李 潔，王 虹，周 洋，馬潔樂(lè)，劉小玲，林 蠡

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

團(tuán)頭魴Toll樣受體II基因的克隆與表達(dá)分析

李 潔，王 虹，周 洋，馬潔樂(lè)，劉小玲，林 蠡

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

為了研究團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)TLR2(maTLR2)在抗嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)感染中的作用，本實(shí)驗(yàn)克隆了maTLR2基因的cDNA全長(zhǎng)。結(jié)果顯示：maTLR2基因cDNA的全長(zhǎng)包括2923 bp，編碼792個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)得到的maTLR2的結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)信號(hào)肽、氨基端的亮氨酸重復(fù)基序(LRRs)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和一個(gè)胞內(nèi)的Toll/白介素(IL)-1受體區(qū)(TIR)。在嗜水氣單胞菌感染后，團(tuán)頭魴頭腎中，TLR2的表達(dá)量在6 h時(shí)顯著升高。TLR2下游相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)量也顯著上調(diào)。結(jié)果表明maTLR2在嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴后的免疫應(yīng)答中起到了重要作用。

團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)；Toll樣受體II ；表達(dá)

先天性免疫系統(tǒng)是宿主防御的古老形式，是無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物機(jī)體抵抗入侵病原微生物的有效防線[1]。在水生環(huán)境中，魚類保護(hù)自己免受各種病原微生物侵入的主要方式是通過(guò)先天或特異性免疫進(jìn)行的[2]。模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors ，PRRs)是先天性免疫的重要組成部分。PRRs識(shí)別病原體中病原體相關(guān)分子模式，觸發(fā)信號(hào)通路，激活免疫細(xì)胞以應(yīng)對(duì)病原體感染[3]。

Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)家族是PRRs中的一類[4]。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白，包括三個(gè)部分，即一個(gè)胞外氨基端亮氨酸重復(fù)基序，一個(gè)跨膜區(qū)，以及一個(gè)胞內(nèi)羧基端Toll/IL-1受體區(qū)(TIR)。胞外的LRRs是多變的，但是TIR結(jié)構(gòu)域卻高度保守[5]。TLRs在識(shí)別病原體相關(guān)模式分子之后，下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是通過(guò)TLRs的TIR與下游接頭分子的特異性結(jié)合，從而將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游途經(jīng)。TLR信號(hào)途徑大致可分為兩種：與炎癥因子產(chǎn)生相關(guān)的髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)-依賴和與干擾素產(chǎn)生相關(guān)的MyD88-非依賴的途徑。大部分的TLRs成員是依賴于MyD88信號(hào)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的[6]， TLR4是同時(shí)擁有兩個(gè)信號(hào)途徑的TLR。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，Ah)隸屬于氣單胞菌科(Aermonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，為革蘭氏陰性短桿菌，其廣泛分布于自然界的各類水體、土壤和水生動(dòng)物[7]。嗜水氣單胞菌分為致病性和非致病性菌株。致病性菌株可引起多種淡水養(yǎng)殖品種急性出血性敗血癥，并導(dǎo)致魚類大量死亡[8]。嗜水氣單胞菌可感染草魚(Ctenopharyngodonidellus)[9]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[10]、鯽(Carassiusauratus)[11]、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、羅非魚(Oreochromisniloticus)[12]、黃顙魚(Pelteobogrusfulvidraco)[13]等養(yǎng)殖品種。團(tuán)頭魴作為我國(guó)淡水養(yǎng)殖系統(tǒng)中重要的一種鯉科魚類，因其肉質(zhì)鮮美，深受廣大消費(fèi)者的青睞，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，細(xì)菌性疾病會(huì)導(dǎo)致大量的團(tuán)頭魴死亡，從而給團(tuán)頭魴養(yǎng)殖造成極大損失。而嗜水氣單胞菌感染就是引起團(tuán)頭魴細(xì)菌性疾病的一種。本研究通過(guò)研究團(tuán)頭魴在嗜水氣單胞菌感染后，先天性免疫相關(guān)的基因TLR2以及其下游相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)變化，從而探究其免疫防御機(jī)制。這為更深一步了解細(xì)菌感染后，團(tuán)頭魴抵御病原侵害時(shí)先天性免疫發(fā)揮的作用具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)團(tuán)頭魴(體重100 g)購(gòu)自湖北百榮水產(chǎn)良種有限公司，在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)基地淡水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中(水溫25～26 ℃)暫養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前，暫養(yǎng)兩周。嗜水氣單胞菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取

取30～50 mg的團(tuán)頭魴頭腎，加入Trizol試劑，充分研磨至勻漿液呈無(wú)顆粒透明狀。采用RNAiso Plus試劑盒(TAKARA)，用微量核酸測(cè)定儀NanoDrop 2000測(cè)定RNA樣品的濃度及在260 nm與280 nm處吸光值。cDNA 合成按照Takara公司PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒(TAKARA)說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.2 團(tuán)頭魴TLR2基因cDNA片段的克隆

由于團(tuán)頭魴與草魚的親緣關(guān)系近，所以本實(shí)驗(yàn)先參照草魚TLR2(ACT68333.1)克隆出團(tuán)頭魴TLR2的一段核心片段。根據(jù)核心片段的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE，根據(jù)3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase和5′-Full RACE Kit with TAP試劑盒(TAKARA)操作步驟，以團(tuán)頭魴頭腎cDNA為模板進(jìn)行套式PCR，得到團(tuán)頭魴TLR2的cDNA全長(zhǎng)。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

cDNA序列使用NCBI BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行同源性分析，使用ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的尋找，使用ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白分子量及等電點(diǎn)的預(yù)測(cè)，使用Prosite (http://prosite.expasy.org/prosite.html)預(yù)測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，使用Signal P (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)序列信號(hào)肽，使用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域。使用Mega6程序進(jìn)行序列比對(duì)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)用MEGA6構(gòu)建，重復(fù)1 000次。

1.2.4 細(xì)菌感染團(tuán)頭魴后頭腎中TLR2和TNF-α的表達(dá)變化

感染實(shí)驗(yàn)參照Wang等[10]的方法。將健康團(tuán)頭魴48尾隨機(jī)平均分為2組，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射100 μL嗜水氣單胞菌懸液(3×107CFU/mL)，對(duì)照組注射等量的0.65%生理鹽水。在注射后0、6、9、12、24和48 h取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組分別取3尾魚解剖，取頭腎組織，立即投入液氮中保存，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存用于組織RNA提取。Trizol裂解組織后，提取樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA以備熒光定量實(shí)驗(yàn)所用?；虮磉_(dá)的定量分析通過(guò)羅氏公司的480熒光定量PCR儀完成，95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)定3組重復(fù)，PCR反應(yīng)結(jié)束后,分析其溶解曲線確保反應(yīng)的特異性，β-actin作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)以Cp值輸出，相對(duì)定量分析釆用2-ΔΔCP法。SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 maTLR2基因cDNA全長(zhǎng)及序列特征

PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化、連接轉(zhuǎn)化、測(cè)序之后，得到的序列片段經(jīng)過(guò)DNAstar軟件拼接后，除去重疊序列和接頭序列，最后得到團(tuán)頭魴TLR2的cDNA全長(zhǎng)序列(所用引物見(jiàn)表1)。如圖1和圖2所示，maTLR2的cDNA全長(zhǎng)為2 923 bp，其中開(kāi)放閱讀框?yàn)? 379 bp，5′非編碼區(qū)為174 bp，3′非編碼區(qū)為370 bp，編碼792個(gè)氨基酸。使用EXPASY ProtParam網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，推測(cè)maTLR2蛋白的分子質(zhì)量是90.21 KDa，等電點(diǎn)7.07。使用TMHMM預(yù)測(cè)出maTLR2的跨膜結(jié)構(gòu)域在585～607 AA。使用Signal P預(yù)測(cè)出maTLR2的信號(hào)肽在1～22。使用EXPASY網(wǎng)站預(yù)測(cè)出maTLR2擁有9個(gè)LRR，一個(gè)TIR區(qū)。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

Tab.1 Primers used in these experiments

引物名稱序列(5'→3')引物用途TF1(forward)GTCTCCCACCCTGAAACTCTGCT核心片段1擴(kuò)增TF1(reverse)GTATCCATGCTTTAGTCATCTGC核心片段1擴(kuò)增TF2(forward)CTTGGCCTTGACCTGTCTTT核心片段2擴(kuò)增TF2(reverse)AGCAGAGTTTCAGGGTGGGAGAC核心片段2擴(kuò)增5'TR1(reverse)TTACCGAATCTACCCGAGTG5'RACE5'TR2(reverse)TATGTGTTCCTCCGTAAGTTTAGAGTTGC5'RACE5'RACEOuterPrimerCATGGCTACATGCTGACAGCCTA5'RACE5'RACEInnerPrimerCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG5'RACE3'TF1(forward)TTTATGGAACTGCCACAGGGGGAA3'RACE3'TF2(forward)TGTGCTCCTGCGAGTTTGTATCTTTCTTC3'RACE3'RACEOuterPrimerTACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3'RACE3'RACEInnerPrimerCGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG3'RACETLR2-qF(forward)GTCCCATCGGTTTAGTCTqRT-PCRTLR2-qR(reverse)TAGTCCCACCTTCTTTCGqRT-PCRβ-actinF(forward)ACCCACACCGTGCCCATCTAqRT-PCRβ-actinR(reverse)CGGACAATTTCTCTTTCGGCTGqRT-PCRIL-1βF(forward)GTGCCAGGTGCCAAGTAGCqRT-PCRIL-1β-R(reverse)AAGCCCAAGATATGCAGGAGTqRT-PCRTNF-αF(forward)CCGCTGCTGTCTGCTTCAqRT-PCRTNF-αR(reverse)GCCTGGTCCTGGTTCACTCTqRT-PCR

圖1 團(tuán)頭魴TLR2核苷酸對(duì)應(yīng)氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of maTLR2

起止密碼子用加粗字體表示，*代表的是終止密碼子。波浪線：信號(hào)肽(Signal P)；灰色：LRR(亮氨酸重復(fù)基序)；方框：TM(跨膜結(jié)構(gòu)域)；雙下劃線：TIR(Toll/IL-1 受體區(qū))。mRNA不穩(wěn)定基序(ATTTA)用下劃線表示。

圖2 團(tuán)頭魴TLR2結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.2 The diagram of TLR2 of M.amblycephala

2.2 maTLR2基因同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了得到maTLR2的進(jìn)化信息，分別從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取20種TLR2的蛋白序列，其中包括11種魚類TLR2的蛋白序列，1種鳥(niǎo)類的蛋白序列，8種哺乳動(dòng)物的蛋白序列，并將其進(jìn)行BLAST分析，表2顯示同源性分析及進(jìn)化樹(shù)分析所用物種的蛋白名稱、序列登錄號(hào)及比對(duì)結(jié)果。由進(jìn)化樹(shù)可看出，團(tuán)頭魴與鯉、鯽、印度鯪、草魚和斑馬魚聚為鯉形目的一簇，其中團(tuán)頭魴TLR2與草魚TLR2的親緣關(guān)系最近。12種魚類TLR2組成了硬骨魚類的分支，同時(shí)與鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物聚為脊椎動(dòng)物分支(圖3)，這與傳統(tǒng)分類學(xué)相匹配。

2.3 maTLR2及TNF-α在嗜水氣單胞菌的感染后的表達(dá)變化

采用Real time PCR檢測(cè)在嗜水氣單胞菌攻毒后，團(tuán)頭魴免疫相關(guān)組織頭腎中maTLR2基因在mRNA水平上的表達(dá)變化。在處理后的6、9、12、24和48 h取樣分析。β-actin作為內(nèi)參基因。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本至少有三個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。星號(hào)顯示的與對(duì)照組的顯著性差異(P<0.05)。誤差線顯示的標(biāo)準(zhǔn)差。團(tuán)頭魴頭腎中，TLR2的表達(dá)變化趨勢(shì)如圖4所示。在頭腎中，TLR2在6 h時(shí)出現(xiàn)峰值，急劇上升至對(duì)照組的2.68倍(P<0.05)，之后迅速恢復(fù)到注射前的水平。大體上來(lái)說(shuō)就是在嗜水氣單胞菌注射團(tuán)頭魴后，頭腎中maTLR2的瞬時(shí)表達(dá)量顯著升高。

細(xì)菌感染通常會(huì)引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，為獲得關(guān)于團(tuán)頭魴機(jī)體中細(xì)胞因子的信息，本實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了團(tuán)頭魴頭腎中TNF-α的表達(dá)變化。如圖4所示，TNF-α的表達(dá)模式與maTLR2的相似，大體符合單峰型的表達(dá)模式。即在感染后的6 h表達(dá)量迅速上升，達(dá)到對(duì)照組的2.14倍(P<0.05)，然后顯著降低。

表2 TLR2蛋白序列同源性和進(jìn)化樹(shù)所用物種蛋白及序列登錄號(hào)

Tab.2 Species,protein and accession number of TLR2 used in the homologous and phylogenetic analysis,andthe amino acid sequence identities between maTLR2 and other organisms.

物種蛋白名稱Genbank登錄號(hào)氨基酸長(zhǎng)度/aaE值同源性/%CtenopharyngodonidellaTLR2ACT68333.17860.094CyprinuscarpioTLR2ACP20793.17880.089LabeorohitaTLR2ADQ74644.17920.086CarassiuscarassiusTLR2AGO57934.17910.087DaniorerioTLR2NP-997977.17880.081IctaluruspunctatusTLR2AEI59663.17900.064OncorhynchusmykissTLR2CCK73195.18060.050EpinepheluscoioidesTLR2AEB32453.18210.047ParalichthysolivaceusTLR2BAD01044.18180.046TakifugurubripesTLR2AAW69370.18100.045TrematomusbernacchiiTLR2ACT64128.18040.049GallusgallusTLR2BAB16113.27930.041RattusnorvegicusTLR2NP-942064.17840.041OryctolaguscuniculusTLR2NP-001076250.17840.041SusscrofaTLR2ACZ82293.17850.041MusmusculusTLR2EDL15415.17840.041CanislupusfamiliarisTLR2BAD42423.17850.042PantroglodytesTLR2BAG55022.17840.042HomosapiensTLR2AAH33756.17840.042BostaurusTLR2ALL55248.17840.042

圖4 嗜水氣單胞菌感染后，團(tuán)頭魴頭腎中TLR2 (A)和TNF-α (B)在mRNA水平的表達(dá)變化Fig.4 Relative expression of maTLR2 (A) and TNF-α (B) at the mRNA level in head kidney after A.hydrophila infection

3 討論

Toll樣受體識(shí)別細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物的組成部分，并引起炎癥反應(yīng)，在模式識(shí)別受體中扮演重要角色。本實(shí)驗(yàn)克隆了團(tuán)頭魴的TLR2的cDNA全長(zhǎng)序列，由預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域可看出，團(tuán)頭魴TLR2符合TLRs的結(jié)構(gòu)特征，即含有一個(gè)信號(hào)肽、多個(gè)LRR、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)TIR區(qū)。由于頭腎是魚類重要的免疫器官，所以本實(shí)驗(yàn)在細(xì)菌刺激后，檢測(cè)了團(tuán)頭魴頭腎中TLR2的表達(dá)變化。在嗜水氣單胞菌刺激團(tuán)頭魴后，團(tuán)頭魴TLR2 在頭腎中的瞬時(shí)表達(dá)量顯著升高，同時(shí)檢測(cè)了典型的炎癥細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)變化。由結(jié)果可看出，TNF-α的瞬時(shí)表達(dá)量也同時(shí)顯著升高。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明TLR2在嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴時(shí)起到了免疫調(diào)節(jié)作用。

TLR胞外的LRR段呈馬蹄形，可以形成同型或異型二聚體，如TLR1/TLR2、TLR2/TLR6、TLR3/TLR3或TLR4/TLR4[14]。TLR2識(shí)別細(xì)菌、真菌和病毒的多種成分。TLR2是通過(guò)與TLR1或者TLR6形成二聚體來(lái)識(shí)別配體的[5,15]。也有研究證明了TLR2可以和受體相互影響以發(fā)揮作用。Good等[16]證明了，脂多糖誘導(dǎo)TLR4信號(hào)途徑時(shí)需要TLR2的參與。Xaplanteri等[17]研究發(fā)現(xiàn)在綠膿桿菌刺激下，MR與TLR2協(xié)同作用激活促炎性反應(yīng)。Tachado等[18]的研究說(shuō)明在巨噬細(xì)胞中，肺孢子蟲介導(dǎo)的IL-8的釋放是要通過(guò)MR和TLR2的共表達(dá)。這些都說(shuō)明了TLR2在識(shí)別病原微生物時(shí)，是與多種受體相互影響著起作用的。TLR2識(shí)別嗜水氣單胞菌的機(jī)理需要進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。MR在識(shí)別病原菌和介導(dǎo)機(jī)體先天免疫應(yīng)答過(guò)程中具有重要作用[19]，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明了在嗜水氣單胞菌感染后，團(tuán)頭魴和草魚的MR都參與了機(jī)體抗細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)[10]，且團(tuán)頭魴MR對(duì)細(xì)菌的識(shí)別依賴于鈣離子[20]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)于TNF-α的釋放同maTLR2-MR-NF-κB之間是否存在聯(lián)系還不清楚，其具體的分子機(jī)理還需深入研究。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Cloning and expression of Toll-like receptor 2 in Megalobrama amblycephala

LI Jie,WANG Hong,ZHOU Yang,MA Jie-le,LIU Xiao-ling,LIN Li

(DepartmentofAquaticAnimalMedicines,CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity/KeyLabofFreshwaterAnimalBreeding,MinistryofAgriculture,Wuhan430070,China)

In this study,in order to clarify the function of TLR2 inMegalobramaamblycephala(maTLR2) during the infection ofAeromonashydrophila,we clonedmaTLR2,and analyzed the expression change ofmaTLR2 during the bacterial infection.The full-length cDNA ofmaTLR2 contained 2923 bp encoding a putative protein of 792 amino acid.The predicted amino acid sequences showed thatmaTLR2 contained a signal peptide,N-terminal leucine-rich repeats (LRRs),a trans-membrane region (TM) and a cytoplasmic toll/interleukin (IL)-1R homology (TIR) domain.Temporal expression ofmaTLR2 mRNA transcripts in head kidney ofM.amblycephalawas significantly increased at 6h after the infection ofA.hydrophila.TLR2 downstream related molecular TNF-α also up-regulated.These finding suggested thatmaTLR2 is a critical part in the immune responses ofA.hydrophilainfection.

Megalobramaamblycephala;Toll-like receptor 2;expression

2016-04-11；

2016-08-08

湖北省科技支撐計(jì)劃(2015BBA228；YSF2015000255)

李 潔(1989- )，女，碩士，專業(yè)方向?yàn)轸~類病害與免疫研究。E-mail:li1005@hotmail.com

劉小玲。E-mail:liuxl@mail.hzau.edu.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)01-0022-08