王洪斌++趙鑫++金雪萍++肖龍海++韓雪++李士虎

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.134

摘要：以江蘇省連云港市海州灣常見海洋微藻塔胞藻（Pyramidomonas delicatula）、巴夫藻（Pavlova viridis）為試驗材料，研究水環(huán)境中乙草胺對2種海洋微藻的致毒脅迫效應(yīng)。以葉綠素a含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量為指標，研究2種海洋微藻的生長量及細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)對乙草胺致毒脅迫的響應(yīng)。結(jié)果表明：塔胞藻、巴夫藻2.5 mg/L試驗組培養(yǎng)至7 d，生長量分別為對照組的6.4%、6.0%；96 h培養(yǎng)時間內(nèi)，乙草胺對塔胞藻及巴夫藻葉綠素a含量的影響表現(xiàn)在降低葉綠素a的合成量，2.5 mg/L試驗組葉綠素a的含量分別為對照組的26%、28%；乙草胺對2種微藻的SOD活性均表現(xiàn)誘導性上升，1.0 mg/L試驗組達最高值，是對照組的158倍；塔胞藻、巴夫藻0.5 mg/L試驗組CAT活性達最高值，分別是對照組（0 mg/L）的1.5、1.4倍；2種微藻體內(nèi)MDA含量隨乙草胺處理濃度增加而明顯提高，塔胞藻、巴夫藻在2.5 mg/L試驗組達最高值，均為對照組15倍以上。一定濃度的乙草胺對塔胞藻及巴夫藻具有強烈的致毒脅迫效應(yīng)，不同海洋微藻對乙草胺致毒脅迫的響應(yīng)存在種屬差異性。

關(guān)鍵詞：乙草胺；塔胞藻；巴夫藻；致毒效應(yīng)

中圖分類號： TQ450.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0465-03

收稿日期：2015-08-06

基金項目：國家級高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（編號：201411641049Y）；江蘇省海洋資源開發(fā)研究院開放課題（編號：JSIMR201319）

作者簡介：王洪斌（1966—），男，江蘇連云港人，碩士，教授，研究方向為環(huán)境微生物生物技術(shù)。E-mail：lygwhbly@126.com。乙草胺是一種廣泛使用的選擇性酰胺類芽前除草劑，主要適用于防除禾本科雜草和闊葉雜草，它能被雜草的幼芽和幼根吸收，抑制雜草蛋白質(zhì)合成而使雜草死亡[1-3]。由于酰胺類除草劑具有較高的水溶性及相對較低的土壤吸附常數(shù)，施用到農(nóng)田的乙草胺容易通過滲透轉(zhuǎn)移到淺層地下水或隨雨水徑流而造成水體污染，直接或間接對人體健康造成危害[4]。而乙草胺是我國使用最多的3種除草劑（甲草胺、乙草胺和丁草胺）之一[5]，所以乙草胺使用后在環(huán)境中的歸宿及殘留污染對人和動物的毒性成為學者關(guān)心的熱點。

浮游藻類具有取材方便、易于培養(yǎng)和操作的特點，對化學污染物的致毒脅迫敏感，浮游藻類受殘留污染物致毒脅迫而產(chǎn)生活性氧自由基，能夠引發(fā)一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物，對生物體的細胞造成損傷，最終導致細胞死亡[6]。由超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等組成的抗氧化系統(tǒng)能夠有效防御活性氧自由基的侵害。丙二醛（MDA）產(chǎn)生與脂質(zhì)過氧化程度相關(guān)，可以指示細胞機體受到氧化損傷的程度[7-9]。研究表明，許多農(nóng)藥能夠抑制生物體內(nèi)抗氧化酶的活性，導致生物體內(nèi)活性氧自由基含量的增加，對生物體構(gòu)成氧化脅迫。目前，國內(nèi)外關(guān)于農(nóng)藥殘留污染的研究主要集中在它們對水生生物的急性毒性效應(yīng)[10]，而乙草胺對海洋微藻抗氧化酶活性影響的研究尚屬空白。本研究以江蘇省連云港市海州灣常見海洋微藻塔胞藻（Pyramidomonas delicatula）、綠色巴夫藻（Pavlova viridis）為試驗材料，研究水環(huán)境中乙草胺對2種微藻的致毒脅迫效應(yīng)。以葉綠素a含量、超氧化歧化酶活性、過氧化氫酶活性及丙二醛含量為指標，研究2種海洋微藻的生長及細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)對乙草胺致毒脅迫的響應(yīng)，旨在提示農(nóng)藥污染對水環(huán)境破壞的嚴重性，揭示海洋微藻作為環(huán)境毒理學評價指標的潛在應(yīng)用，并為乙草胺的合理安全使用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

塔胞藻、綠色巴夫藻均為淮海工學院海洋學院海藻實驗室保存種。微藻培養(yǎng)液采用f/2加富海水，海水采自連云港市連島海域（鹽度3.10%～3.20%）漲潮時，醋酸纖維薄膜過濾，121 ℃滅菌20 min待用。

乙草胺（濟南天邦化工有限公司生產(chǎn)的50%乳油）用蒸餾水稀釋為500 mg/L，備用。

1.2方法

1.2.1微藻培養(yǎng)方法藻種在f/2培養(yǎng)液中培養(yǎng)到指數(shù)生長期為接種物。微藻培養(yǎng)采用f/2海水培養(yǎng)液，不通氣靜止培養(yǎng)，在無菌條件下將20 mL處于指數(shù)生長期的藻種接種于裝有180 mL f/2培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，光照度為 3 000 lx，光—暗周期12 h—12 h，每天定時搖動3次，（23±1）℃下培養(yǎng)[11]。

1.2.2微藻生長測定取培養(yǎng)至4 d的藻液100 mL，分別加入0、100、200、300、400、500 μL乙草胺溶液，使乙草胺濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L。采用吸光度法定時對其生長進行測定。以接種時間為初始時間開始測定，每天定時取出5 mL藻液。以未接任何藻種的f/2加富海水營養(yǎng)液為空白對照，在波長680 nm下測定其D680 nm值，連續(xù)7 d[12]。試驗設(shè)3個平行組。

1.2.3葉綠素a測定采用丙酮提取法。取培養(yǎng)96 h的藻液10 mL，5 000 r/min離心10 min，收集藻泥，加3 mL 80%丙酮，凍融3次，超聲波破碎細胞、離心，上清液即為葉綠素a提取液[13]。

1.2.4SOD活性、CAT活性、MDA含量檢測試驗根據(jù)南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。所有試驗均重復3次，數(shù)據(jù)取平均值，并分析其差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻生長特性的影響

由圖1可見，處理組塔胞藻在培養(yǎng)3 d后，表現(xiàn)出強烈抑制效應(yīng)，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L組培養(yǎng)7 d，D680 nm分別只有對照組的24.0%、18.0%、10.0%、7.4%、6.4%。由圖2可見，低濃度的乙草胺（≤1.0 mg/L）對綠色巴夫藻生長脅迫作用不明顯，在培養(yǎng)3 d后，生長水平與對照組（0 mg/L）相比，表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，0.5、1.0 mg/L組培養(yǎng)7 d后，分別是對照組的69%、70%；而1.5、2.0、2.5 mg/L 組表現(xiàn)出強抑制效應(yīng)，培養(yǎng)7 d后分別是對照組的10.0%、6.0%、6.0%。乙草胺濃度高于0.5 mg/L，對2種微藻表現(xiàn)出明顯抑制作用，說明高濃度的乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻具有強烈的致毒效應(yīng)。試驗還證實，不同濃度乙草胺對不同微藻生長的脅迫作用存在差異。

2.2乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻葉綠素a合成的影響

乙草胺對塔胞藻及綠色巴夫藻葉綠素a的影響主要表現(xiàn)在降低葉綠素a的合成量，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)（圖3）。培養(yǎng)至96 h，與對照組相比，試驗組塔胞藻及綠色巴夫藻葉綠素a的含量均隨濃度增加而降低，塔胞藻較綠色巴夫藻下降幅度尤為明顯，塔胞藻0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 試驗組，葉綠素a含量分別為對照組的59%、50%、37%、30%、26%，經(jīng)分析，0.5、1.0 mg/L組與對照組差異顯著（P<0.05），而其他各試驗組與對照組相比差異極顯著（P<0.01）。綠色巴夫藻0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L試驗組葉綠素a含量分別為對照組的77%、65%、38%、31%、28%，經(jīng)分析，0.5、1.0 mg/L 組與對照組差異不顯著，而其他各試驗組與對照組比較有極顯著差異（P<0.01）。2種微藻比較可知，低濃度乙草胺對塔胞藻的葉綠素a合成致毒脅迫效應(yīng)遠大于綠色巴夫藻，高濃度乙草胺對葉綠素a合成的影響趨向一致，與“2.1”節(jié)所述的生長狀況結(jié)論是一致的，不同微藻對農(nóng)藥致毒脅迫的響應(yīng)存在較大的種屬差異性。

2.3乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻SOD活性的影響

乙草胺處理2種微藻96 h后SOD活性變化見圖4，可見低濃度乙草胺對2種微藻的SOD活性均表現(xiàn)誘導性上升。塔胞藻在1.0 mg/L試驗組達最高值，是對照組的1.58倍，差異極顯著（P<0.01）；隨乙草胺質(zhì)量濃度加大，SOD活性逐漸下降，2.5 mg/L試驗組恢復至對照組水平。綠色巴夫藻也在 1.0 mg/L 試驗組達最高值，是對照組的1.81倍，差異極顯著（P<0.01）；后緩慢降低，與塔胞藻類似，在2.5 mg/L乙草胺處理下恢復至對照組水平。

2.4乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻CAT活性的影響

圖5顯示乙草胺處理2種微藻96 h后CAT活性變化情況，可見塔胞藻0.5 mg/L試驗組CAT活性達最高值，是對照組（0 mg/L）的1.5倍；隨乙草胺濃度的進一步上升而下降，2.5 mg/L 試驗組CAT活性是對照組的95%，基本恢復至對照組水平。綠色巴夫藻也在0.5 mg/L試驗組CAT活性達最高值，是對照組的1.4倍；2.5 mg/L試驗組CAT活性是對照組的94%，基本恢復至對照組水平。各試驗組與對照組比較，差異性均不顯著。

2.5乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻MDA含量的影響

圖6顯示，96h培養(yǎng)時間內(nèi)，2種微藻體內(nèi)MDA含量隨

乙草胺處理濃度增加而明顯增高，2種微藻在0.5 mg/L試驗組與對照組（0 mg/L）相比即大幅度升高，且隨乙草胺質(zhì)量濃度加大而明顯增加；在2.5 mg/L試驗組達最高值，為對照組15倍；綠色巴夫藻在1.5 mg/L時MDA含量就高達對照組15倍，后增長趨勢平緩，2.5 mg/L試驗組也達最高值，為對照組16倍，差異性均為極顯著（P<0.01）。MDA含量反映機體受過氧化損傷程度，塔胞藻、綠色巴夫藻對乙草胺致毒脅迫的響應(yīng)存在差異。2種海洋微藻MDA含量變化與其生長特性的響應(yīng)是一致的。

3討論

農(nóng)作物施用農(nóng)藥和沿海一些農(nóng)藥生產(chǎn)廠的排污已對近海水域構(gòu)成污染，目前，農(nóng)藥殘留污染對海洋生物資源、養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的破壞性影響已引起廣大學者的高度重視。因此監(jiān)測海洋農(nóng)藥殘留污染對保護海洋生物資源及生態(tài)修復具有重要意義，本研究用乙草胺殘留污染對海洋微藻的致毒脅迫效應(yīng)進行初步研究，探討其對海洋微藻毒性效應(yīng)，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上合理、安全使用酰胺類除草劑提供理論依據(jù)。

本研究以江蘇省連云港市海州灣常見藻種塔胞藻、綠色巴夫藻為供試藻，實驗室條件下研究乙草胺致毒脅迫對2種海洋微藻生長、抗氧化系統(tǒng)及葉綠素a合成的影響。試驗證實，高濃度乙草胺具有強烈的毒性效應(yīng)，從對葉綠素含量影響情況看出，乙草胺對綠色巴夫藻的致毒脅迫效應(yīng)遠大于塔胞藻，與對其生長特性脅迫影響的結(jié)論一致，不同微藻對農(nóng)藥致毒脅迫的響應(yīng)存在較大的種屬差異性。乙草胺對海洋微藻的毒性影響遠大于另一種除草劑草甘膦[14]。

SOD和CAT活性是好氧生物抗氧化機制的主要活性酶，其活性變化可以反映微藻抵御污染物脅迫能力[15]。本研究顯示，低濃度乙草胺對2種微藻的SOD活性均有誘導性刺激上升作用，反映微藻受乙草胺氧化脅迫，機體抗氧化能力增強，而后隨乙草胺濃度增加逐漸下降，在質(zhì)量濃度1.0 mg/L時，SOD活性達最高，在質(zhì)量濃度 2.5 mg/L 時恢復至對照組水平，沒有出現(xiàn)抑制效應(yīng)，與劉霞等結(jié)論[16]不一致，至于多少質(zhì)量濃度的乙草胺能誘導機體產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基，超出機體的清除能力而導致藻體暴發(fā)性死亡，有待進一步研究。對CAT活性表現(xiàn)趨勢同SOD。MDA是生物膜中多種不飽和脂肪酸在活性自由基攻擊后產(chǎn)生的過氧化產(chǎn)物，其含量高低反映藻細胞膜過氧化損傷程度，2種MDA含量反應(yīng)與其生長特性的響應(yīng)一致，96 h培養(yǎng)時間，隨乙草胺處理濃度加大，MDA含量顯著增加，表明微藻體內(nèi)活性自由基積累，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加，有毒代謝產(chǎn)物大量積累，MDA含量與污染物的濃度呈正相關(guān)，與劉霞等試驗結(jié)果[16-17]一致。

本研究沒有涉及其他環(huán)境因素，對于乙草胺致毒效應(yīng)機制以及微藻的種屬差異、微藻的適應(yīng)機制等需要進一步深入研究。

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