鄧浩，張容鵠*，竇志浩，梁振益，馮建成，蔣瑤

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工設(shè)計(jì)研究所，?？?571100；2.海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院，?？?571100)

胡椒堿提取與純化工藝的研究

鄧浩1，張容鵠1*，竇志浩1，梁振益2，馮建成2，蔣瑤2

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工設(shè)計(jì)研究所，海口 571100；2.海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院，?？?571100)

采用乙醇浸提法提取胡椒中的胡椒堿，通過(guò)單因素和L16(45)正交實(shí)驗(yàn)，確定了最佳提取工藝條件：提取溫度為65 ℃，乙醇濃度為75%，料液比為1∶30，提取時(shí)間為0.5 h，提取次數(shù)為3次。通過(guò)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，確定了大孔樹(shù)脂分離胡椒堿的最佳工藝條件：樹(shù)脂種類為AB-8，上柱浸提液濃度為1.1 mg/mL，pH值為6，洗脫液為體積分?jǐn)?shù)75%、pH值為5的乙醇溶液，胡椒堿純度由浸提液的16.46%上升到69.32%。最后，通過(guò)C18層析柱對(duì)大孔樹(shù)脂純化的胡椒堿粗品進(jìn)一步純化，用90%乙醇洗脫，經(jīng)HPLC測(cè)定純化后粗品中的胡椒堿純度上升為81.26%。

胡椒堿；提?。环蛛x純化；大孔樹(shù)脂

胡椒(PipernigrumL.) ，始載于唐朝蘇恭的《唐木草》，又名白川、浮椒，是胡椒科胡椒屬常綠藤本植物[1，2]。胡椒原產(chǎn)于印度，是重要的熱帶香辛料作物，廣泛用于醫(yī)學(xué)工業(yè)和食品工業(yè)[3]。胡椒堿是胡椒中的主要活性成分，含量為5%～9%，其分子式為C17H19NO3，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)胡椒堿具有抑菌[4]、抗氧化[5]、降血脂[6]等生物活性，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化[7]、抑郁癥[8]等疾病有一定的預(yù)防和治療作用，更有潛力被開(kāi)發(fā)為新的抗癌藥物[9,10]。

目前，胡椒堿的提取方法有酸水提取法、有機(jī)溶劑萃取法、超聲萃取法以及超臨界萃取法等[11-14]， 但這些方法的胡椒堿提取液中常含有油脂、色素等雜質(zhì)，因此還需進(jìn)一步分離純化得到高純度的胡椒堿。本文以有機(jī)溶劑萃取法獲得胡椒堿的粗提物，并先后采用大孔樹(shù)脂和C18層析柱對(duì)胡椒堿進(jìn)行純化，制備高純度的胡椒堿，確定最佳分離純化工藝，以期為胡椒堿的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白胡椒：新鮮胡椒采自海南省瓊海市東平農(nóng)場(chǎng)；抗壞血酸、異抗壞血酸、一水合檸檬酸、無(wú)水亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉等試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純；纖維素酶、果膠酶：廣州明曜商貿(mào)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；HHS-4S水浴鍋 上海市南陽(yáng)儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限責(zé)任公司；CPA225D電子分析天平 德國(guó)Sartorius公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乙醇浸提法提取胡椒堿

1.3.1.1 胡椒堿的測(cè)定

胡椒堿測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取4.25 mg胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋成0.85，2.55，4.25，8.5，17 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以無(wú)水乙醇作為參比，在343 nm處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A=0.1238x-0.0257，r2=0.9998，結(jié)果顯示：胡椒堿濃度在0.85～17 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.1.2 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g胡椒粉，加入有機(jī)溶劑進(jìn)行震蕩提取，過(guò)濾并收集濾液，在343 nm處測(cè)定萃取液的吸光度值，通過(guò)胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出提取的胡椒堿質(zhì)量，分別對(duì)乙醇濃度、溫度、時(shí)間、料液比、提取次數(shù)5個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以胡椒堿提取率為指標(biāo)衡量提取效果。胡椒堿的得率計(jì)算公式：胡椒堿提取率=胡椒堿質(zhì)量/胡椒粉質(zhì)量×100%。

1.3.1.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L16(45)正交實(shí)驗(yàn)，以胡椒堿的得率為指標(biāo)，選擇乙醇濃度、溫度、時(shí)間、料液比、提取次數(shù)做水平正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.2 大孔樹(shù)脂法純化胡椒堿

1.3.2.1 大孔樹(shù)脂種類的篩選

分別稱取已處理好的9種大孔樹(shù)脂AB-8，NKA，NKA-2，D-151，X-5，D-101，D-280，D-4006，NKA-9各10 g于燒杯中，分別加入吸光度為A1的20 mL胡椒堿浸提液，密封避光靜置吸附12 h，取出過(guò)濾，于343 nm處測(cè)定濾液的吸光度A2；將吸附實(shí)驗(yàn)后的大孔樹(shù)脂重新置于50 mL小燒杯中，加入50%乙醇20 mL作為洗脫劑，密封避光靜置解吸12 h，取出。過(guò)濾，于343 nm處測(cè)定濾液的吸光度A3，以樹(shù)脂對(duì)胡椒堿的吸附率和解吸率為指標(biāo)選擇最佳大孔樹(shù)脂種類及最佳參數(shù)，吸附率=(A1-A3)/A1×100%，解吸率=A3/(A1-A2) ×100%。

1.3.2.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸參數(shù)的優(yōu)化

選擇1種最佳的大孔樹(shù)脂，按1.3.2.1的操作方法，以吸附率為指標(biāo)，考察胡椒堿濃度、pH的最佳參數(shù)；按1.3.2.1的操作方法，以解吸率為指標(biāo)，考察洗脫液濃度、pH的最佳參數(shù)。

1.3.2.3 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸參數(shù)的優(yōu)化

在大孔樹(shù)脂層析柱中加入20 mL經(jīng)過(guò)預(yù)處理的AB-8大孔樹(shù)脂，加入50 mL胡椒浸提液，用70%乙醇溶液對(duì)胡椒堿進(jìn)行洗脫，每5 mL收集1次洗脫液，測(cè)定吸光度，計(jì)算出解吸率?？疾煜疵撘后w積對(duì)動(dòng)態(tài)吸附-解吸過(guò)程的影響。

1.3.3 C18層析柱純化胡椒堿

C18層析柱經(jīng)前處理后，取150 mL經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后胡椒堿浸提液，經(jīng)1.5 BV的20%乙醇除雜，依次用200 mL的30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇溶液洗脫，測(cè)定洗脫液的吸光度，以解吸率為指標(biāo)，得出洗脫液的最佳體積分?jǐn)?shù)。將得到的胡椒堿溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)烘干，用于測(cè)定純度。

1.3.4 胡椒堿的純度測(cè)定方法

按照GB/T 17528-2009 規(guī)定的高效液相色譜法(HPLC)對(duì)胡椒堿的純度進(jìn)行分析和測(cè)定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，采用Origin 8.5作圖，采用正交助手V3.1進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇浸提法提取胡椒堿

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 乙醇濃度對(duì)胡椒堿提取率的影響

稱取1.0 g胡椒粉于50 mL小燒杯中，分別加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液，密封，浸提溫度60 ℃，浸提時(shí)間2 h，料液比1∶20，提取次數(shù)2次，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)胡椒堿提取率的影響

由圖1可知，隨著乙醇濃度的增大，胡椒堿的提取率增加，在70% 以后趨于平緩。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70% 左右為宜。

2.1.1.2 浸提溫度對(duì)胡椒堿提取率的影響

稱取1.0 g胡椒粉于50 mL小燒杯中，加入20 mL 70%乙醇溶液，密封，分別于30，40，50，60，70，80 ℃浸提2 h，料液比1∶20，提取次數(shù)2次，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 浸提溫度對(duì)胡椒堿提取率的影響

由圖2可知，在30～60 ℃范圍內(nèi)，隨著浸提溫度的逐漸升高，胡椒堿的提取率逐漸增加，在60 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值5.42%；此后，隨著溫度繼續(xù)升高，胡椒堿提取率逐漸降低，可能是由于高溫下胡椒堿氧化分解造成的。因此，選擇浸提溫度為60 ℃左右為宜。

2.1.1.3 浸提時(shí)間對(duì)胡椒堿提取率的影響

稱取1.0 g胡椒粉于50 mL小燒杯中，加入20 mL 70%乙醇溶液，密封，浸提溫度60 ℃，分別浸提0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，料液比1∶20，提取次數(shù)2次，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)胡椒堿提取率的影響

由圖3可知，隨著浸提時(shí)間的增長(zhǎng)，胡椒堿的提取率增加，2 h以后維持基本不變。因此，選擇浸提時(shí)間為2 h左右為宜。

2.1.1.4 料液比對(duì)胡椒堿提取率的影響

稱取1.0 g胡椒粉于50 mL小燒杯中，加入20 mL 70%乙醇溶液，密封，浸提溫度60 ℃，時(shí)間2 h，分別采用1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35的料液比提取2次，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)胡椒堿提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，胡椒堿提取率達(dá)到最高值4.97%，當(dāng)繼續(xù)降低料液比時(shí)，提取率反而下降，可能是當(dāng)料液比降低到一定程度時(shí)，使雜質(zhì)溶解增加，增加了對(duì)胡椒堿檢測(cè)的干擾，相應(yīng)減少胡椒堿的提取率。因此，選擇料液比為1∶20左右為宜。

2.1.1.5 提取次數(shù)對(duì)胡椒堿提取率的影響

稱取1.0 g胡椒粉于50 mL小燒杯中，加入20 mL 70%乙醇溶液，密封，浸提溫度60 ℃，時(shí)間2 h，料液比1∶20，分別提取1，2，3，4次，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取次數(shù)對(duì)胡椒堿提取率的影響

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，胡椒堿的提取率逐漸增加，但考慮到提取成本，選擇提取次數(shù)為2～3次為宜。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)L16(45)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化胡椒堿的提取工藝參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案及其結(jié)果

續(xù) 表

由表2可知，5個(gè)因素對(duì)胡椒堿提取效果影響次序?yàn)锳>C>D>E>B，即溫度>料液比>時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取次數(shù)。最佳優(yōu)化組合為A4B4C4D1E3，即提取溫度為65 ℃，乙醇濃度為75%，料液比為1∶30，提取時(shí)間為0.5 h，提取次數(shù)為3次。

2.2 大孔樹(shù)脂法純化胡椒堿

2.2.1 大孔樹(shù)脂種類的篩選

選擇9種大孔樹(shù)脂，以胡椒堿的吸附率為指標(biāo)，篩選出對(duì)胡椒堿吸附效果最好的大孔樹(shù)脂用于純化經(jīng)乙醇浸提法提取的胡椒堿粗品，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同大孔數(shù)脂對(duì)胡椒堿吸附率的影響

由圖6可知，不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂對(duì)胡椒堿的吸附效果排序?yàn)锳B-8>D-280>D-101>D-151>X-5>D-4006>NKA-9>NKA>NKA-2，因此，選擇AB-8這種大孔數(shù)脂用于純化胡椒堿。

2.2.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸參數(shù)的優(yōu)化

2.2.2.1 胡椒堿溶液濃度對(duì)大孔樹(shù)脂吸附性能的影響

為得到上柱的胡椒堿溶液的最佳濃度，以胡椒堿靜態(tài)吸附率為指標(biāo)，考察不同胡椒堿濃度對(duì)吸附率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 胡椒堿濃度對(duì)吸附率的影響

當(dāng)上柱液濃度為1.1 mg/mL時(shí)，大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)胡椒堿的吸附率達(dá)到最大值87.9%。此后隨胡椒堿濃度的增大，吸附率呈下降趨勢(shì)，可能是大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)胡椒堿在濃度為1.1 mg/mL時(shí)吸附達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，選擇上柱的胡椒堿溶液濃度為1.1 mg/mL。2.2.2.2 胡椒堿溶液pH對(duì)大孔樹(shù)脂吸附性能的影響

為得到上柱的胡椒堿溶液的最佳pH，以胡椒堿靜態(tài)吸附率為指標(biāo)，考察不同胡椒堿溶液pH對(duì)吸附率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 胡椒堿溶液pH對(duì)吸附率的影響

當(dāng)胡椒堿溶液pH值為6時(shí)，大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)胡椒堿的吸附率達(dá)到最大值88.5%。當(dāng)pH值大于6后，隨著pH的增大，吸附率呈下降趨勢(shì)，可能是由于pH增大以后，溶液中形成了一些不利于吸附的鹽類物質(zhì)，影響了大孔樹(shù)脂的吸附效果。因此，選擇上柱的胡椒堿溶液pH為6。

2.2.2.3 解吸液濃度對(duì)大孔樹(shù)脂解吸性能的影響

將已經(jīng)吸附好胡椒堿的AB-8樹(shù)脂分別加入20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇，密封避光靜置解吸12 h后收集洗脫液并測(cè)定解吸率，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)胡椒堿解吸率的影響

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率逐漸上升，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，可以解吸70%以上的胡椒堿。因此，選擇解吸液濃度為70%。

2.2.2.4 解吸液pH對(duì)大孔樹(shù)脂解吸性能的影響

將已經(jīng)吸附好胡椒堿的AB-8樹(shù)脂分別加入不同pH的70%乙醇，密封避光靜置解吸12 h后收集洗脫液并測(cè)定解吸率，結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 乙醇溶液pH對(duì)胡椒堿解吸率的影響

隨著乙醇洗脫溶液pH的增大，大孔樹(shù)脂AB-8的解吸率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)pH為5時(shí)，其解吸率達(dá)到最大值69.8%；當(dāng)pH大于5以后，隨著pH的增大，解吸率呈下降趨勢(shì)。因此，選擇解吸液pH為5。

2.2.3 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸參數(shù)的優(yōu)化

將濃度為1.1 mg/mL，pH為6的胡椒堿溶液加入到AB-8大孔樹(shù)脂層析柱上，充分吸附后經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為70%，pH為5的乙醇溶液洗脫，以累計(jì)洗脫率為指標(biāo)，考察洗脫液的體積對(duì)AB-8大孔樹(shù)脂洗脫效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖11。

當(dāng)洗脫液體積大于5 BV時(shí)，胡椒堿的累積洗脫率基本維持不變，說(shuō)明胡椒堿已基本洗脫完全，故收集1～5 BV的洗脫液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去掉有機(jī)溶劑，測(cè)得胡椒堿的純度由粗提物的14.46%上升到69.32%。

圖11 洗脫液體積對(duì)解吸效果的影響

2.3 C18層析柱純化胡椒堿

將純度為69.32%的胡椒堿粗提物經(jīng)C18層析柱進(jìn)一步純化，以洗脫率為指標(biāo)，考察洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖12。

圖12 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫率的影響

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，胡椒堿的洗脫率達(dá)到最大值75.1%。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去掉有機(jī)溶劑，獲得胡椒堿結(jié)晶。經(jīng)HPLC方法鑒定，其純度由69.32%上升為81.62%。

3 結(jié)論

采用乙醇浸提法提取胡椒中的活性成分胡椒堿，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)研究了乙醇濃度、溫度、時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響，得到最佳提取工藝條件：提取溫度為65 ℃，乙醇濃度為75%，料液比為1∶30，提取時(shí)間為0.5 h，提取次數(shù)為3次。

采用大孔樹(shù)脂法純化了胡椒提取物中的胡椒堿，通過(guò)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到了胡椒堿最佳純化工藝條件：大孔樹(shù)脂類型為AB-8，上柱的胡椒堿濃度為1.1 mg/mL， pH值6，用5倍體積分?jǐn)?shù)為70%、pH值為5的乙醇溶液洗脫，得到的胡椒堿結(jié)晶純度由16.46%上升由69.32%。

采用C18層析柱進(jìn)一步純化胡椒堿結(jié)晶，用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇溶液洗脫，經(jīng)HPLC方法鑒定得到的胡椒堿晶體純度從69.32%上升為81.62%。

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Research on the Extraction and Purification Technology of Piperine

DENG Hao1, ZHANG Rong-hu1*, DOU Zhi-hao1, LIANG Zhen-yi2, FENG Jian-cheng2, JIANG Yao2

(1.Institute of Processing & Design of Agro-products, Hainan Academy of Agricultural Science, Haikou 571100, China; 2.College of Materials and Chemical Engineering, Hainan University, Haikou 571100, China)

The piperine is extracted from pepper with ethanol extraction method, and the optimal extraction conditions are determined by single factor and L16(45) orthogonal experiments: the ethanol concentration of 75%, the extraction temperature of 65 ℃, the solid-liquid ratio of 1∶30, the extraction time of 0.5, the extraction times of 3. Based on the static and dynamic experiments, the optimal purification conditions for piperine separated by macroporous resins are obtained as follows: the type of macroporous resins of AB-8, the extract concentration of 1.1 mg/mL and the pH of 6, the eluted liquid of 75% (V/V) ethanol solution and pH of 5, the purity of piperine increases from 16.46% to 69.32%. Finally, the crude product of piperine is purified by C18column, and eluted by 90% (V/V) ethanol solution, and the purity of piperine increases to 81.26% measured by HPLC method.

piperine; extraction; separation and purification; macroporous resin

2016-07-13 *通訊作者

海南省科學(xué)事業(yè)費(fèi)項(xiàng)目(KYYS-2013-11)

鄧浩(1987-)，男，講師，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。

TS202.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.028

1000-9973(2017)01-0122-06