高寧，李天聰，程玉鵬，李弘琨，寧愿

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類有效成分作用機(jī)理的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

高寧，李天聰，程玉鵬*，李弘琨，寧愿

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

目的：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分藥效作用進(jìn)行分析，探討其可能的分子機(jī)理。方法：將5種龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PharmMapper進(jìn)行靶點(diǎn)匹配與預(yù)測(cè)，將所得靶點(diǎn)信息導(dǎo)入DAVID，富集分析靶點(diǎn)所涉及的GO生物過(guò)程與KEGGpathway通路；利用String10與Cytoscape 3.2.1構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果：共得到251個(gè)作用靶點(diǎn)，主要富集于蛋白磷酸化等生物學(xué)過(guò)程以及MAPK信號(hào)途徑等共26條通路中。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)途徑在龍膽藥效作用過(guò)程中起重要作用。結(jié)論：龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類有效成分可能是通過(guò)跨膜受體酪氨酸激酶-Ras-MAPK信號(hào)傳遞途徑，調(diào)控靶點(diǎn)蛋白磷酸化水平，進(jìn)而影響其他信號(hào)通路及代謝途徑，最終達(dá)到保肝、利膽、健胃、抗炎等功效的。

龍膽苦苷；分子機(jī)制；信號(hào)通路；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

龍膽為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，稱其“味苦澀。主骨間寒熱，驚癇邪氣，續(xù)絕傷，定五臟，殺蠱毒”［1］?！吨袊?guó)藥典》（2010版）記載正品龍膽為龍膽科植物條葉龍膽Gentiana manshurica Kitag.、龍膽Gentiana scabra Bge.、三花龍膽Gentiana triflora Pall.或滇龍膽Gentiana rigescens Franch.的干燥根和根莖，并稱其味苦、性寒，具有“清熱燥濕、瀉肝膽火”的功效［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，龍膽主要有效成分是以龍膽苦苷為代表的裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物，主要的藥理作用包括保肝利膽、抗炎鎮(zhèn)痛、健胃、抗腫瘤等［3,4］。然而，其藥效作用的分子機(jī)制尚不清晰，因此，揭示龍膽藥理藥效的分子機(jī)制是目前龍膽研究的熱點(diǎn)之一。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在現(xiàn)代藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)之上提出的藥物設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)的新方法和新策略，其是以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，從整體水平觀察“藥物-靶點(diǎn)-疾病”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，進(jìn)而指導(dǎo)新藥研發(fā)及藥理作用研究。針對(duì)于中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠有效的解決中藥復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模型的構(gòu)建并闡明其作用機(jī)理［5］。本研究以裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物為研究對(duì)象，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建龍膽“藥效分子-靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)模型，以期為闡明龍膽藥理作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

本研究以《中國(guó)藥典》、《中華本草》為基礎(chǔ)[1,2]，結(jié)合其它中藥龍膽藥理學(xué)研究文獻(xiàn)，篩選得到龍膽苦苷（gentiopicrin）、當(dāng)藥苦苷（swertiamarin）、當(dāng)藥苷（sweroside）、苦龍膽酯苷（amarogentin）、苦當(dāng)藥酯苷（amaroswerin）等5種主要的裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索各化合物的結(jié)構(gòu)信息并下載相應(yīng)mol2格式的結(jié)構(gòu)信息文件[6]。將文件導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)匹配與預(yù)測(cè)[7]。隨后，將得到的藥物靶標(biāo)名稱輸入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范蛋白名稱，得到可能與龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物作用的人類相關(guān)蛋白靶點(diǎn)。

1.2 靶點(diǎn)蛋白生物學(xué)功能注釋及相互作用分析

將預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信息列表導(dǎo)入在線分析系統(tǒng)DAVID中[8]，對(duì)靶點(diǎn)所涉及的GO與KEGG Pathway進(jìn)行富集與分析，找到龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物顯著影響的生物學(xué)過(guò)程及代謝通路。同時(shí)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入String 10（http：//http：//string-db.org），得到靶點(diǎn)蛋白間相互作用關(guān)系，用以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

將上述篩選分析得到的相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.2中，構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)蛋白-通路”、“靶點(diǎn)蛋白-靶點(diǎn)蛋白”作用網(wǎng)絡(luò)。另外，利用復(fù)合分子檢測(cè)法（MCODE）對(duì)“靶點(diǎn)蛋白-靶點(diǎn)蛋白”的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊劃分。探討龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物可能的作用機(jī)理。

2 結(jié)果

2.1 龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分靶點(diǎn)信息

通過(guò)PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，共預(yù)測(cè)得到251個(gè)可能與龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物相互作用的靶點(diǎn)，其中與龍膽苦苷相互作用的靶點(diǎn)有144個(gè)、與當(dāng)藥苦苷相互作用的靶點(diǎn)有164個(gè)、與當(dāng)藥苷相互作用的靶點(diǎn)有157個(gè)、與苦龍膽酯苷相互作用的靶點(diǎn)有149個(gè)、與苦當(dāng)藥酯苷相互作用的靶點(diǎn)有164個(gè)，與5種化合物均能匹配的靶點(diǎn)有77個(gè)。在所有251個(gè)靶點(diǎn)中，命中頻次前十位的依次是β-分泌酶（Beta-secretase 1，59次）、細(xì)胞分裂蛋白激酶2（Celldivision protein kinase 2，51次）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P（Glutathione S-transferase P，41次）、凝血酶原（Prothrombin，38次）、酪氨酸蛋白磷酸酶非受體1型（Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 1，36次）、熱休克蛋白90α（Heatshock protein HSP 90-alpha，35次）、GTP水解酶HRas（GTPase HRas，27次）、胸苷酸激酶（Thymidylate kinase，27次）、醛糖還原酶（Aldose reductase，19次）以及Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab-5A（Ras-related protein Rab-5A，19次）。

2.2 靶點(diǎn)蛋白生物學(xué)功能注釋及其所涉及的通路分析結(jié)果

對(duì)所得蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析結(jié)果表明：龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分作用靶點(diǎn)主要富集于蛋白磷酸化（GO：0018108，GO：0046777，GO：0004648，GO：0018212）、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)（GO：0007169，GO：0035556）以及對(duì)內(nèi)源性激素刺激的應(yīng)答（GO：0009719，GO：0032868，GO：0043434）等生物學(xué)過(guò)程（見(jiàn)圖1）；251個(gè)靶點(diǎn)共涉及26條通路。“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型見(jiàn)圖2。

圖1 龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分作用靶點(diǎn)生物學(xué)過(guò)程GO富集結(jié)果Fig.1 Go term enrichmentresults ofthe targets effected by secoiridoids

圖2 龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分作用靶點(diǎn)“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)（網(wǎng)絡(luò)中菱形節(jié)點(diǎn)為化合物，長(zhǎng)方形節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)，圓形節(jié)點(diǎn)為生物通路）

2.3 靶點(diǎn)蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果

String 10是一個(gè)在線的、實(shí)時(shí)更新的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)，它包含了2000多個(gè)物種的近百萬(wàn)對(duì)蛋白相互作用關(guān)系。利用String10建立靶點(diǎn)蛋白間的作用網(wǎng)絡(luò)有助于了解各靶點(diǎn)間相互關(guān)系并預(yù)測(cè)龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分藥效分子機(jī)理。靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入String10后所得PPI網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3。

圖3 龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of targets effected by secoiridoids

隨后利用Cytoscape軟件中MCODE插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)模塊劃分，共得到4個(gè)模塊（見(jiàn)圖4）。利用DAVID對(duì)各模塊所涉及基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖4 靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的模塊Fig.4 Modules in the PPInetwork oftragets

表1 模塊相關(guān)的GO生物過(guò)程Tab.1 Go term of the modules

3 討論及結(jié)論

中藥因其療效確切、毒副作用低，越來(lái)越受到醫(yī)藥研究人員及患者的重視與青睞，然而受傳統(tǒng)研究方法的影響，大多數(shù)中藥作用機(jī)理的分子機(jī)制并不清晰，從而影響了其臨床應(yīng)用。龍膽作為重要的臨床用藥，其歷史悠久，應(yīng)用廣泛，因此，揭示其主要有效成分類裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物的藥理機(jī)制有助于龍膽的合理用藥。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，研究了龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物可能的作用靶點(diǎn)及其對(duì)機(jī)體代謝的調(diào)控作用。結(jié)果表明，龍膽能夠顯著調(diào)節(jié)機(jī)體蛋白磷酸化水平，并對(duì)酪氨酸激酶信號(hào)途徑（GO：0007169）、小G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)途徑（GO：0007264）、酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)途徑（GO：0007167）、Ras蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（GO：0007265）、VEGF信號(hào)途徑（hsa04370）、MAPK信號(hào)途徑（hsa04010）等多種信號(hào)途徑有影響。同時(shí)，龍膽作用靶點(diǎn)蛋白還對(duì)黏著斑（hsa04510）、黏著連接（hsa04520）以及趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（hsa04062）具有顯著影響。現(xiàn)有研究表明，上述途徑中，諸如酪氨酸激酶、黏著斑、MAPK信號(hào)途徑等均與肝損傷、肝細(xì)胞纖維化、肝癌密切相關(guān)［9］；VEGF信號(hào)途徑、Ras蛋白與膽囊癌的發(fā)病密切相關(guān)［10,11］；黏著斑、趨化因子受體、酪氨酸激酶則與胃癌等消化系統(tǒng)疾病有關(guān)［12,13］；MAPK信號(hào)途徑還與TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)有關(guān)［14］。

綜上所述，結(jié)合靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)模塊識(shí)別結(jié)果推測(cè)，龍膽裂環(huán)環(huán)烯醚萜類有效成分可能是通過(guò)跨膜受體酪氨酸激酶-Ras-MAPK信號(hào)傳遞途徑，調(diào)控靶點(diǎn)蛋白磷酸化水平，進(jìn)而影響其他信號(hào)通路及代謝途徑，最終達(dá)到保肝、利膽、健胃、抗炎等功效的。本研究為深入研究龍膽藥理作用的分子機(jī)制提供了參考，進(jìn)一步的裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分對(duì)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響研究將在后續(xù)工作中展開(kāi)。

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Mechanism of secoiridoids isolated from gentianae radix et rhizoma based on network*pharmacology*

GAO Ning,LI Tian-cong,CHENG Yu-peng*,LI Hong-kun,NING Yuan
（College of Pharmacy,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China）

Objective：In order to reveal the molecular mechanism of secoiridoids isolated from Gentianae Radix et Rhizoma,this study established an interaction networks based on network pharmacology.Methods：Input the file of structure into PharmMapper to get targets of secoiridoids,then maked the enrichment analysis of GO and KEGG Pathway by DAVID,and established"compound-target-pathway"network by String 10 and Cytoscape.Results：251 proteins were matched to the secoiridoids.Based on the enrichment analysis,the main effect of targets were protein amino acid phosphorylation,MAPK singaling pathway,et al.,and the most important were transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway.Conculsions The secoiridoids were able to effect"transmembrane receptor protein tyrosine kinase-Ras-MAPK"signaling pathway,regulate protein phosphorylation,and cure the disease.

gentiopicrin；molecular mechanism；signaling pathway；network pharmacology

R966

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170114

2016-10-24

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.81573539）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81503271）；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.H201542）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No.12531621）；黑龍江中醫(yī)藥中青年科技攻關(guān)項(xiàng)目（No.ZQG-040）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?；鹈嫔享?xiàng)目（No.201012）

高寧（1982-），男，黑龍江省哈爾濱人，講師，研究方向：中藥藥性物質(zhì)基礎(chǔ)。

程玉鵬（1966-），男，黑龍江省哈爾濱人，副教授，研究方向：中藥生物技術(shù)。