單增李斯特菌nox基因的克隆、表達(dá)以及功能

吳 嫚，李 森，陳國薇，羅 勤，劉武康，丁承超，董慶利，劉 箐,*

單增李斯特菌nox基因的克隆、表達(dá)以及功能

吳 嫚1，李 森1，陳國薇1，羅 勤2，劉武康1，丁承超1，董慶利1，劉 箐1,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079）

以GenBank中報道的單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）野生型菌株EGDe的nox基因（GenBank ID：986631）為研究對象，探討在高等動植物中普遍存在的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶在Lm中是否也可以介導(dǎo)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。首先通過誘導(dǎo)nox基因在BL21中表達(dá)產(chǎn)生Nox蛋白，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot鑒定該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量；然后構(gòu)建過表達(dá)菌株EGDe-nox，測定ROS產(chǎn)生情況，并使用實時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測nox基因的過表達(dá)對Lm毒力基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，經(jīng)鑒定Nox蛋白分子質(zhì)量約為33 kD，過表達(dá)菌株EGDe-nox與對照組EGDe的ROS產(chǎn)生量相比并無多大變化，nox基因的過表達(dá)會導(dǎo)致與侵襲相關(guān)的基因actA、inlA和inlB以及毒力基因prfA的表達(dá)上調(diào)。由此推測，該Nox蛋白不能獨立主導(dǎo)ROS的產(chǎn)量，但其過表達(dá)卻可以增強(qiáng)毒力基因表達(dá)上調(diào)。本研究為繼續(xù)探討細(xì)菌中Nox的作用提供一定的參考依據(jù)。

單增李斯特菌；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶；nox基因；活性氧

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是革蘭氏陽性兼性厭氧菌，能引起多種人畜共患疾病，是公認(rèn)的具有嚴(yán)重危害的食源性致病菌之一[1]。Lm可穿透腸道、血腦、胎盤屏障，感染后易造成孕婦死產(chǎn)、流產(chǎn)、腦膜炎和胃腸道疾病等，所引起的死亡率高達(dá)20%～30%[2-3]，因此是胞內(nèi)寄生菌的模式菌株。有研究發(fā)現(xiàn)，Lm在面臨抗生素、溫度、高鹽等的脅迫后，可以迅速聚集、形成胞外多糖最后形成菌膜（biofilm，BF）來對應(yīng)脅迫環(huán)境[4]，因此在食品加工過程中可黏附在食品加工設(shè)備上難以清除，造成食品加工的二次污染[5-6]。近年有證據(jù)顯示，菌膜的形成與活性氧（reactive oxygen species，ROS）有關(guān)[7-9]，但細(xì)菌中ROS的產(chǎn)生機(jī)制尚不完全清晰。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NAD(P)H oxidase），簡稱NAD(P)H氧化酶，是一種高等動植物細(xì)胞產(chǎn)生ROS的最主要酶之一。該酶由gp91phox、p22phox、p40phox、p47phox和p67phox 5 個亞基組成，gp91phox和p22phox位于質(zhì)膜上，當(dāng)與細(xì)胞漿中的另外幾種亞基結(jié)合則可形成有活性的NAD(P)H氧化酶復(fù)合體[10]。其中g(shù)p91phox是關(guān)鍵亞基，共有7 種亞型，分別由7 個基因（nox1、nox2、nox3、nox4、nox5、Duox1和Duox2）編碼，統(tǒng)稱noxs。NAD(P)H氧化酶有一個共同特點就是對多種環(huán)境脅迫敏感并可被瞬時激活，而由其介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS則可參與多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因表達(dá)調(diào)控[11-13]。其中作為動植物NAD(P)H氧化酶家族中的一員，NADH氧化酶已被證明在多數(shù)微生物中存在[14]。在動植物細(xì)胞中NAD(P)H氧化酶的組成及功能已經(jīng)有很透徹的研究，但在細(xì)菌中，和高等動植物功能相近的NADH氧化酶僅有初步研究，按照其底物及所產(chǎn)生ROS的不同，在細(xì)菌中將該酶初步統(tǒng)稱NOX，而由于尚不清楚該酶是由哪種基因編碼，所以在細(xì)菌中統(tǒng)稱為nox基因。Derr等[15]在研究變異鏈球菌nox敲除株在酸環(huán)境和氧環(huán)境下NADH氧化酶的功能時得出結(jié)論，nox的缺失會使氧化應(yīng)激反應(yīng)酶超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶的活性提高，進(jìn)而會導(dǎo)致缺失菌株很難適應(yīng)氧環(huán)境；與此相反，nox的缺失會提高菌株在低pH值環(huán)境下的生長能力。Liu Juanjuan等[16]通過加入H2O2和魚藤酮抑制劑來研究ROS對萊氏野村菌微菌核產(chǎn)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS可以促進(jìn)微菌核的發(fā)展，并且還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)nox基因與胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生有關(guān)。1991年P(guān)atchett等[17]在研究單增李斯特菌（NCTC 7973）有氧代謝過程中，通過外源加入呼吸鏈抑制劑的方法，首次證實單增李斯特菌中存在Noxs酶活性，且其活性部位存在于細(xì)胞膜上，但是關(guān)于單增李斯特菌中的Noxs后續(xù)無更深入的報道。近年來GenBank中報道的不同血清型的nox基因序列多達(dá)8 種，但關(guān)于這些基因的功能尚無報道。為了進(jìn)一步研究Lm中Noxs的功能，本研究從NCBI基因庫中找到了來自Lm的疑似nox基因的序列（GenBank ID：986631，633 bp），克隆該基因并誘導(dǎo)產(chǎn)生Nox蛋白，利用Western blot來進(jìn)一步鑒定該重組蛋白，并且構(gòu)建nox基因過表達(dá)菌株來研究該nox基因的過表達(dá)對ROS生成的影響，以及nox的過表達(dá)對Lm中毒力基因的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌株EGDe及穿梭載體pERL3（含有紅霉素抗生素標(biāo)記）為華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院羅勤老師饋贈；表達(dá)載體pET30a為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室張紅生老師饋贈。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

腦心浸液培養(yǎng)基、酵母浸粉 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；胰蛋白胨 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和SalⅠ、rTaq DNA聚合酶、dNTP mix、DNA marker、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶TaRaKa公司；抗His-tag兔多克隆抗體、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；山羊抗兔抗體 美國LI-COR公司；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀 美國Applied Biosystems公司；G：BOX凝膠成像系統(tǒng) 英國Syngene公司；瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）設(shè)備 美國Bio-Rad公司；SpectraMax M2酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng) 美國LI-COR公司。

1.3 方法

1.3.1 EGDe中nox基因的驗證

表1 實驗中用到的PCR引物Table1 PCR primers used in this study

用引物nox-F、nox-R（表1）對Lm野生型菌株EGDe進(jìn)行nox基因片段擴(kuò)增，PCR程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸70 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，之后進(jìn)行重組載體T-nox的構(gòu)建。

1.3.2 重組質(zhì)粒T-nox的構(gòu)建

使用pMD-19-T載體與nox基因連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR（引物nox-F和nox-R）和XhoⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定。鑒定為陽性的克隆由華大科技公司測序，并將測序正確的陽性克隆命名為T-nox。

1.3.3 表達(dá)載體pET30a-nox的構(gòu)建

以質(zhì)粒T-nox為模板，用引物nox-F和nox-R擴(kuò)增nox基因。用XhoⅠ和SalⅠ雙酶切nox基因和載體pET30a，然后利用T4DNA連接酶將目的片段與載體相連接，重組質(zhì)粒pET30a-nox轉(zhuǎn)化入BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR（引物nox-F和nox-R，PCR程序見1.3.1節(jié)）和XhoⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定。鑒定為陽性的克隆由華大科技公司測序，并將測序正確的陽性克隆分別命名為pET30a-nox。

1.3.4 重組蛋白的表達(dá)條件下

37 ℃搖床培養(yǎng)100 mL含有重組質(zhì)粒pET30a-nox的BL21菌，OD值為0.7后，取10 mL作對照，剩下的菌液中加入IPTG誘導(dǎo)，終濃度為0.1 mmol/L，37 ℃、200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，對照組和誘導(dǎo)組分別使用低溫高速離心機(jī)，8 000 r/min離心6 min，收集菌體沉淀。重懸于4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液中，混勻，8 000 r/min離心6 min洗滌3 次，收集菌體沉淀于PBS中，冰浴超聲破菌，4 ℃條件下8 000×g離心20 min，收集上清液[18]。

重組蛋白經(jīng)膠濃度為15%的SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)R-250染色檢測蛋白表達(dá)。脫色方法：倒入脫色液，恒溫振蕩儀上搖晃脫色，脫色液顏色變深后，倒掉液體重新加入脫色液，搖晃，重復(fù)該步多次，直至膠的顏色接近透明，取出，觀察。

1.3.5 Western blot鑒定

重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene f uoride，PVDF）上，用10%脫脂奶粉輕搖封閉2 h，TBST（Tris-HCl緩沖鹽溶液＋吐溫）緩沖液沖洗3 次，加入用10 mg/mL 牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）稀釋的抗His-tag兔多克隆抗體，于4 ℃條件下輕搖過夜，TBST洗3 次，再加入用BSA稀釋的山羊抗兔抗體避光輕搖1 h，避光用TBST洗3 次，掃描觀察條帶。

1.3.6 nox過表達(dá)菌株的構(gòu)建

按照1.3.3節(jié)的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pERL3-nox，并電轉(zhuǎn)入Lm野生型菌株EGDe中。通過抗性板子篩選，PCR鑒定（PCR程序見1.3.1節(jié)），將陽性克隆命名為EGDe-nox。

1.3.7 過表達(dá)菌株EGDe-nox的活性氧測定

由于該過表達(dá)菌株在培養(yǎng)時需加紅霉素，所以本實驗把空載體pERL3電轉(zhuǎn)入EGDe中作對照菌并命名為EGDe-pERL3。菌株EGDe-nox和EGDe-pERL3挑單菌落過夜培養(yǎng)，第2天以1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，直至OD600nm達(dá)到0.3，各取1 mL菌液8 000 r/min離心6 min，去上清液，并用PBS（pH 7.4）重懸浮，加入20 μmol/L DCFH-DA混勻，吸取150 μL重懸液加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每種菌6 個平行。密封后置于37 ℃條件下避光保存，0.5 h和1 h后用酶標(biāo)儀檢測每孔菌液的熒光值（λ488nm～λ530nm）。DCFH-DA本身沒有熒光，但是它可以穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后被酯酶水解生成DCFH，而細(xì)胞里的ROS將無熒光的DCFH氧化成有熒光的7’-二氯熒光素（7’-dichlorofluorescein，DCF），因此檢測DCF的熒光可間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平[19]。

1.3.8 EGDe過表達(dá)nox基因后對其毒力基因的影響

吸取5 mL重懸菌液，靜置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后添加1 mL苯酚-乙醇（1∶9，V/V）4 ℃低溫混合液，冰上孵育30 min。將樣品5 000×g離心5 min，收集沉淀菌體。將沉淀菌體用裂解液（包含50 μL 250 U/mL的變?nèi)芫睾?0 μL 25 mg/mL的溶菌酶）進(jìn)行重懸，超聲溶解30 min。采用Trizol法提取裂解液中的RNA。采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以制得的cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 nox基因的克隆與表達(dá)

2.1.1 EGDe中nox基因的鑒定結(jié)果

圖1 PCR鑒定EGDee中的nnooxx基因結(jié)果Fig. 1 Detection of nox from EGDe by PCR

利用引物nox-F和nox-R對EGDe進(jìn)行nox基因的擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，泳道1、2為EGDe的nox基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，從圖中可看到在633 bp處皆有目的條帶出現(xiàn)，說明在EGDe中有nox基因序列存在。

2.1.2 重組載體T-nox的構(gòu)建結(jié)果鑒定

圖2 重組載體T-nnooxx的PCR（A）及雙酶切（B）鑒定結(jié)果Fig. 2 Detection of recombinant vector T-nox by PCR (A) and identification by double restriction enzyme digestion (B)

利用引物nox-F和nox-R對陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖2A所示，得到如預(yù)期大?。?33 bp）的PCR產(chǎn)物；圖2B顯示的是用XhoⅠ和SalⅠ雙酶切之后的結(jié)果，上面的條帶是T載體，下面的條帶則是嵌合的基因nox。這兩種鑒定結(jié)果證明nox基因已正確和T載體連接，測序結(jié)果正確率達(dá)到99%以上，進(jìn)一步證明連接正確。

2.1.3 重組載體pET30a-nox構(gòu)建結(jié)果鑒定

圖3 重組質(zhì)粒pET300aa--nnooxx的PCR（A）和雙酶切（B）鑒定結(jié)果Fig. 3 Detection of recombinant plasmid pET30a-nox by PCR (A) and identification by double restriction enzyme digestion (B)

重組質(zhì)粒pET30a-nox鑒定結(jié)果如圖3A、B所示，A圖是用引物nox-F和nox-R對10 個單克隆進(jìn)行PCR鑒定，泳道2、4、8在633 bp處出現(xiàn)目的條帶，說明這3 個單克隆為陽性克??；對陽性克隆進(jìn)行XhoⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖B泳道11～22，在5 000 bp上一點各有一條帶為酶切后的pET30a質(zhì)粒條帶，原pET30a大小為5 422 bp，而在633 bp處也各有一條帶，為酶切后的nox基因片段。重組質(zhì)粒pET30a-nox測序結(jié)果正確率99%以上，證明該質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.1.4 pET30a-nox表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

圖4 pET300aa--nnooxx表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAAGGEE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of expression products of pET30a-nox

將重組的pET30a-nox轉(zhuǎn)入表達(dá)型大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過蛋白電泳并染色脫色后的條帶結(jié)果如圖4所示。對誘導(dǎo)前泳道和誘導(dǎo)后泳道的對比發(fā)現(xiàn)，在25 kD和33 kD處的蛋白條帶均在誘導(dǎo)后出現(xiàn)了表達(dá)升高。泳道1為未誘導(dǎo)組，在33、25 kD處出現(xiàn)的條帶比較淡；泳道2為誘導(dǎo)組，和未誘導(dǎo)組相比，誘導(dǎo)后33、25 kD處的條帶顏色較深，說明這兩個蛋白都極有可能是實驗中誘導(dǎo)出來的重組蛋白。

2.1.5 Western blot鑒定結(jié)果

圖5 pET30a--nox表達(dá)產(chǎn)物Western bloott分析Fig. 5 Analysis of over-expressed products of pET30a-nox by Western blot

為了識別正確的Nox重組蛋白條帶，本實驗用Western blot方法進(jìn)行驗證。由于pET30a-nox表達(dá)產(chǎn)物中加有組氨酸標(biāo)簽（Histidine-tag，His-tag），所以使用抗His-tag抗體識別正確的Nox重組蛋白。如圖5所示，泳道1是沒有誘導(dǎo)的上清液，在33 kD處出現(xiàn)很細(xì)的條帶，泳道2是誘導(dǎo)后的上清液，在33 kD處出現(xiàn)目標(biāo)條帶，顏色較深，寬度大，說明誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)升高。與SDS-PAGE相比25 kD處無陽性條帶，說明重組蛋白Nox的分子質(zhì)量約為33 kD。根據(jù)目的基因片段大小預(yù)測的蛋白分子質(zhì)量約為25 kD，后來從載體pET30a圖譜上發(fā)現(xiàn)，除去目的基因，載體上的兩段His標(biāo)簽之間還夾雜著S標(biāo)簽以及其他堿基，大約7～8 kD，所以Western blot結(jié)果圖上只有約33 kD的蛋白會有陽性條帶。

2.2 nox基因的功能研究

2.2.1 過表達(dá)菌株EGDe-nox結(jié)果鑒定

圖6 PCR鑒定過表達(dá)菌株EGDe-nnooxx結(jié)果Fig. 6 Detection of EGDe-nox by PCR

利用引物pERL3-F和pERL3-R對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，為了得到更好的鑒定結(jié)果，對引物pERL3-F和pERL3-R進(jìn)行了設(shè)計，雖然該對引物起始于質(zhì)粒pERL3上，但是復(fù)制的序列恰好包含了連接的nox基因片段部分，結(jié)果如圖6所示。泳道1～2為EGDe陰性對照，由于內(nèi)部不含質(zhì)粒，無條帶出現(xiàn)；3～4為質(zhì)粒pERL3，由于純質(zhì)粒中無nox基因連接部分，所以出現(xiàn)的條帶僅僅是擴(kuò)增質(zhì)粒上的部分序列，大小約為410 bp；5～6為重組質(zhì)粒pERL3-nox的陽性對照，由于擴(kuò)增部分包含nox基因部分，所以條帶應(yīng)比3～4條帶大，而又比3～4條帶和nox基因片段之和（1 043 bp）小，因為雙酶切部分會去掉質(zhì)粒上小部分片段；而7～10為轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)增得到的條帶與6～7陽性對照大小一致，則說明重組質(zhì)粒pERL3-nox已正確插入EGDe中。此鑒定結(jié)果證明過表達(dá)菌株EGDe-nox構(gòu)建成功。

2.2.2 過表達(dá)菌株EGDe-nox活性氧測定結(jié)果

過表達(dá)菌株EGDe-nox活性氧測定結(jié)果如圖7所示，圖中以EGDe-pERL3為對照，將其設(shè)定為1.0。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，雖然EGDe-nox在0.5 h和1 h測得的活性氧比對照菌偏高，但是僅僅偏高2.6%和2.5%，并沒有太大的變化。

圖7 7 noxnox過表達(dá)后對EGDe活性氧的影響Fig. 7 Influence of nox over-expression on ROS production in EGDe

2.2.3 nox基因的過表達(dá)對其他毒力基因表達(dá)的影響

圖8 8 noxnox基因的過表達(dá)對其他毒力基因表達(dá)的影響Fig. 8 Influence of nox over-expression on the expression of other virulent genes in EGDe

實時熒光定量PCR的結(jié)果處理都是以EGDe各相應(yīng)的基因為對照為1，所以圖8中顯示的柱狀圖都是EGDe-nox中的基因的相對表達(dá)量，高于1則為表達(dá)上調(diào)，低于1則為表達(dá)下調(diào)。從圖中可以看出，nox基因過表達(dá)了接近9 倍，而因此受影響最大的是sigB和prfA，分別上調(diào)了6.5 倍和5.5 倍。sigB是單增李斯特菌對環(huán)境脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)的主要調(diào)控因子[20-21]，而prfA是單增李斯特菌的毒力基因，由轉(zhuǎn)錄活化因子PrfA調(diào)控[22]。從圖中也可以發(fā)現(xiàn)，其余基因actA、inlA、inlB以及vip都有上調(diào)，而actA、inlA和inlB都是單增李斯特菌中和侵襲相關(guān)的基因[23-24]，因此nox基因的過表達(dá)也許會導(dǎo)致單增李斯特菌的侵襲能力加強(qiáng)。

3 討 論

通過以上研究表明，EGDe中nox基因（GenBank ID：986631）可誘導(dǎo)表達(dá)33 kD蛋白質(zhì)，為以后純化蛋白從蛋白結(jié)構(gòu)上分析該Nox蛋白與Noxs的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。而從nox的過表達(dá)對ROS產(chǎn)生影響的實驗結(jié)果可以看出，該nox基因的過表達(dá)對Lm中ROS的產(chǎn)生并沒有多大影響，有可能是因為本研究使用的nox基因序列（GenBank ID：986631）單獨過表達(dá)不足以引起ROS的變化，也許該Nox蛋白不能獨立主導(dǎo)ROS的產(chǎn)量；也有可能是由于重組質(zhì)粒在菌體內(nèi)表達(dá)的過程中，形成包涵體，無法繼續(xù)發(fā)揮其作用。qRT-PCR的數(shù)據(jù)表明nox的過表達(dá)可以導(dǎo)致黏附基因inlA和inlB的表達(dá)上調(diào)，而Muchnik等[25]也發(fā)現(xiàn)NADH氧化酶在肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）毒性中的作用類似黏附素，說明nox基因的作用也許和Lm的毒力有關(guān)。

noxs基因在高等動植物細(xì)胞中的研究已趨于成熟，而在細(xì)菌中的研究則少之又少，目前僅在19種細(xì)菌中報道了noxs基因[11]。根據(jù)產(chǎn)生ROS功能的不同，noxs基因分為3 種，第1種是需氧菌中專門產(chǎn)生H2O2的nox1[26]；第2種是厭氧菌專門產(chǎn)生H2O的nox2[27]；第3種是專門產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2－·）的nox3[26]。Patchett等[17]在研究Lm（NCTC 7973）氧化代謝過程中，通過外源加入NADH方法，首次證實Lm中存在Noxs酶活性。但是已報道的19 種菌中卻不包含Lm，于是本實驗室對該19 種菌的noxs基因進(jìn)行BLAST、DNAstar等軟件比對后發(fā)現(xiàn)，嗜熱菌（Thermus thermophilus HBB）中的nox1基因所表達(dá)的蛋白序列，在L型菌株EGDe中存在高度相似性氨基酸序列。

本實驗中所使用的序列正是從EGDe基因組中找到的疑似nox1基因序列（GenBank ID：986631），但是經(jīng)過同源性對比，發(fā)現(xiàn)其和高等動植物的nox1基因同源性較低。至2015年8月，NCBI已公布8 種來自Lm不同血清型的NADH氧化酶序列，但不知這8 種序列在Lm上產(chǎn)生的作用是否和高等動植物的NADH氧化酶一樣，也不知不同血清型之間，nox基因有什么區(qū)別和聯(lián)系。本實驗使用的來自EGDe的基因序列（Gene ID：986631），但實驗結(jié)果顯示該基因和ROS產(chǎn)生沒有明顯相關(guān)性，而且該基因大小與NADH氧化酶的關(guān)鍵亞基gp91phox的編碼基因的大小并不一致，也許其是編碼其他亞基的基因，在ROS方面的功能并不突出，但卻足以引起其他毒力基因表達(dá)水平的改變。至于剩余的7 種來自Lm不同血清型的NADH氧化酶序列及功能，尚需繼續(xù)探索。

[1] SCHLECH W F, ACHESON D. Foodborne Listeriosis[J]. Clinical Infectious Diseases, 2000, 31(3): 770-775. DOI:10.1086/314008.

[2] ROCOURT J, JACQUET C, REILLY A. Epidemiology of human listeriosis and seafoods[J]. International Journal of Food Microbiology, 2000, 62(3): 197-209. DOI:10.1016/S0168-1605(00)00336-6.

[3] 阮明捷, 游川, 李書明, 等. 1 例單核細(xì)胞增生李斯特菌感染引起孕婦的雙胎兒死亡的調(diào)查報告[J]. 慢性病學(xué)雜志, 2015(3): 353-355. DOI:10.16440/j.cnki.1674-8166.2015.03.043.

[4] 吳嫚, 李森, 吳淑燕, 等. 食源性致病菌菌膜形成影響因素研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2015, 36(5): 239-243. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201505044.

[5] O’TOOLE G, KAPLAN H B, KOLTER R. Biofilm formation as microbial development[J]. Annual Review of Microbiology, 2000, 54(1): 49-79. DOI:10.1146/annurev.micro.54.1.49.

[6] STOODLEY P, WILSON S，HALL-STOODLEY L, et al. Growth and detachment of cell clusters from mature mixed-species biof lms[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(12): 5608-5613. DOI:10.1128/AEM.67.12.5608-5613.2001.

[7] ROSSETI I B, ROCHA J B, COSTA M S. Diphenyl diselenide (PhSe)2 inhibits biofilm formation by Candida albicans, increasing both ROS production and membrane permeability[J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2015, 29: 289-295. DOI:10.1016/ j.jtemb.2014.08.001.

[8] BERLUTTI F, MOREA C, BATTISTONI A, et al. Iron availability inf uences aggregation, biof lm, adhesion and invasion of Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia[J]. International Journal of Immunopathology and Pharmacology, 2005, 18(4): 661-670. DOI:10.1177/039463200501800407.

[9] KULKARNI R, ANTALA S, WANG A, et al. Cigarette smoke increases Staphylococcus aureus biofilm formation via oxidative stress[J]. Infection and Immunity, 2012, 80(11): 3804-3811. DOI:10.1128/IAI.00689-12.

[10] 冷麗麗, 唐圣松. NADPH氧化酶NOX家族的組織分布及生理功能[J]. 國際病理科學(xué)與臨床雜志, 2008(1): 19-23. DOI:10.3969/ j.issn.1673-2588.2008.01.005.

[11] 陳國薇, 張超, 董慶利, 等. noxs: 病原菌菌膜形成及毒力調(diào)控的潛在靶點[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(3): 234-237. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201403047.

[12] AHNMAD P, SARWAT M, SHARMA S. Reactive oxygen species, antioxidants and signaling in plants[J]. Journal of Plant Biology, 2008, 51(3): 167-173. DOI:10.1007/BF03030694.

[13] KRESLAVSKI V D, LOS D A, ALLAKHVERDIEV S I, et al. Signaling role of reactive oxygen species in plants under stress[J]. Russian Journal of Plant Physiology, 2012, 59(2): 141-154. DOI:10.1134/S1021443712020057.

[14] 劉娟娟. 萊氏野村菌微菌核形成中NADH氧化酶基因及活性氧的功能研究[D]. 重慶: 重慶大學(xué), 2014: 6-8.

[15] DERR A M, FAUSTOFERRI R C, BETZENHAUSER M J, et al. Mutation of the NADH oxidase gene (nox) reveals an overlap of the oxygen- and acid-mediated stress responses in Streptococcus mutans[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(4): 1215-1227. DOI:10.1128/AEM.06890-11.

[16] LIU Juanjuan, YIN Youping, SONG Zhangyong, et al. NADH: f avin oxidoreductase/NADH oxidase and ROS regulate microsclerotium development in Nomuraea rileyi[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2014, 30(7): 1927-1935. DOI:10.1007/s11274-014-1610-7.

[17] PATCHETT R A, KELLY A F, KROLL R G. Respiratory activity in Listeria monocytogenes[J]. FEMS Microbiology Letters, 1991, 78(1): 95-98. DOI:10.1111/j.1574-6968.1991.tb04424.x.

[18] 郝海霞. 剛地弓形蟲肌動蛋白基因的克隆、表達(dá)及重組蛋白的保護(hù)性免疫[D]. 太原: 山西醫(yī)科大學(xué), 2012: 16-26. DOI:10.7666/ d.y2126846.

[19] STEPANOVI? S, ?IRKOVI? I, RANIN L, et al. Biof lm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface[J]. Letters in Applied Microbiology, 2004, 38(5): 428-432. DOI:10.1111/ j.1472-765X.2004.01513.x.

[20] KAZMIERCZAK M J, MITHOE S C, BOOR K J, et al. Listeria monocytogenes sigmaB regulates stress response and virulence functions[J]. Journal of Bacteriology, 2003, 185(19): 5722-5734. DOI:10.1128/JB.185.19.5722-5734.2003.

[21] KIM H, MARQUIS H, BOOR K J. SigmaB contributes to Listeria monocytogenes invasion by controlling expression of inlA and inlB[J]. Microbiology, 2005, 151(10): 3215-3222. DOI:10.1099/mic.0.28070-0.

[22] DRAMSI S, KOCKS C, FORESTIER C, et al. Internalin-mediated invasion of epithelial cells by Listeria monocytogenes is regulated by the bacterial growth state, temperature and the pleiotropic activator prfA[J]. Molecular Microbiology, 1993, 9(5): 931-941. DOI:10.1111/ j.1365-2958.1993.tb01223.x.

[23] GAILLARD J L, BERCHE P, FREHEL C, et al. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci[J]. Cell, 1991, 65(7): 1127-1141. DOI:10.1016/0092-8674(91)90009-N.

[24] DRAMSI S, BISWAS I, MAGUIN E, et al. Entry of Listeria monocytogenes into hepatocytes requires expression of InlB, a surface protein of the internalin multigene family[J]. Molecular Microbiology, 1995, 16(2): 251-261. DOI:10.1111/j.1365-2958.1995.tb02297.x.

[25] MUCHNIK L, ADAWI A, OHAYON A, et al. NADH oxidase functions as an adhesin in Streptococcus pneumoniae and elicits a protective immune response in mice[J]. PLoS ONE, 2013, 8(6): e61128. DOI:10.1371/annotation/7fbc524a-4035-401e-8cc7-93393afc35fd.

[26] HIGUCHI M, YAMAMOTO Y, KAMIO Y. Molecular biology of oxygen tolerance in lactic acid bacteria: functions of NADH oxidases and Dpr in oxidative stress[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000, 90(5): 484-493. DOI:10.1016/S1389-1723(01)80028-1.

[27] GAO Hui, TIWARI M K, KANG Yunchan, et al. Characterization of H2O-forming NADH oxidase from Streptococcus pyogenes and its application in L-rare sugar production[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22(5): 1931-1935. DOI:10.1016/ j.bmcl.2012.01.049.

Gene Cloning, Expression and Functional Charaterization of NAD(P)H Oxidases Gene (nox) from Listeria monoeytogenes

WU Man1, LI Sen1, CHEN Guowei1, LUO Qin2, LIU Wukang1, DING Chengchao1, DONG Qingli1, LIU Qing1,*
(1. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. College of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, China)

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases (Nox) is ubiquitous in higher animals and plants, and it is responsible for generating reactive oxygen species (ROS). The aim of this work was to explore whether the NOX mediates the generation of ROS in Listeria monocytogenes (Lm). The nox gene from the wild-type Listeria monocytogenes EGDe (GenBank ID: 986631) was tested. The gene was induced to express Nox in Escherichia coli BL21 and the molecular weight of the expressed enzyme was measured by using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot. Then the over-expressed strain EGDe-nox was built to detect ROS production and examine the influence of nox gene over-expression on the expression of virulence genes by using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-qPCR). The results showed that the molecular weight of the recombinant Nox was about 33 kD. Compared with EGDe, the ROS production of EGDe-nox was not changed significantly. The over-expression of nox resulted in up-regulated expression of the invasion-related genes actA, inlA and inlB and the virulence gene prfA. These results suggest that the Nox is unable to dominate ROS production independently but its over-expression can up-regulate the expression of virulence genes.

Listeria monocytogenes; NADH oxidase; nox; reactive oxygen species (ROS)

10.7506/spkx1002-6630-201702008

Q935

A

1002-6630（2017）02-0046-06

吳嫚, 李森, 陳國薇, 等. 單增李斯特菌nox基因的克隆、表達(dá)以及功能[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 46-51. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702008. http://www.spkx.net.cn

WU Man, LI Sen, CHEN Guowei, et al. Gene cloning, expression and functional charaterization of NAD(P)H oxidases gene (nox) from Listeria monoeytogenes[J]. Food Science, 2017, 38(2): 46-51. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201702008. http://www.spkx.net.cn

2016-03-18

國家自然科學(xué)基金面上項目（31371776）

吳嫚（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食源性致病菌致病機(jī)理。E-mail：mandy_wu1247@163.com

*通信作者：劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向為食源性致病菌致病機(jī)理、疫苗及快速檢測技術(shù)。E-mail：liuq@usst.edu.cn