李利紅，袁宏利

(山西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，太原 030006)

福瑞鯉對氨氮脅迫的生理響應(yīng)

李利紅，袁宏利

(山西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，太原 030006)

以福瑞鯉(Cyprinuscarpio)為材料，研究不同濃度氨氮(0、10、20和30 mg/L)處理對幼魚鰓組織中抗氧化系統(tǒng)和Na+/K+-ATP酶活力的影響。結(jié)果顯示，氨氮脅迫6 h誘導(dǎo)H2O2含量、總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性迅速顯著升高，并在脅迫24 h時(shí)達(dá)到最高水平。脅迫96 h后，各處理組H2O2含量、SOD 活性和總抗氧化能力均低于對照組水平，MDA含量顯著增加。氨氮脅迫后，Na+/K+-ATP酶基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白活性呈先降低后升高又降低的變化趨勢，參與脅迫過程中滲透壓的調(diào)控。研究結(jié)果表明，低濃度氨氮脅迫后，福瑞鯉鰓組織通過調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化能力，提高Na+/K+-ATP酶活性，有效改善魚體的抗氨氮脅迫能力，但是高濃度氨氮脅迫對鰓組織造成氧化損傷。

福瑞鯉(Cyprinuscarpio)；氨氮；鰓組織；Na+/K+-ATP酶；抗氧化能力

近年來，在規(guī)?；s化水產(chǎn)養(yǎng)殖中，高放養(yǎng)密度和高投飼率使得水體中的殘餌、肥料和生物排泄物等不斷增多，經(jīng)氨化作用產(chǎn)生大量的氨氮，成為目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中影響魚類的主要脅迫因子之一[1-2]。養(yǎng)殖水體中的氨氮濃度經(jīng)常會(huì)在短時(shí)間內(nèi)急劇升高，通過魚鰓進(jìn)入體內(nèi)，使魚體的鰓、腎和肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病變、免疫力下降，生長、發(fā)育受阻，甚至導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重影響水產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。目前，國內(nèi)外進(jìn)行了許多關(guān)于氨氮脅迫對水生動(dòng)物影響的研究。據(jù)報(bào)道，氨氮脅迫處理尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)后，造成組織中蛋白質(zhì)氧化和膜脂過氧化，導(dǎo)致肝功能衰竭，非特異性免疫防御系統(tǒng)遭到破壞[5]。然而，氨氮脅迫對魚體鰓組織抗氧化系統(tǒng)影響的研究甚少。

福瑞鯉(FFRC strain common carp，Cyprinuscarpio)是2011年由建鯉和野生黃河鯉雜交獲得的鯉新品種，具有生長速度快、體型好、餌料轉(zhuǎn)化率高、適應(yīng)能力強(qiáng)和遺傳性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)，是農(nóng)業(yè)部“十二五”主推的大宗淡水養(yǎng)殖魚類之一[6]。本試驗(yàn)以福瑞鯉為材料，研究氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織抗氧化系統(tǒng)和Na+/K+-ATP酶活性的影響，探討氨氮對魚類的毒性機(jī)理以及福瑞鯉對養(yǎng)殖水體環(huán)境變化的適應(yīng)性，旨在為淡水魚類健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用福瑞鯉幼魚購自長治沁縣漁場，體質(zhì)量(50.00±0.16)g。試驗(yàn)前室內(nèi)暫養(yǎng)2周，日投食2次。養(yǎng)魚用水為曝氣自來水，水溫(25±1)℃，pH 7.5±0.3，用充氧機(jī)連續(xù)充氣以保證溶解氧含量以上，正式實(shí)驗(yàn)前停食24 h。

1.2 染毒實(shí)驗(yàn)

魚類染毒采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，在確定福瑞鯉幼魚96 h 氨氮半致死濃度(25 ℃，T-AN:35.6 mg/L)的基礎(chǔ)上，設(shè)置1個(gè)對照組(0 mg/L)和3處理組(總氨氮T-AN=10 、20 和30 mg/L)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行組。用氯化銨(NH4Cl)配制各實(shí)驗(yàn)組總氨氮濃度100 L，隨機(jī)放入健康活潑的福瑞鯉20尾。實(shí)驗(yàn)期間每天定時(shí)換水，采用萘氏試劑法測定并調(diào)整總氨氮濃度。

1.3 樣品采集與分析

在染毒 6、24、48 和96 h后，各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取福瑞鯉3尾，分別用自來水、蒸餾水沖洗后迅速解剖。取新鮮的第2鰓弓上的鰓絲，用生理鹽水潤洗，濾紙吸干水分。準(zhǔn)確稱量組織質(zhì)量，按質(zhì)量體積比制成10%的組織勻漿，4 ℃下3 500 r/min離心10 min，取上清液待用。Na+/K+-ATP酶活性、H2O2含量、SOD活性、總抗氧化力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，測定方法及單位參照試劑盒說明書。

數(shù)據(jù)為3個(gè)平行組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan 多重比較分析處理組與對照組間的差異顯著性，取*P<0.05為差異顯著，**P< 0.01為差異極顯著。

1.4 RNA提取和Real-time PCR分析

取對照組和20 mg/L處理組染毒 6、24、48 和96 h后福瑞鯉幼魚第2鰓弓上的鰓絲，利用TaKaRa RNAiso Reagent提取總RNA。以總RNA為模板，使用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)合成cDNA。根據(jù)建鯉Na+/K+-ATP酶基因序列，設(shè)計(jì)Na+/K+-ATP酶α1和β1引物對分別為ATPα1FG、ATPα1RG和ATPβ1FG、ATPβ1RG。以β-actin基因作內(nèi)參，引物對為Neican F和Neican R(表1)。利用SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行Real-time PCR分析，反應(yīng)采用Applied Biosystems 7500 Real time PCR儀。每個(gè)樣品重復(fù)三次，使用2-ΔΔCt計(jì)算方法，各組間比較采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)，P< 0.05 時(shí)差異顯著。

表1 Na+/K+-ATPα1和β1基因Real-time PCR所用引物

Tab.1 The primers used by Na+/K+-ATPase α1and β1 genes

引物序列ATPα1FG5'-GTGGGCCGATTTGATCATTTGC-3'ATPα1RG5'-CCTGGGCTGCGTCGAATGATAAG-3'ATPβ1FG5'-GCACAGGCAGCAGTTGGTTCAAG-3'ATPβ1RG5'-CGTATTATCGCTCATGGAGAAGCTGATC-3'NeicanF5'-GTTGTCAGCAATGCCTCCTGC-3'NeicanR5'-ACTGGCACCGCGACCATC-3'

2 結(jié)果

2.1 氨氮脅迫對福瑞鯉鰓組織H2O2含量的影響

氨氮脅迫后，福瑞鯉幼魚鰓組織H2O2含量呈上升趨勢(圖1)。氨氮脅迫6 h時(shí)，鰓組織H2O2含量迅速升高。脅迫24 h后，各脅迫組H2O2含量呈濃度依賴性增高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。之后，隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長，鰓組織H2O2含量增幅降低。氨氮脅迫96 h后，僅10 mg/L組與對照組差異顯著(P<0.05)，其它各組均恢復(fù)至對照組水平。

2.2 氨氮脅迫對福瑞鯉鰓組織抗氧化能力的影響

氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織T-AOC和SOD活性產(chǎn)生顯著影響(圖2)。 氨氮脅迫6 h時(shí)，鰓組織T-AOC迅速增加。脅迫24 h后，各脅迫組T-AOC達(dá)到最大，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。之后，隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長，鰓組織T-AOC仍顯著高于對照組，但增幅降低。氨氮脅迫96 h后，各脅迫組T-AOC均低于對照組，20 mg/L脅迫組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。氨氮脅迫6 h時(shí)，鰓組織SOD活性迅速提高至最大，10 mg/L和20 mg/L脅迫組與對照組差異極顯著(P<0.01)，30 mg/L脅迫組與對照組差異顯著(P<0.05)。隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長，鰓組織SOD活性增幅降低。脅迫48 h后，30 mg/L脅迫組顯著降低(P<0.05)，其余各組與對照組相比無顯著差異。

氨氮脅迫后福瑞鯉鰓組織MDA含量呈時(shí)間和濃度依賴性提高(圖2)。脅迫6 h后，鰓組織MDA含量呈濃度依賴性增加，但與對照組間無顯著差異。脅迫24 h時(shí)，30 mg/L脅迫組MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)，而其他各組差異不顯著。48 h時(shí)，20 mg/L和30 mg/L脅迫組MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)。脅迫96 h后，各脅迫組MDA含量均達(dá)到最大峰值，10 mg/L和20 mg/L脅迫組與對照組差異顯著(P<0.05)，30 mg/L脅迫組與對照組差異極顯著(P<0.01)。

圖1 氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織H2O2含量的影響Fig.1 Effects of ammonia exposure on H2O2 content in the gill of C.carpio

圖2 氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of ammonia exposure on antioxidative capacity in the gill of C.carpio

2.3 氨氮脅迫對福瑞鯉鰓組織Na+/K+-ATP酶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白活性的影響

福瑞鯉幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白活性水平在氨氮脅迫過程中發(fā)生明顯改變(圖3)。氨氮脅迫6 h時(shí)，Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達(dá)無明顯變化。之后，Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長逐漸升高，Na+/K+-ATP酶α1基因在脅迫48 h 時(shí)達(dá)到最大。Na+/K+-ATP酶β1基因表達(dá)變化較Na+/K+-ATP酶α1基因更為明顯，脅迫24 h即達(dá)到最大，脅迫48 h時(shí)仍顯著增高。氨氮脅迫96 h后，Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達(dá)量迅速下降，Na+/K+-ATP酶β1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。

氨氮脅迫6 h時(shí)，鰓組織Na+/K+-ATP酶活性迅速下降，但脅迫組與對照之間無顯著差異。之后，隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長，鰓組織Na+/K+-ATP酶活性呈濃度依賴性增高，在脅迫48 h后，Na+/K+-ATP酶活性達(dá)到最大，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。氨氮脅迫96 h時(shí)，鰓組織Na+/K+-ATP酶活性回落，但除30 mg/L組顯著降低外(P<0.05)，其余各組與對照組相比無顯著差異。

圖3 氨氮脅迫對福瑞鯉幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶的影響Fig.3 Effects of ammonia exposure on Na+/K+-ATPase in the gill of C.carpio

3 討論

水體中高濃度氨氮會(huì)阻斷魚體內(nèi)氨的排泄，使血液和組織中氨氮的含量上升。同時(shí)，環(huán)境中氨通過鰓上皮滲入魚體內(nèi)，對魚體細(xì)胞產(chǎn)生一系列毒害作用[7]。當(dāng)受到環(huán)境脅迫時(shí)，魚體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，使蛋白質(zhì)、核酸、膜脂等生物大分子結(jié)構(gòu)損傷、功能異常，導(dǎo)致細(xì)胞生理活動(dòng)紊亂，引起細(xì)胞凋亡等[8-9]。生物體內(nèi)存在一套完整的抗氧化防御系統(tǒng)，包括抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等，可以清除胞內(nèi)過量的活性氧，從而維持相對的動(dòng)態(tài)平衡[10-11]。研究表明，氨氮脅迫誘導(dǎo)青魚、羅非魚和凡濱濱對蝦出現(xiàn)氧化應(yīng)激，過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽含量等發(fā)生改變[7，11]。本研究中，氨氮脅迫初期，福瑞鯉幼魚鰓組織內(nèi)產(chǎn)生大量的H2O2，SOD活性和T-AOC迅速增高，MDA含量較低，說明氨氮脅迫后福瑞鯉幼魚鰓組織中抗氧化能力提高，有效清除脅迫產(chǎn)生的活性氧，維持細(xì)胞正常的生理功能。但隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長，胞內(nèi)過量的活性氧不能及時(shí)清除，從而造成組織細(xì)胞損傷，SOD活性降低，MDA含量顯著增加。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，可間接反映細(xì)胞的損傷程度，同時(shí)又可與蛋白質(zhì)的游離氨基作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷[12]。這預(yù)示著隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長，福瑞鯉鰓組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，細(xì)胞抗氧化酶活性降低，從而引起細(xì)胞生理活動(dòng)紊亂。

Na+/K+-ATP 酶是生物膜上存在的一種蛋白酶，由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成[13]。據(jù)報(bào)道，許多環(huán)境因素如鹽度、重金屬及臭氧等都可影響到鰓組織Na+/K+-ATP酶活性[14]。研究結(jié)果表明，氨氮脅迫后，福瑞鯉幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表達(dá)量產(chǎn)生明顯影響，且基因轉(zhuǎn)錄水平的變化與氨氮脅迫濃度相關(guān)，這為從分子水平上闡明脅迫過程中的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。Na+/K+-ATP 酶活性先下降后升高，最后又回到對照水平。氨氮脅迫初期，環(huán)境中高濃度氨氮滲入魚體細(xì)胞，使得Na+/K+-ATP 酶蛋白結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致酶活力下降。之后，鰓主動(dòng)滲透調(diào)節(jié)機(jī)制被激活，Na+/K+-ATP 酶活性提高。最后，由于鰓組織中積累了大量的活性氧，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物破壞Na+/K+-ATP 酶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活力降低[7,15]。

[1]Colt J.Water quality requirements for reuse systems[J].Aquacult Eng,2006,34(3):43-156.

[2]農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局.2013中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2013:31.

[3]張武肖,孫盛明,戈賢平,等.急性氨氮脅迫及毒后恢復(fù)對團(tuán)頭魴幼魚鰓/肝和腎組織結(jié)構(gòu)的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2015,39(2):233-242.

[4]Paust L O,Foss A A K.Effects of chronic and periodic exposure to ammonia on growth,food conversion efficiency and blood physiology in juvenile Atlantic halibut (HippoglossushippoglossusL.)[J].Aquaculture,2011,315(3-4):400-406.

[5]Li M,Yu N,Qin J G,et al.Effects of ammonia stress,dietary linseed oil andEdwardsiellaictalurichallenge on juvenile darkbarbel catfishPelteobagrusvachelli[J].Fish Shellfish Immun,2014,38(1):158-165.

[6]曲疆奇,畢瀅佳,董在杰,等.應(yīng)用SRAP標(biāo)記分析福瑞鯉及其原始親本的遺傳結(jié)構(gòu)[J].動(dòng)物學(xué)雜志,2011,46(5):120-125.

[7]胡 毅,黃 云,鐘 蕾,等.氨氮脅迫對青魚幼魚鰓絲Na+/K+-ATP 酶、組織結(jié)構(gòu)及血清部分生理生化指標(biāo)的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2012,36(4):538-545.

[8]Huang W,Cao L,Ye Z J,et al.Antioxidative responses and bioaccumulation in Japanese flouder larvae and juveniles under chronic mercury exposure[J].Comp Biochem Phys C,2010,152(1):99-106.

[9]尹曉燕,田 興,李大鵬,等.亞硝態(tài)氮對草魚離體肝細(xì)胞抗氧化體系的影響[J].淡水漁業(yè),2014,44(5):49-53.

[10]劉海俠,孫海濤,劉曉強(qiáng),等.亞硝態(tài)氮中毒鯉的血液和組織病理學(xué)研究[J].淡水漁業(yè),2010,40(3):67-71.

[11]黎 慶,龔詩雁,黎 明.慢性氨氮暴露誘發(fā)黃顙魚幼魚谷氨酰胺積累/氧化損傷及免疫抑制機(jī)制的研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2015,39(5):728-734.

[12]Janero D R.Malondialdehyde and thiobarbituric acidreactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury[J].Free Radical Bio Med,1990,9(6):515-540.

[13]Blasiole B,Degrave A,Can V,et al.Differential expression of Na,K-ATPase alpha and beta subunit genes in the developing zebrafish inner ear[J].Dev Dynam,2003,228:386-392.

[14]柳旭東,王際英,張利民,等.影響水產(chǎn)動(dòng)物Na+-K+-ATP酶活力的水環(huán)境因素[J].水產(chǎn)科學(xué),2009,28(3):171-175.

[15]張龍崗,董學(xué)颯,朱永安,等.急性鹽度脅迫對克氏原螯蝦肝臟抗氧化酶及鰓絲Na+-K+-ATP酶活力的影響[J].淡水漁業(yè),2015,45(4):87-91.

(責(zé)任編輯：陳細(xì)華)

Physiological response of FFRC strain common carp to ammonia stress

LI Li-hong,YUAN Hong-li

(FisherySciencesResearchInstituteofShanxiProvince,Taiyuan030006,China)

The effects of ammonia-N on antioxidant system and Na+/K+-ATPase were studied in the gill of FFRC strain common carp (CyprinuscarpioL.).The carp were transferred off the freshwater and exposed to different ammonia-N levels (0,10,20 and 30 mg/L),and each ammonia-N level was randomly triplicate and sampled at 0,6,24,48 and 96 h,respectively.The results showed that with the concentration of ammonia-N increased,the H2O2content,total antioxidant capacity (T-AOC) and superoxide dismutase (SOD) activity enhanced significantly at first 6 h and reached the maximun after 24 h exposure.Then,the H2O2content,SOD activity and T-AOC decreased,and MDA content increased significantly in all ammonia-N treatment group after 96 h exposure.The gene expression level of Na+/K+-ATPaseα1 and Na+/K+-ATPaseβ1 increased at 24 h,and then decreased to be lower than that of control group after 96 h exposure.Meanwhile,Na+/K+-ATPase activities decreased at first 6 h,and then increased gradually and reached the maximum at 48 h,showing the induction of Na+/K+-ATPase in response to ammonia-N stress.These results indicated that ammonia-N stress induced changes in antioxidant system and Na+/K+-ATPase level,which play a key role in preventing ammonia-N damage in gill cells.

carp;ammonia stress;gill;Na+/K+-ATPase;antioxidant system

2016-03-31；

2016-05-24

山西省青年科技研究基金(2013021022-5)

李利紅(1982- )，女，博士，工程師，主要從事魚類生態(tài)毒理學(xué)研究。E-mail:lihongli19821129@163.com

S965.89

A

1000-6907-(2017)01-0097-04