huán)者記為“+”,反之記為“-”,并記錄顯色時(shí)間和顯色程度[2]。(2)PDA-RB亮藍(lán)顯色法(過(guò)氧化物酶鑒定培養(yǎng)基):將625 mg/L RB 亮藍(lán)單獨(dú)滅菌后,在無(wú)菌條件下,與PDA 培養(yǎng)基混勻,制成PDA-RB 亮藍(lán)平板,接種后25 ℃培養(yǎng),觀察記錄平板上有無(wú)黃色輪環(huán)產(chǎn)生,有黃色輪環(huán)記為“+”,反之記為“-”,并記錄顯色時(shí)間和顯色程度[3]。
1.3.1.3菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)量方法用打孔器在PDA培養(yǎng)基上打孔,然后將菌餅接種在70 mm的PDA 培養(yǎng)基上,接種 1~2 d菌絲已經(jīng)定植并正常生長(zhǎng)時(shí),以菌餅為中心,沿菌絲生長(zhǎng)的前沿劃“十”字線,2條線之間的距離與時(shí)間之比即為菌絲生長(zhǎng)速度(mm/d)。
1.4培養(yǎng)料建堆發(fā)酵
按照“1.2”節(jié)介紹的配方進(jìn)行備料,小麥秸稈必須新鮮、無(wú)霉、無(wú)蟲(chóng)。將小麥秸稈鍘成長(zhǎng)5~8 cm,餅肥進(jìn)行粉碎后備用。將小麥秸稈用1%石灰水預(yù)濕4 d,盡量讓培養(yǎng)料浸透水分。按照1層小麥秸稈、1層麩皮、1層餅肥的順序在日光溫室進(jìn)行建堆,建堆高度約1.5 m,堆寬約1.6 m,長(zhǎng)度依場(chǎng)地和培養(yǎng)料總量而定。培養(yǎng)料的水分控制在65 %左右,可邊建堆邊淋水。建堆完畢和每次翻堆后都要打孔通氣,可以在料堆的兩側(cè)或上部進(jìn)行打孔,以利通氣好氧發(fā)酵。
建堆后觀察料溫,達(dá)到65 ℃進(jìn)行第1次翻堆,將培養(yǎng)料上下、內(nèi)外顛倒。料溫再次升到60 ℃時(shí)第2次和第3次翻堆,建堆的時(shí)間隨著季節(jié)、氣溫的高低和培養(yǎng)料的多少等靈活掌握,如果氣溫過(guò)低,可在料堆上覆蓋1層薄膜。一般翻堆5~7次,堆料時(shí)間約30 d。發(fā)酵好的料呈深棕色,含水量在65%左右,pH值為 7或略高。在料中外層出現(xiàn)灰白色的高溫放線菌,培養(yǎng)料不黏手且有彈性,小麥秸稈有一定的拉力,說(shuō)明發(fā)酵正常。
1.5裝袋、接種
栽培用的出菇袋根據(jù)生產(chǎn)季節(jié)選用寬17、20 cm或 22 cm 的聚乙烯料袋,袋厚度為2.5~5 μm,袋長(zhǎng)40~50 cm,在夏季或早秋進(jìn)行打包生產(chǎn)時(shí),由于溫度較高,一般選用較小口徑的袋子,防止內(nèi)部溫度不易散發(fā)造成菌絲受高溫而“燒”死。裝袋的同時(shí)進(jìn)行接種,菌種扒成玉米粒到豌豆粒大小,裝袋時(shí)先在筒袋中加入1層菌種,裝入約1/3袋高的培養(yǎng)料,播入第2層菌種,然后再裝入約1/3袋高的培養(yǎng)料,播入第3層菌種,然后將培養(yǎng)料裝滿袋,播入第4層菌種,播種量約為15%,袋口用扎繩扎上,在菌袋外側(cè)接種層的部位用縫衣針轉(zhuǎn)圈刺20個(gè)左右的孔,以利排熱和散氣。
1.6菌絲培養(yǎng)
接過(guò)種的菌袋,有條件的放置于整潔、通風(fēng)、干燥的培養(yǎng)室中培養(yǎng),發(fā)菌環(huán)境20~25 ℃。溫度較高時(shí)及時(shí)通風(fēng)降溫,經(jīng)常檢查菌袋,防止袋內(nèi)溫度超過(guò)33 ℃燒死菌種,溫度超過(guò)30 ℃時(shí)要及時(shí)疏散袋子使之盡快散熱降溫。發(fā)現(xiàn)有污染菌袋應(yīng)及時(shí)將其清除,一般30 d左右菌絲發(fā)滿,不同菌株的生長(zhǎng)特性不同,發(fā)菌速度也不同。
1.7營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定
培養(yǎng)料按照固定配方配制后,在堆料過(guò)程中取樣,本次試驗(yàn)在堆料后0 d,在培養(yǎng)料堆料后13 d以及在不同菌株發(fā)滿菌絲后取樣,分別測(cè)定培養(yǎng)料不同階段的干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、碳、氮、磷及鈣含量。樣品營(yíng)養(yǎng)成分分析均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所完成。
2結(jié)果與分析
2.1PDA-Bavendamm和RB亮藍(lán)平板顯色反應(yīng)
Bavendamm平板顯色反應(yīng)是判斷微生物是否能分泌漆酶并降解木質(zhì)素的一種方法,其原理是:菌株如果能產(chǎn)該酶,則會(huì)與培養(yǎng)基中的酚類(lèi)化合物起反應(yīng),菌落的周?chē)鷷?huì)形成棕褐色輪環(huán),呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)[2]。
RB亮藍(lán)平板變色反應(yīng)用來(lái)判斷微生物是否能分泌過(guò)氧化物酶并降解木質(zhì)素的原理是:菌株如果能產(chǎn)該酶,則會(huì)與RB亮藍(lán)反應(yīng),使得RB亮藍(lán)轉(zhuǎn)變成橙黃色,呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)[3]。
本試驗(yàn)中對(duì)8個(gè)供勢(shì)菌株進(jìn)一步通過(guò)2種顯色反應(yīng)比較結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)觀察可以看出,8個(gè)菌株在Bavendamm顯色反應(yīng)和RB顯色反應(yīng)中,均能呈現(xiàn)顯色反應(yīng),說(shuō)明各菌株都具有產(chǎn)生漆酶和過(guò)氧化物酶的能力,但是不同菌株之間在顯色時(shí)間及顯色程度上差異顯著。
在PDA-Bavendamm平板(1號(hào)培養(yǎng)基)上,同樣是側(cè)耳類(lèi),紅平菇的菌株顯色反應(yīng)最快,5 d時(shí)已經(jīng)呈現(xiàn)明顯的顯色圈,隨后顏色逐漸加深,其次是蘇5和雜3。雙孢蘑菇類(lèi)在 5 d 開(kāi)始顯色,隨后顏色隨之加深;雞腿菇類(lèi)在7 d時(shí)開(kāi)始顯色。 在RB顯色和W2000平板上(2號(hào)培養(yǎng)基),棕蘑直到 10 d 才開(kāi)始顯色,雞腿菇3號(hào)和W2000在5 d開(kāi)始顯色,其他菌株在3 d均已開(kāi)始顯色,尤其是紅平菇、蘇5和雞腿菇2號(hào)的顯色圈的顏色加深相對(duì)比較快。因此,可以說(shuō)明平菇類(lèi)的3個(gè)菌株的漆酶和過(guò)氧化物酶活性較強(qiáng),可以初步判定,這3個(gè)菌株是可以用作降解小麥秸稈的優(yōu)勢(shì)菌株。
2.2不同菌株生長(zhǎng)量的測(cè)定
菌株生長(zhǎng)量的高低用其在PDA固體培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度來(lái)表示,而菌絲生長(zhǎng)速度的測(cè)定常采用菌落直徑測(cè)定法[4],通過(guò)測(cè)定菌落在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的直徑確定不同菌株的生長(zhǎng)速度,8個(gè)菌株在25 ℃條件下培養(yǎng),跟據(jù)不同菌株在2種顯色平板上的生長(zhǎng)速度進(jìn)行定期測(cè)定(3 d或5 d),以其中多數(shù)菌株長(zhǎng)滿平板的時(shí)間為最終測(cè)量周期。
通過(guò)在2種培養(yǎng)基上的菌落直徑確定8個(gè)菌株的生長(zhǎng)速度,所有菌株均在10月22日接種在直徑為7 cm的平皿中,分別接種在2種培養(yǎng)基上,各處理5次重復(fù)。各菌株在25 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),記錄8個(gè)菌株菌絲長(zhǎng)滿平皿的時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個(gè)菌株在2種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度不同,即使同一培養(yǎng)基上,8個(gè)菌株的生長(zhǎng)速度也不同。
由表2可以看出,在PDA-Bavendamm培養(yǎng)基上,不同菌株的生長(zhǎng)速度不同,以平菇類(lèi)的菌絲生長(zhǎng)速度為最快,其次是雞腿菇類(lèi),雙孢蘑菇類(lèi)的菌絲生長(zhǎng)速度最慢。從菌絲的生長(zhǎng)速度上比較,紅平菇菌株生長(zhǎng)速度最快,在接種后6 d就已長(zhǎng)滿這個(gè)平板,其生長(zhǎng)速度平均為11.67 mm/d,其次是蘇5,接種后8 d長(zhǎng)滿平板,其平均生長(zhǎng)速度為8.5 mm/d,然后是菌株雜3在 10 d 長(zhǎng)滿平板,其平均生長(zhǎng)速度為7 mm/d;雞腿菇2號(hào)需要13 d長(zhǎng)滿平板,雞腿菇3號(hào)需要24 d長(zhǎng)滿平板。直到檢測(cè)到24 d時(shí),3個(gè)雙孢蘑菇的菌絲都未長(zhǎng)滿平板,以棕蘑菌株生長(zhǎng)速度相對(duì)較快。生長(zhǎng)速度較快的菌株能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量菌絲體生物量,而大量的菌絲體生物量是產(chǎn)酶的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此,選擇一定時(shí)間內(nèi)生物量高的菌株是篩選高效菌株的重要措施之一。本試驗(yàn)證明紅平菇菌株生長(zhǎng)速度最快,說(shuō)明菌絲體生物量最大,產(chǎn)酶活性越高的紅平菇相應(yīng)降解木質(zhì)素的能力越強(qiáng),所以紅平菇菌株降解能力最強(qiáng);雞腿菇類(lèi)的菌株比雙孢蘑菇類(lèi)的菌株降解木質(zhì)纖維素能力強(qiáng)。
不同菌株在PDA-RB培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度見(jiàn)表3。不同的菌株在2號(hào)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度表現(xiàn)不同,接種9 d測(cè)量菌絲的生長(zhǎng)速度時(shí),平菇類(lèi)的3個(gè)菌株均已長(zhǎng)滿平板,相同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量菌絲的生長(zhǎng)速度,還是以紅平菇的生長(zhǎng)速度最快。其次是雞腿菇2號(hào),12 d長(zhǎng)滿平板,雞腿菇3號(hào),16 d長(zhǎng)滿平板,雙孢蘑菇類(lèi)的3個(gè)菌株生長(zhǎng)速度較慢。
2.3不同處理物料的營(yíng)養(yǎng)成分比較
將篩選出來(lái)的紅平菇、棕蘑及雞腿菇2號(hào)3個(gè)菌株接種在相同的小麥秸稈基質(zhì)上,分別于建堆的0 d、13 d及不同菌株接種后直至菌絲發(fā)滿菌袋的時(shí)間測(cè)定干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、碳含量、氮含量及微量元素磷和鈣的含量。
由表4可見(jiàn),干物質(zhì)隨著發(fā)菌時(shí)間的延長(zhǎng),不同菌株均呈增加的趨勢(shì),雞腿菇2號(hào)、棕蘑、紅平菇的發(fā)滿菌絲期比初始建堆期的干物質(zhì)分別增加1.36%、0.45%、2.48%;粗蛋白的含量呈增加趨勢(shì),與初始建堆期相比,雞腿菇2號(hào)、棕蘑、紅平菇蛋白的含量分別增加32.24%、88.85%、86.58%,各菌株粗蛋白的含量與初始值相比,均達(dá)到了1%顯著水平,以紅平菇和棕蘑的含量相對(duì)較高。
粗脂肪的變化,只有紅平菇呈增加趨勢(shì),增加16.36%,其他2個(gè)品種呈下降趨勢(shì),雞腿菇2號(hào)下降52.73%;棕蘑下降13.33%。各菌株粗纖維隨著發(fā)菌期的延長(zhǎng)呈降解加快的趨勢(shì),雞腿菇2號(hào)、棕蘑、紅平菇發(fā)滿菌絲后對(duì)粗纖維的降解率分別達(dá)到58.36%、53.38%、54.80%,3個(gè)菌株的粗脂肪和粗纖維含量的變化均達(dá)到了1%顯著水平,其中均以紅平菇>棕蘑>雞腿菇為變化趨勢(shì)。
微量元素P和 Ca含量隨著發(fā)菌期的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì),不同的菌株增加的幅度不同,棕蘑P 含量增加最多并達(dá)到了1%顯著水平,增加達(dá)181.42%;其次是紅平菇,增加達(dá)14427%,雞腿菇2號(hào)P的含量增加最少,為82.21%;Ca含量以雞腿菇2號(hào)增加最多,與其他2個(gè)處理比較,達(dá)到了1%顯著水平,增加達(dá)64.67%;其次是棕蘑,增加46.11%,相對(duì)較少的是紅平菇,增加27.54%。
隨著菌絲發(fā)菌時(shí)間的延長(zhǎng),C含量呈現(xiàn)大幅度被降解利用的趨勢(shì),N含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),不同菌株增加或減少的幅度不同。紅平菇對(duì)C 降解的幅度最大,達(dá)49.34%;棕蘑和雞腿菇2號(hào)降解的幅度相近,分別為 34.44% 和34.37%;N含量的增加以棕蘑、紅平菇、雞腿菇2號(hào)依次遞減,分別增加90.00%、87.86%、35.00%。
3討論
栽培食用菌的菌糠常以棉籽殼、鋸木屑、稻草、麥秸、玉米芯、甘蔗渣等多種農(nóng)作物秸稈及工業(yè)廢物為主要原料。菌糠粗蛋白含量明顯提高,粗纖維含量顯著下降,不僅可以變廢為寶,促進(jìn)資源的再次利用,而且可以降低飼料成本,提高經(jīng)濟(jì)效益[5]。目前有關(guān)食用菌栽培后的菌渣在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用已有大量報(bào)道,如作為奶牛、肉兔、鵝、肉雞、豬等飼料,具有降低飼料成本、提高經(jīng)濟(jì)效益的作用[6],本研究?jī)H從菌絲體飼料化的角度,以提高麥秸稈的營(yíng)養(yǎng)和適口性為主要目的,通過(guò)篩選適合生產(chǎn)菌絲體飼料的菌株,以真菌菌株為中間載體,將秸稈轉(zhuǎn)化為菌絲體飼料,極大地提高了秸稈粗蛋白的含量和
秸稈纖維的轉(zhuǎn)化率,是畜禽生產(chǎn)中重要的蛋白來(lái)源。
不同的食用菌品種,選擇栽培原料成分不同,其菌糠的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也會(huì)有所不同。不同的食用菌品種在相同的栽培基質(zhì)上,其菌糠的營(yíng)養(yǎng)成分也會(huì)不同[7],因此本研究原料的成分只有小麥秸稈、麩皮及餅肥,既可以滿足選定食用菌品種的生長(zhǎng),其菌糠也能滿足羊等反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需求。通過(guò)不同品種不同生長(zhǎng)階段對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),紅平菇不僅發(fā)菌速度較快,而且粗纖維被分解多,粗蛋白和粗脂肪含量高,而本試驗(yàn)的菌絲體飼料是到長(zhǎng)滿菌絲的階段為止,并未讓其出菇,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值保留在培養(yǎng)基質(zhì)中,并未進(jìn)一步轉(zhuǎn)化,所以從理論上與出菇后的菌糠成分相比,菌絲體階段的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)相對(duì)較高,更適合于用作反芻動(dòng)物的飼料。
食用菌培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)菌絲體的生物固氮和酶解作用等一系列生物轉(zhuǎn)化過(guò)程后,其中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)均被不同程度地降解,而粗蛋白和粗脂肪的含量則有所提高,且富含氨基酸、多糖及鈣、磷、鐵、鋅等多種礦物元素,同時(shí)還可產(chǎn)生有機(jī)酸和生物活性物質(zhì)等,這就增加了菌糠中營(yíng)養(yǎng)成分的含量,并增強(qiáng)了菌糠的菌香味,從而有利于提高菌糠的適口性和消化率[5]。本試驗(yàn)的結(jié)果與前人報(bào)道的結(jié)果相似。下一步的試驗(yàn),是將菌絲體飼料開(kāi)展飼喂試驗(yàn),證實(shí)飼喂效果,并進(jìn)一步采用發(fā)酵隧道技術(shù)規(guī)模化生產(chǎn)菌絲體飼料,并根據(jù)菌株和秸稈類(lèi)型,制定標(biāo)準(zhǔn)化菌絲體飼料的關(guān)鍵技術(shù)規(guī)程,按照訂單式生產(chǎn)菌絲體飼料,充分提高秸稈飼料化價(jià)值,對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
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