李鵬，張艷芳，王軍，2，韓玉婷，王選年*

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450000)

紫外誘變選育米曲霉氨肽酶高產(chǎn)菌株

李鵬1,2，張艷芳1，王軍1，2，韓玉婷1，王選年1*

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450000)

以米曲霉CICC2066菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變，經(jīng)過多次篩選后得到3株氨肽酶活力顯著提高且遺傳性較穩(wěn)定的誘變株UY-15，UY-17和UY-20。將3株誘變株與出發(fā)菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)性能比較，結(jié)果表明：米曲霉UY-15，UY-17和UY-20培養(yǎng)42 h后制曲中氨肽酶活力分別是出發(fā)菌株的1.24，1.38，1.54倍，且UY-20中性蛋白酶活力較出發(fā)菌株提高了7%。3株誘變株的孢子量較出發(fā)菌株具有優(yōu)勢(shì)。

米曲霉；紫外誘變；氨肽酶

氨肽酶不僅能夠水解多肽，還能水解完整的蛋白酶[1]。在食品工業(yè)上通常與其他蛋白酶復(fù)合使用來進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)[2]。米曲霉是氨肽酶的重要來源菌之一[3]。目前亮氨酸氨肽酶(LAPs)已經(jīng)成為最被關(guān)注的氨肽酶之一，LAPs通過對(duì)蛋白水解產(chǎn)物中苦味肽的水解并釋放游離氨基酸，達(dá)到改善蛋白水解物的風(fēng)味、縮短加工周期、提高營養(yǎng)價(jià)值的目的[4-6]。

傳統(tǒng)醬油的發(fā)酵生產(chǎn)是利用米曲霉生長過程中產(chǎn)生的豐富酶系水解蛋白質(zhì)、淀粉產(chǎn)生氨基酸、葡萄糖等物質(zhì)，從而形成醬油產(chǎn)品獨(dú)特的色、香、味、體[7]，所以在醬油釀造過程中菌種的優(yōu)劣決定了產(chǎn)品的品質(zhì)。當(dāng)前各生產(chǎn)單位所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過誘變育種來提高產(chǎn)量、擴(kuò)大品種、改善產(chǎn)品質(zhì)量、簡化生產(chǎn)工藝[8]。司曉光等[9]對(duì)米曲霉3.042菌株進(jìn)行了常壓室溫等離子體(ARTP)誘變，使酸性蛋白酶的活性提高了39.9%；吳冬梅等[10]通過對(duì)一株米曲霉出發(fā)菌進(jìn)行紫外誘變，使中性蛋白酶的的酶活力提高了1倍。但是這些研究多集中在對(duì)中性蛋白酶及酸性蛋白酶方面，對(duì)氨肽酶活性進(jìn)行考察的比較少。本研究以購買的CICC2066米曲霉菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變，以期提高目標(biāo)菌株制曲42 h后產(chǎn)氨肽酶量與中性蛋白酶活性在42 h達(dá)到峰值保持一致，從而更好地應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 菌種

米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株CICC2066：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基。

1.2.2 蛋白酶復(fù)篩培養(yǎng)基

制曲培養(yǎng)基。

1.2.3 氨肽酶活力篩選培養(yǎng)基

蔗糖30 g/L，LNA 0.5 g/L，MgSO4·7H2O0.5 g/L，KH2PO410.0 g/L，瓊脂粉17 g/L，無菌水1000 mL，pH 6.4，121 ℃滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 粗酶液的提取方法

1.3.1.1 中性蛋白酶粗酶液

取1 g于30 ℃培養(yǎng)后的固體干曲，按照1∶20(g/mL)加入0.1 mol/L pH 7.2 磷酸緩沖液，于40 ℃水浴中浸提1 h，間歇攪拌，用4層紗布過濾即得粗酶液。

1.3.1.2 氨肽酶粗酶液

取1 g于30 ℃培養(yǎng)后的固體干曲，按照1∶20(g/mL)加入0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液，放置4 ℃過夜，4層紗布過濾得粗酶液。

1.3.2 酶活性的測(cè)定方法

1.3.2.1 中性蛋白酶測(cè)定

采用福林-酚法，參考GB/T 23527-2009蛋白酶活力測(cè)定法。中性蛋白酶的測(cè)定pH值為7.2。

酶活定義：1 g干曲在40 ℃，pH 7.2條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位。

酶活力計(jì)算公式：U=A×K×4/10×n。

式中：A為平均吸光度值；K為吸光常數(shù)；4為反應(yīng)試劑的總體積；10為反應(yīng)時(shí)間；n為酶液稀釋倍數(shù)。

1.3.2.2 氨肽酶測(cè)定

采用亮氨酸對(duì)硝基苯胺法。酶活定義：在40 ℃，pH 7.2的條件下，每1 min水解亮氨酸對(duì)硝基苯胺生成1 μg對(duì)硝基苯胺(pNA)所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

酶活力計(jì)算公式：U= A×V1×D/(k×t×V2)。

式中：A為平均吸光度值；V1為反應(yīng)總體積；V2為酶液體積；D為酶液的稀釋倍數(shù)；k為消光系數(shù)；t為恒溫反應(yīng)時(shí)間。

1.3.3 菌種誘變

1.3.3.1 致死率確定

將5 mL菌懸液(1.28×107個(gè)孢子/mL)置于6 cm的無菌培養(yǎng)皿中，距離30 W 紫外燈的距離為30 cm左右，分別處理0，2，4，6，8，10 min；取0.5 mL處理后的菌液進(jìn)行10-1～ 10-5梯度稀釋分離，取其中的10-3，10-4，10-53個(gè)稀釋度各200 μL菌液涂布平板，設(shè)置3組重復(fù)，30 ℃倒置培養(yǎng)(避光培養(yǎng))。培養(yǎng)3天后，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。

1.3.3.2 紫外誘變初篩

經(jīng)氨肽酶水解LNA后對(duì)硝基苯胺在篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)黃色，根據(jù)黃色水解圈的大小采用LNA篩選平板法進(jìn)行初篩；分別測(cè)定HE值(HE值=水解圈直徑/菌落直徑)，選擇HE值較對(duì)照大者移入PDA斜面，30 ℃培養(yǎng)4天，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.3 紫外誘變復(fù)篩

將經(jīng)過初篩后所得菌株制成孢子懸液，吸取1 mL孢子懸液(1.28×107個(gè)孢子/mL) 接種于蛋白酶復(fù)篩培養(yǎng)基三角瓶中，于30 ℃ 培養(yǎng)，制曲42 h，測(cè)定其氨肽酶和中性蛋白酶活力。

1.3.3.4 遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將復(fù)篩得到的菌株在PDA斜面上連續(xù)傳代5次，每次傳代后在蛋白酶復(fù)篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)并測(cè)定其氨肽酶和中性蛋白酶活力。

1.3.3.5 性能測(cè)定

米曲霉UY-15，UY-17和UY-20菌株與出發(fā)菌株的性能比較：氨肽酶和中性蛋白酶活力測(cè)定方法同上，生長速度的測(cè)定采用直線生長法，孢子數(shù)測(cè)定采用懸滴法(ZBX 66028-87)。

2 結(jié)果與討論

2.1 CICC2066菌株中性蛋白酶和氨肽酶活性檢測(cè)結(jié)果

CICC2066菌株制曲過程中性蛋白酶活性變化見圖1，中性蛋白酶活性在42 h達(dá)到最高的830.8 U/g(干曲)。

圖1 CICC2066菌株曲中性蛋白酶活性

CICC2066菌株制曲過程中氨肽酶活性變化見圖2，其氨肽酶活性在60 h達(dá)到201.4 U/mL。雖然菌株氨肽酶活性較高，但氨肽酶產(chǎn)量在60 h才達(dá)到峰值，不能與中性蛋白酶在42 h的最高產(chǎn)酶量保持一致，從而不能有效地水解多肽和提高醬油釀造過程中游離氨基酸的生成率，所以提高菌株制曲42 h的產(chǎn)氨肽酶量是有必要的。

圖2 CICC2066菌株曲氨肽酶活性

2.2 紫外誘變

2.2.1 誘變條件的確定

本研究采用紫外誘變的方式進(jìn)行菌種選育，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可知，當(dāng)致死率達(dá)到75%左右時(shí)正突變率最高[11]，因此選擇75%左右致死率的致死劑量。

表1 不同紫外照射時(shí)間及稀釋倍數(shù)的誘變結(jié)果

由表1可知，誘變后稀釋倍數(shù)為103時(shí)，由于原始孢子液濃度為1.28×107個(gè)孢子/mL，所以很難計(jì)算菌落數(shù)。當(dāng)誘變后稀釋倍數(shù)為104時(shí)，雖然可以計(jì)算，但菌落緊貼無法看清水解圈，所以選擇稀釋倍數(shù)最佳的105。因此，最佳誘變條件是30 W照射燈，距離30 cm，照射時(shí)間6 min，誘變后稀釋倍數(shù)105。

2.2.2 初篩

氨肽酶篩選平板培養(yǎng)3天后，測(cè)定單菌落的水解圈直徑與菌落直徑，計(jì)算HE值，HE值=透明圈直徑/菌落直徑，選擇HE值增大的20株菌株進(jìn)行復(fù)篩。

2.2.3 復(fù)篩

將初篩獲得的20株誘變株進(jìn)行PDA斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)，培養(yǎng)4天后將孢子液(1.28×107個(gè)孢子/mL)接入蛋白酶復(fù)篩培養(yǎng)基，檢測(cè)其氨肽酶和中性蛋白酶制曲42 h酶活性，檢測(cè)結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 各誘變菌株第一次復(fù)篩時(shí)氨肽酶活性

由圖3可知，誘變菌株第1次復(fù)篩氨肽酶活性在120～184.3 U/mL，經(jīng)比較其中UY-5，UY-7，UY-15，UY-17和UY-20的氨肽酶活性較高。

圖4 各誘變菌株第一次復(fù)篩時(shí)中性蛋白酶活性

由圖4可知，20株誘變菌株中性蛋白酶活性在787.4～889.04 U/g(干曲)，CICC2066菌株活性為830.8 U/g(干曲)。其中UY-1，UY-15，UY-17，UY-18，UY-19和UY-20的中性蛋白酶活性高于原始菌株，但UY-17，UY-18，UY-19提高得很不明顯。結(jié)合圖3中各菌株氨肽酶活性，選擇UY-1，UY-15，UY-17，UY-20 4株 誘變株作為目標(biāo)菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2.4 高產(chǎn)突變株的確定和遺傳穩(wěn)定性研究

將UY-1，UY-15，UY-17，UY-20菌株分別經(jīng)過3輪發(fā)酵產(chǎn)酶能力測(cè)試，在不低于出發(fā)菌株中性蛋白酶活性的基礎(chǔ)下，最終篩選出3株具有產(chǎn)酶優(yōu)勢(shì)的突變株UY-15，UY-17，UY-20。將UY-15，UY-17和UY-20分別傳代5次做遺傳穩(wěn)定性考察，結(jié)果見表2。

表2 突變菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

由表2可知，以均值作對(duì)照，氨肽酶與中性蛋白酶活性的變化范圍不大，表明這3株突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。其中，UY-15，UY-17和UY-20制曲中氨肽酶活力分別是出發(fā)菌株的1.24，1.38，1.54倍，且UY-20中性蛋白酶活力較出發(fā)菌株提高了7%。

2.2.5 3株米曲霉突變株與米曲霉CICC2066菌株的性能比較

米曲霉UY-15，UY-17和UY-20菌株與米曲霉CICC2066菌株的性能比較：由表3可知，米曲霉UY-15，UY-17，UY-20菌株的氨肽酶活性明顯高于出發(fā)菌株CICC2066，且UY-20中性蛋白酶活性高于出發(fā)菌株7%，在蛋白質(zhì)水解過程中可以發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì)，并且孢子數(shù)大于出發(fā)菌株。

表3 突變菌株與CICC2066的性能比較

3 結(jié)論

通過對(duì)米曲霉CICC2066菌株進(jìn)行紫外誘變，篩選出3株高產(chǎn)氨肽酶且遺傳穩(wěn)定的突變株UY-15，UY-17，UY-20。其中，米曲霉UY-15，UY-17和UY-20制曲42 h后其氨肽酶活力分別是出發(fā)菌株的1.24，1.38，1.54倍，且UY-20中性蛋白酶活力較出發(fā)菌株提高了7%。通過直線生長法和懸滴法，考察了原始菌株與誘變菌株生長速率和孢子量，3株誘變株孢子量較出發(fā)菌株具有較大優(yōu)勢(shì)。本研究用誘變育種方式提高了CICC2066菌株制曲42 h的氨肽酶活性，目前已有研究人員通過組合培養(yǎng)的方式來提高蛋白酶活力，結(jié)合此類研究成果，通過不同米曲霉菌株組合制曲來提高氨肽酶產(chǎn)量會(huì)有很大的可能性。

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Breeding ofAspergillusoryzaeAminopeptidase-producing Strains by Ultraviolet Induced Mutation

LI Peng1, 2,ZHANG Yan-fang1,WANG Jun1，2,HAN Yu-ting1,WANG Xuan-nian1*

(1.Biotechnology Research Center,College of Life Science and Technology,Xinxiang University, Xinxiang 453003,China;2.College of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China)

One strain ofAspergillusoryzaeCICC2066 is screened by UV induced mutagenesis. With screening for several times, three mutants UY-15, UY-17 and UY-20 with higher, stable aminopeptidase activity are obtained. Compared with CICC2066 on fermentation performance, the aminopeptidase activity of mutants UY-15, UY-17 and UY-20 of culturing for 42 h is 1.24, 1.38,1.54 times that of the starting strain. The neutral protease activity of UY-20 is increased by 7% than that of the starting strain. The number of spores of three induced strains is higher than that of CICC2066.

Aspergillusoryzae; ultraviolet induced mutation; aminopeptidase

2016-07-15 *通訊作者

河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2011C550002)

李鵬(1988-)，男，碩士，研究方向：食品與微生物發(fā)酵； 王選年(1969-)，男，河南靈寶人，教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：微生物學(xué)與免疫學(xué)。

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.014

1000-9973(2017)01-0061-04