邵良偉，鄒強(qiáng)，張弛松，張瓊，劉達(dá)玉*

(1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，成都 610106；3.成都市農(nóng)林科學(xué)院，成都 611130)

豆豉以黃豆或黑豆為原料，通過(guò)霉菌或細(xì)菌等微生物在制曲階段分泌的酶系物質(zhì)將大豆中的大豆蛋白

分解，并經(jīng)制曲到豉曲成熟，然后通過(guò)加入食用鹽、酒等抑制劑來(lái)抑制各類(lèi)酶的活性，再經(jīng)不同程度的后發(fā)酵而制成[1-2]。通過(guò)毛霉制曲生產(chǎn)的毛霉型豆豉具有獨(dú)特的風(fēng)味及多種生理活性物質(zhì)，具有較高的食用價(jià)值和一定的藥用價(jià)值 ，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)[3]。

毛霉型豆豉大多采用毛霉自然制曲工藝生產(chǎn)，通過(guò)毛霉菌在制曲過(guò)程中分泌大量的酶，如蛋白酶、纖維素酶等酶系物質(zhì)[4-5]，使得豆豉后發(fā)酵過(guò)程在多種酶系作用下將高蛋白大豆水解為小分子多肽和氨基酸等功能和風(fēng)味營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6]。但由于參與制曲的毛霉不耐高溫，受季節(jié)制約不能常年生產(chǎn)，且制曲時(shí)間一般在20 d左右，后發(fā)酵所需時(shí)間少則幾個(gè)月，多則長(zhǎng)達(dá)數(shù)年之久，同時(shí)豉曲質(zhì)量因受當(dāng)時(shí)生產(chǎn)環(huán)境和溫濕度情況影響而參差不齊，嚴(yán)重制約了企業(yè)的發(fā)展。據(jù)研究報(bào)道[7-8]，豆豉產(chǎn)品品質(zhì)在很大程度上由制曲工藝決定，因此在生產(chǎn)中控制制曲環(huán)節(jié)尤為重要。目前對(duì)毛霉型豆豉發(fā)酵工藝的研究較多，但對(duì)于具有地域特色的傳統(tǒng)毛霉型豆豉的發(fā)酵工藝，特別是制曲工藝的報(bào)道較少。

豉曲中蛋白酶、纖維素酶等酶活性決定了蛋白質(zhì)、粗纖維等物質(zhì)的降解速率，從而影響?hù)某墒鞎r(shí)間，同時(shí)，還會(huì)影響豆豉的品質(zhì)[9]。本研究對(duì)毛霉型豆豉傳統(tǒng)自然制曲工藝進(jìn)行了優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，測(cè)定豉曲中總蛋白酶活力和纖維素酶活力等指標(biāo)，利用模糊數(shù)學(xué)評(píng)定方法確定豉曲相關(guān)指標(biāo)權(quán)重并得出綜合評(píng)分，以綜合評(píng)分為響應(yīng)面值，對(duì)在制曲過(guò)程中影響?hù)|(zhì)量的主要因素菌粉接種量、制曲溫度、制曲時(shí)間、相對(duì)濕度等進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 材料

黃豆：購(gòu)于成都好樂(lè)購(gòu)超市；毛霉菌種：通過(guò)從潼川豆豉產(chǎn)地采集傳統(tǒng)自然制曲階段分離篩選得到的毛霉菌，并制成直投式發(fā)酵菌劑。

1.2 試劑

L-酪氨酸(分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；干酪素(生物試劑)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；福林酚、三氯乙酸、無(wú)水碳酸鈉、鹽酸、無(wú)水磷酸二氫鈉、無(wú)水磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、冰乙酸、三水碳酸鈉、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)、四水酒石酸鉀鈉、苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉：均為分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

Biotek Synergy HTX多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；SH-020恒溫恒濕試驗(yàn)箱 上海上器集團(tuán)試驗(yàn)設(shè)備有限公司；pH計(jì)量?jī)x 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；XW-80A渦旋振蕩器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 蛋白酶活力測(cè)定[10]

配制濃度分別為0，20，40，60，80 μg/mL的酪氨酸溶液，以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.9854x-0.014，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。參照SB/T 10317-1999中的Folin-酚試劑法對(duì)樣液進(jìn)行酸性、中性、堿性蛋白酶活力的測(cè)定。根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白酶活力。將在40 ℃下每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

1.4.2 纖維素酶活力測(cè)定[11]

以乙酸-乙酸鈉緩沖溶液為標(biāo)準(zhǔn)空白樣，配制0.10～0.70 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=1.8285x+0.0122，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。參照NY/T 912-2004中的分光光度法對(duì)豉曲樣液進(jìn)行纖維素酶活力的測(cè)定，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出纖維素酶活力。

1.4.3 單因素試驗(yàn)

以蛋白酶活力和纖維素酶活力為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)研究菌粉接種量、制曲溫度、制曲時(shí)間以及制曲相對(duì)濕度對(duì)制曲的影響，試驗(yàn)水平分別選取菌粉接種量0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%；制曲溫度13，15，17，19，21，23 ℃；制曲時(shí)間3，4，5，6，7，8 d；制曲相對(duì)濕度75%、80%、85%、90%、95%。對(duì)制曲條件進(jìn)行初步優(yōu)化，確定較佳因素試驗(yàn)參數(shù)范圍，每個(gè)處理重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原則，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以菌粉接種量、制曲溫度、制曲時(shí)間、相對(duì)濕度為自變量，以總蛋白酶活力和纖維素酶活力為指標(biāo)，以模糊數(shù)學(xué)評(píng)定方法得到的豉曲質(zhì)量綜合評(píng)分為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.4.5 豉曲品質(zhì)的模糊綜合評(píng)價(jià)

設(shè)待評(píng)價(jià)的試驗(yàn)組別集為X=(x1,x2,…,x29)，影響?hù)|(zhì)量的因素集為U=(u1,u2)，其中，u1表示總蛋白酶活力；u2表示纖維素酶活力。對(duì)于組別xi∈X，按第j個(gè)因素uj∈U進(jìn)行測(cè)度，得到xi條件下關(guān)于因素uj的數(shù)據(jù)xij，從而構(gòu)成模糊數(shù)學(xué)中的信息矩陣A=(xij)29×2。

由于本試驗(yàn)中測(cè)得的數(shù)據(jù)大于1，但應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)方法在確定權(quán)重以及進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)要求隸屬度(試驗(yàn)數(shù)據(jù))介于0～1之間。故本文對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行如下的規(guī)范化處理，給出文獻(xiàn)的處理方法如下：

式中：xijmax表示在影響因素uj下xij(i=1,2,…,29)中最大的值；rj表示在影響因素uj下rij(i=1,2,…,29)中最大的值。

下面給出文獻(xiàn)[12]確定權(quán)重集的方法如下:

式中：ωj(j=1,2)表示因素uj的屬性權(quán)重，且Σωj=1(j=1,2),d2(rij-rj)，表示各組數(shù)據(jù)與最大值的差的平方。

綜上可得關(guān)于豉曲質(zhì)量模糊評(píng)定綜合評(píng)分[13]：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 菌粉接種量考察結(jié)果

菌粉接種量直接影響豆豉制曲的周期。菌粉接種量若控制恰當(dāng)，可在一定程度上縮短制曲周期，減少雜菌污染；菌粉接種量過(guò)大，易造成微生物種間競(jìng)爭(zhēng)而不利于發(fā)酵產(chǎn)酶，同時(shí)制曲微生物的大量繁殖，將產(chǎn)生大量熱量而使曲料溫度升高，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致“燒曲”現(xiàn)象[14]；而接種量過(guò)小，則菌體細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖不足，未能充分利用豉曲中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，酶活力也會(huì)降低，同時(shí)將影響?hù)焚|(zhì)，對(duì)后發(fā)酵及豆豉成品質(zhì)量產(chǎn)生影響。選定制曲溫度為15 ℃，制曲相對(duì)濕度為85%，制曲時(shí)間為6 d，以不同的菌粉接種量制備豉曲，考察菌粉接種量對(duì)豉曲質(zhì)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 菌粉接種量對(duì)蛋白酶活力和纖維素酶活力的影響

由圖1可知，總蛋白酶活力和纖維素酶活力隨著菌粉接種量的增加也隨之增大，達(dá)到最大值時(shí)的菌粉接種量分別為0.20%、0.15%，相對(duì)應(yīng)的酶活力分別為306.171，1.282 U/g；但隨著菌粉接種量的持續(xù)增加，酶活力均呈逐漸減少趨勢(shì)。這是由于接種量過(guò)大時(shí)，毛霉菌生長(zhǎng)繁殖旺盛，有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以維持毛霉菌生長(zhǎng)繁殖，會(huì)形成大量休眠孢子，從而降低酶活力[15]。因此，控制菌粉接種量為0.15%～0.20%。

2.1.2 制曲溫度考察結(jié)果

制曲溫度將影響制曲微生物的生長(zhǎng)繁殖，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道以及潼川豆豉技藝傳人經(jīng)驗(yàn)，傳統(tǒng)毛霉型豆豉制曲微生物毛霉菌一般最適生長(zhǎng)溫度在15 ℃左右[16]。本試驗(yàn)以菌粉接種量為0.20%，制曲相對(duì)濕度為85%，制曲時(shí)間為6 d，以不同的制曲溫度制備豉曲，考察制曲溫度對(duì)豉曲質(zhì)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 制曲溫度對(duì)蛋白酶活力和纖維素酶活力的影響

由圖2可知，在制曲溫度為13～17 ℃時(shí)，總蛋白酶活力隨著制曲溫度的增加而增大；制曲溫度為17 ℃時(shí)，總蛋白酶活力達(dá)到最大值，之后隨著制曲溫度的增加，酶活力呈減小趨勢(shì)。在制曲溫度為13～19 ℃時(shí)，纖維素酶活力隨著制曲溫度的增加而增大，但制曲溫度超過(guò)19 ℃后，纖維素酶活力呈降低趨勢(shì)。因此，應(yīng)控制制曲溫度在17～19 ℃之間。

2.1.3 制曲時(shí)間考察結(jié)果

制曲時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)豆豉制曲微生物的生長(zhǎng)有極其 重要的影響。制曲時(shí)間過(guò)短，微生物對(duì)原料的分解利用率不足，導(dǎo)致毛霉菌分泌酶系不足、酶活力很低，同時(shí)也造成原料的浪費(fèi)。而制曲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，大部分菌絲老化，菌絲生長(zhǎng)代謝減弱，使得酶活力降低[17]。本試驗(yàn)以菌粉接種量為0.20%，制曲溫度為17 ℃，制曲相對(duì)濕度為85%，以不同的制曲時(shí)間制備豉曲，考察制曲時(shí)間對(duì)豉曲質(zhì)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 制曲時(shí)間對(duì)蛋白酶活力和纖維素酶活力的影響

由圖3可知，隨著制曲時(shí)間的增加，總蛋白酶活力和纖維素酶活力也隨之增大，達(dá)到最大值時(shí)的制曲時(shí)間分別為6，5 d，之后隨著制曲時(shí)間的增加，總蛋白酶活力和纖維素酶活力呈降低趨勢(shì)。因此，控制制曲時(shí)間為5～6 d。

2.1.4 制曲相對(duì)濕度考察結(jié)果

在制曲過(guò)程中，由傳統(tǒng)毛霉型豆豉的生產(chǎn)工藝為通風(fēng)制曲，曲料水分極易揮發(fā)[18]。因此，保持制曲環(huán)境的濕度，有利于制曲微生物的生長(zhǎng)和酶系物質(zhì)的分泌。本試驗(yàn)以菌粉接種量為0.20%，制曲溫度為17 ℃，制曲時(shí)間為6 d，以不同的制曲相對(duì)濕度制備豉曲，考察制曲相對(duì)濕度對(duì)豉曲質(zhì)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 相對(duì)濕度對(duì)蛋白酶活力和纖維素酶活力的影響

由圖4可知，隨著制曲相對(duì)濕度的增加，在相對(duì)濕度從75%增加到85%時(shí)，總蛋白酶活力增大到最大值317.212 U/g，但再增加制曲相對(duì)濕度，總蛋白酶活力逐漸減小。纖維素酶活力隨著制曲相對(duì)濕度的增加，在相對(duì)濕度達(dá)到80%時(shí)即達(dá)到最大值1.386 U/g，之后再增加相對(duì)濕度，酶活力也表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。因此選擇制曲相對(duì)濕度80%～85%用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總蛋白酶活力和纖維素酶活力為指標(biāo)，采用Design-Expert 8.0.6 軟件Box-Benhnken法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定豉曲制備最佳制曲工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The response surface experimental design and results

對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得豉曲質(zhì)量指標(biāo)(總蛋白酶活力和纖維素酶活力)的綜合評(píng)分對(duì)菌粉接種量(A)、制曲溫度(B)、制曲時(shí)間(C)、相對(duì)濕度(D)的多元回歸方程為：

Y=97.29+1.61A+1.48B+1.02C+2.51D+1.02AB-0.73AC+2.28AD+1.15BC+1.51BD-0.40CD-7.62A2-8.19B2-5.04C2-8.63D2。

該模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

由表3可知，對(duì)豉曲質(zhì)量綜合評(píng)分回歸模型P<0.0001，極具顯著性，而失擬項(xiàng)P=0.2036>0.05，不顯著。此外，該回歸模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9870，RAdj2=0.9739，表明該模型擬合程度良好，可用來(lái)分析響應(yīng)值與因素值的關(guān)系及變化情況。試驗(yàn)中的菌粉接種量(A)、制曲溫度(B)、制曲時(shí)間(C)、相對(duì)濕度(D)對(duì)模型的曲面影響皆為極顯著(P<0.01)，且由F值可知，4個(gè)因素對(duì)豉曲質(zhì)量綜合評(píng)分的影響次序?yàn)椋合鄬?duì)濕度>菌粉接種量>制曲溫度>制曲時(shí)間。在二次項(xiàng)中，A2、B2、C2、D2均為極顯著(P<0.01)，而在對(duì)綜合評(píng)分的交互影響方面，AB、AC、CD的交互作用不顯著(P>0.05)，AD的交互作用極顯著(P<0.01)，BC、BD的交互作用顯著(P<0.05)。

菌粉接種量和相對(duì)濕度、制曲溫度和制曲時(shí)間、制曲溫度和相對(duì)濕度這3組因素間有交互作用，對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面分析，探究它們之間的具體交互規(guī)律。對(duì)回歸模型獲得的響應(yīng)曲面圖和等高線圖見(jiàn)圖5～圖7。

圖5 菌粉接種量和相對(duì)濕度對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface and contour of the effects of inoculum size and relative humidity on comprehensive score

圖6 制曲溫度和制曲時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface and contour of the effects of koji-making temperature and time on comprehensive score

圖7 制曲溫度和相對(duì)濕度對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface and contour of the effects of koji-making temperature and relative humidity on comprehensive score

由圖5～圖7可知，4個(gè)響應(yīng)因素在相對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)范圍內(nèi)都有響應(yīng)極值，且3組因素的交互作用結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。通過(guò)對(duì)各響應(yīng)因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線圖分析，并結(jié)合軟件計(jì)算回歸模型可以預(yù)測(cè)出當(dāng)菌粉接種量(A)為0.21%、制曲溫度(B)為17.24 ℃、制曲時(shí)間(C)為6.10 d、制曲相對(duì)濕度(D)為85.86%時(shí)，豉曲質(zhì)量綜合評(píng)分可達(dá)到97.753。

2.3 最佳工藝條件試驗(yàn)驗(yàn)證

為驗(yàn)證回歸模型的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)真實(shí)值之間的擬合程度，采用豉曲質(zhì)量指標(biāo)綜合評(píng)分最大值對(duì)響應(yīng)因素進(jìn)行驗(yàn)證?？紤]試驗(yàn)的可操作性，將響應(yīng)因素選定為菌粉接種量0.21%、制曲溫度17 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d、制曲相對(duì)濕度86%， 其他條件不變，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，按模糊數(shù)學(xué)評(píng)定方法得出豉曲質(zhì)量指標(biāo)綜合評(píng)分平均值為97.187，此試驗(yàn)值與回歸模型豉曲質(zhì)量指標(biāo)綜合評(píng)分預(yù)測(cè)值(97.753)相對(duì)誤差為0.57%，此時(shí)所得的蛋白酶活力和纖維素酶活力平均值分別為312.611，1.402 U/g。因此，通過(guò)模糊數(shù)學(xué)評(píng)定和響應(yīng)面法優(yōu)化得到的制曲最佳工藝條件的回歸模型是符合實(shí)際，對(duì)今后制曲工藝參數(shù)的選擇具有一定的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)并結(jié)合模糊數(shù)學(xué)評(píng)定方法對(duì)豉曲質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，以綜合評(píng)分為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果表明：菌粉接種量、制曲溫度、制曲時(shí)間、相對(duì)濕度對(duì)制曲過(guò)程中毛霉菌產(chǎn)蛋白酶活力和纖維素酶活力均有極顯著影響，且顯著順序?yàn)椋合鄬?duì)濕度>菌粉接種量>制曲溫度>制曲時(shí)間。同時(shí)，菌粉接種量和相對(duì)濕度、制曲溫度和制曲時(shí)間、制曲溫度和相對(duì)濕度這3組因素間交互作用顯著。得出最優(yōu)制曲條件：菌粉接種量為0.21%，制曲溫度為17 ℃，發(fā)酵時(shí)間為6 d，制曲相對(duì)濕度為86%，在此條件下豉曲質(zhì)量指標(biāo)綜合評(píng)分達(dá)到97.187。同時(shí)，本試驗(yàn)建立的回歸模型是有效可行的，可以用來(lái)預(yù)測(cè)設(shè)定試驗(yàn)因素條件下的毛霉型豆豉制曲工藝參數(shù)的響應(yīng)值。研究結(jié)果可為傳統(tǒng)毛霉型豆豉制曲工藝的工業(yè)化應(yīng)用提供參數(shù)借鑒。