薛 競(jìng)

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院皮膚性病研究所，四川 成都 610072)

·基礎(chǔ)研究·

miRNAs對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞光老化的作用及其相關(guān)機(jī)制

薛 競(jìng)

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院皮膚性病研究所，四川 成都 610072)

目的 探討miR-146a在紫外線誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞光老化中的作用。方法 10 J/cm2UVA連續(xù)照射成纖維細(xì)胞2 w建立光老化模型，分別于首日、3、7、14 d提取總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-146a表達(dá)量；慢性病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-146a表達(dá)(miR-146a過(guò)表達(dá)組)，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，并驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)miR-146a表達(dá)量；未經(jīng)處理的成纖維細(xì)胞作為空白對(duì)照組；UVA+miR-146a組為miR-146a過(guò)表達(dá)后再用UVA照射。MTT法檢測(cè)四組細(xì)胞增殖情況；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)四組細(xì)胞內(nèi)老化相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況；Western印跡法檢測(cè)四組細(xì)胞中Smad4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 UVA照射第3、7、14天UVA照射組miR-146a表達(dá)量持續(xù)降低，且明顯低于同期空白對(duì)照組(P<0.05)。慢性病毒載體轉(zhuǎn)染后，miR-146a過(guò)表達(dá)組第7、14天miR-146a表達(dá)量明顯高于同期空白對(duì)照組(P<0.05)。UVA照射組、UVA+miR-146a組A值明顯低于空白對(duì)照組、miR-146a過(guò)表達(dá)組(P<0.01);miR-146a過(guò)表達(dá)組A值與空白對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；UVA+miR-146a組A值明顯高于UVA照射組(P<0.01)。UVA照射組、UVA+miR-146a組p53、p21、p16 mRNA表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組、miR-146a過(guò)表達(dá)組(P<0.01)；miR-146a過(guò)表達(dá)組p53、p21、p16 mRNA表達(dá)量與空白對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；UVA+miR-146a組p53、p21、p16 mRNA表達(dá)量明顯低于UVA照射組(P<0.01)。UVA照射組、UVA+miR-146a組細(xì)胞內(nèi)Smad4蛋白表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組、miR-146a過(guò)表達(dá)組(P<0.01)；miR-146a過(guò)表達(dá)組與空白對(duì)照組Smad4蛋白表達(dá)量之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；UVA+miR-146a組Smad4蛋白表達(dá)量明顯低于UVA照射組(P<0.01)。結(jié)論 UVA誘導(dǎo)光老化人皮膚成纖維細(xì)胞中miR-146a表達(dá)被抑制，上調(diào)其表達(dá)可抑制Smad4表達(dá)，促進(jìn)光老化細(xì)胞增殖，起到抗老化作用。

miRNAs；皮膚老化；成纖維細(xì)胞；miR-146a

Monteforte等〔1〕對(duì)長(zhǎng)波紫外線(UVA)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞光老化中差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)miR-146a表達(dá)下調(diào)。miR-146a屬于miRNAs家族，可參與細(xì)胞增殖、炎癥等多種體內(nèi)生物學(xué)過(guò)程。相關(guān)研究性顯示，Smad4是miR-146a的靶基因，也是信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Smads的活性中心，編碼的蛋白在組織發(fā)育、修復(fù)、再生中發(fā)揮重要作用〔2〕。本次研究中通過(guò)UVA照射建立人皮膚成纖維細(xì)胞的光老化模型，檢測(cè)其中miR-146a、Smad4的表達(dá)情況，并通過(guò)慢性病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-146a表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞光老化的影響。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(上海哈靈生物科技有限公司)；Trizol、噻唑藍(lán)(MTT)、肌動(dòng)蛋白、Smad單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)；山羊抗小鼠IgG抗體、兔抗人Smad 4多克隆抗體(北京百奧萊博科技有限公司)；人miR-146a慢病毒表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染試劑盒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)。紫外輻射儀(北京歐普特科技有限公司)；Life ViiA 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 本次研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，按照知情同意、自愿參加的原則，在本院泌尿外科收集包皮環(huán)切術(shù)后皮膚標(biāo)本，用含雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，除去皮下血管和脂肪，剪成2 mm×1 mm的皮條，分散酶作用下37℃消化2～3 h，分離表皮和真皮。取真皮剪碎成沫狀，37℃膠原酶消化2～3 h。過(guò)200目篩，離心后將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中，37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)。0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)、0.25%胰酶消化傳代，取10代之內(nèi)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組與處理 ①空白對(duì)照組：不做任何處理；②UVA照射組：給予UVA照射，并于照射后首日、3、7、14 d提取本組和空白對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-146a的表達(dá)量；③miR-146a過(guò)表達(dá)組：慢性病毒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)然后第7、14天觀察轉(zhuǎn)染率，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證胞內(nèi)miR-146a表達(dá)量；④UVA+miR-146a組：慢性病毒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，用UVA照射，方法同UVA照射組。

1.4 p53、p21、p16 mRNA和miR-146a檢測(cè) Trizol試劑盒提取每組總RNA，配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積20 μl，37℃反轉(zhuǎn)錄20 min，85℃ 10 s去除反轉(zhuǎn)錄酶活性，得到cDNA，-20℃低溫保存。染料法(SYBR Green)相對(duì)定量分析。PCR體系20 μl，包括雙蒸餾水6 μl，SYBR Green 10 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，上、下游引物各0.8 μl，cDNA 2 μl。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。兩步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR，共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為β-actin，計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 每組成纖維細(xì)胞經(jīng)常規(guī)傳代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，棄去培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化，觀察細(xì)胞變成單個(gè)圓形時(shí)加入完全細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打成單細(xì)胞懸液。置于離心管中離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)基懸浮混勻沉淀物，細(xì)胞密度調(diào)至5×104/ml～10×104/ml。每孔加入100 μl 細(xì)胞懸液于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×103/孔～10×103/孔?；靹蚝笈囵B(yǎng)24 h。吸去上清，更換培養(yǎng)基后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h后棄去上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔，振蕩混勻10 min，490 nm處測(cè)定每孔的吸光度(A)值，越高則說(shuō)明細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)。

1.6 Smad4蛋白表達(dá)量檢測(cè) 采用Western印跡法檢測(cè)，10 J/cm2UVA連續(xù)照射成纖維細(xì)胞2 w建立光老化模型，培養(yǎng)后收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗3次，在裂解液中重懸細(xì)胞，冰浴45 min，充分裂解細(xì)胞，4℃ 10 000 r/min離心10 min，收集上清行蛋白質(zhì)定量檢測(cè)。每組取等量蛋白質(zhì)，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉后與一抗結(jié)合，4℃放于搖床過(guò)夜，Tris鹽酸緩沖液(TBS)洗滌后與二抗結(jié)合，洗滌后電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光顯示，β-actin為對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0軟件，計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 UVA照射成纖維細(xì)胞對(duì)miR-146a表達(dá)的影響 UVA照射前兩組成纖維細(xì)胞miR-146a表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；照射第3、7、14天 UVA照射組miR-146a表達(dá)量持續(xù)降低，且明顯低于同期空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 UVA照射不同時(shí)間點(diǎn)miR-146a表達(dá)量比較

與空白對(duì)照組相比:1)P<0.05

2.2 慢性病毒介導(dǎo)miR-146a過(guò)表達(dá)及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 慢性病毒載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后，第7天和第14天胞內(nèi)均可見(jiàn)較強(qiáng)的熒光表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示：miR-146a過(guò)表達(dá)組第7天表達(dá)量為10.42±0.28，第14天為9.76±0.24，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但較空白對(duì)照組第7天、第14天的表達(dá)量8.44±0.24、7.97±0.22明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-146a慢性病毒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后熒光表達(dá)情況(×100)

2.3 上調(diào)miR-146a表達(dá)對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、UVA照射組、miR-146a過(guò)表達(dá)組、UVA+miR-146a組吸光度(A值)分別為0.818 3±0.061 8、0.262 9±0.068 4、0.804 6±0.073 8、0.602 0±0.039 2。UVA照射組、UVA+miR-146a組A值明顯低于空白對(duì)照組、miR-146a過(guò)表達(dá)組(P<0.01);miR-146a過(guò)表達(dá)組A值與空白對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；UVA+miR-146a組A值明顯高于UVA照射組(P<0.01)。

2.4 上調(diào)miR-146a表達(dá)對(duì)老化相關(guān)基因的影響 UVA照射組、UVA+miR-146a組p53、p21、p16 mRNA表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組、miR-146a過(guò)表達(dá)組(P<0.01)；miR-146a過(guò)表達(dá)組p53、p21、p16 mRNA表達(dá)量與空白對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);UVA+miR-146a組p53、p21、p16 mRNA表達(dá)量明顯低于UVA照射組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.5 miR-146a作用于靶基因Smad4的效應(yīng) 空白對(duì)照組、UVA照射組、miR-146a過(guò)表達(dá)組、UVA+miR-146a組Smad4的表達(dá)量分別為0.25±0.06、1.75±0.24、0.23±0.17、0.90±0.19，見(jiàn)圖2。UVA照射組、UVA+miR-146a組細(xì)胞內(nèi)Smad4蛋白表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組、miR-146a過(guò)表達(dá)組(P<0.01)；miR-146a過(guò)表達(dá)組與空白對(duì)照組Smad4蛋白表達(dá)量之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；UVA+miR-146a組Smad4蛋白表達(dá)量明顯低于UVA照射組(P<0.01)。

表2 UVA照射14 d后各組成纖維細(xì)胞老化

與空白對(duì)照組相比：1)P<0.01；與miR-146a過(guò)表達(dá)組相比：2)P<0.01；與UVA照射組相比：3)P<0.01

圖2 Western印跡檢測(cè)UVA照射14 d后各組Smad4蛋白表達(dá)情況

3 討 論

miRNAs能夠作用于特定的靶基因，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)，目前已成功用于疾病的診斷和治療〔3〕。miR-146，主要表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等〔4〕，包括miR-146a、miR-146b兩個(gè)進(jìn)化保守miRNA基因。miR-146a與miR-146b成熟序列只在3′端存在2個(gè)堿基的差異，功能基本相同〔5〕。本研究提示miR-146a可能作為影響人皮膚成纖維細(xì)胞光老化的靶基因。無(wú)UVA照射時(shí)，miR-146a對(duì)Smad4蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，當(dāng)接受UVA照射時(shí)，miR-146a可調(diào)控Smad4蛋白表達(dá)，使其在原有基礎(chǔ)上明顯降低。該現(xiàn)象的可能原因?yàn)椋瑹o(wú)UVA照射時(shí)Smad4表達(dá)處在基礎(chǔ)水平，而miR-146a只有在應(yīng)激情況下才可發(fā)揮調(diào)控作用。Smad4作為信號(hào)傳到蛋白Smads的活性中心，編碼的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白參與TGF-β超家族信號(hào)在胞內(nèi)的傳導(dǎo)。機(jī)體組織的發(fā)育、修復(fù)、再生過(guò)程中TGF-β發(fā)揮重要作用，其還可影響多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡。通過(guò)本次研究結(jié)果可推測(cè)miR-146a通過(guò)作用于Smad4影響TGF-β，進(jìn)而發(fā)揮抗人皮膚成纖維細(xì)胞光老化的作用。

1 Monteforte R,Beilhack G,Grillari-Voglauer R,etal.SNEVhPrp19/hPSO4 haploinsufficiency accelerates premature skin aging in response to 8-methoxypsoralen/UVA treatment in mice〔J〕.J Invest Dermalol,2014;134(1):S61.

2 Kimlin MG,Guo Y.Assessing the impacts of lifetime sun exposure on skin damage and skin aging using a non-invasive method〔J〕.Sci Total Environ,2012;425(1):35-41.

3 Hazane Puch F,Bonnet M,Valenti K,etal.Study of fibroblast gene expression in response to oxidative stress induced by hydrogen peroxide or UVA with skin aging〔J〕.Eur J Dermatol EJD,2010;20(3):308-20.

4 Hung CF,Chen WY,Aljuffali IA,etal.The risk of hydroquinone and sunscreen over-absorption via photo damaged skin is not greater in senescent skin as compared to young skin:nude mouse as an animal model〔J〕.Int J Pharmaceutics,2014;471(1/2):135-45.

5 Venditti E,Bruge F,Astolfi P,etal.Nitroxides and a nitroxide-based UV filter have the potential to photoprotect UVA-irradiated human skin fibroblasts against oxidative damage〔J〕.J Dermatol Sci,2011;63(1):55-61.

〔2016-07-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011CB707805)；國(guó)家臨床重點(diǎn)專(zhuān)科建設(shè)項(xiàng)目(〔2014〕1081)；四川省國(guó)際科技合作與交流計(jì)劃項(xiàng)目(No.2015KW-041)；四川省科技廳項(xiàng)目(No.2013JY0194)

薛 競(jìng)(1970-)，女，碩士，主要從事皮膚免疫研究。

R75

A

1005-9202(2017)02-0261-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.001