呂子征 王偉 劉京銘 李傳友 高孟秋

·論著·

初治結(jié)核病患者自噬相關(guān)基因表達水平的研究

呂子征 王偉 劉京銘 李傳友 高孟秋

目的 研究初治結(jié)核病患者自噬相關(guān)基因表達水平。方法 選取2013年12月至2016年3月在首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院就診的12例初治肺結(jié)核病患者作為病例組；選取首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院體檢健康的新入職職工和在讀學生12名作為對照組。收集研究對象外周血，提取RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行實時定量PCR。使用H37Rv標準株感染人外周血單核細胞(THP-1細胞)作為感染組，而未感染H37Rv標準株的THP-1細胞作為未感染組，分別在感染4 h和6 h使用Trizol法提取RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行實時定量PCR檢測。實時定量PCR檢測使用β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，測量各個基因的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)，并計算各個基因的ΔCt值。不同樣品同一基因的檢測通過計算兩者之間的ΔCt值差值，使用2-ΔΔCt比較基因之間的表達水平。結(jié)果 病例組Ras蛋白腦組織同源類似物(Rheb)基因ΔCt值為8.71±0.58，對照組ΔCt值為7.83±0.58，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=3.74，P=0.001)；病例組Rheb基因表達下調(diào)。病例組哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因ΔCt值為11.88±0.97，對照組ΔCt值為10.81±1.04，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=2.60，P=0.016)；病例組mTOR基因表達下調(diào)。使用2-ΔΔCt法比較兩組間自噬相關(guān)基因表達倍數(shù)關(guān)系，對照組Rheb基因表達水平是病例組的(1.85±0.91)倍；對照組mTOR基因表達水平是病例組的(2.76±1.56)倍。H37Rv標準株感染THP-1細胞6 h后，感染組自噬相關(guān)蛋白LC3B基因ΔCt值為6.41±0.15，未感染組ΔCt值為7.04±0.05，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=4.50，P=0.046)；感染組表達上調(diào)。感染組mTOR基因ΔCt值為8.73±0.16，對照組ΔCt值為10.10±0.20，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=4.79，P=0.041)，感染組表達上調(diào)。結(jié)論 初治結(jié)核病患者患病后Rheb和mTOR基因表達下調(diào)，調(diào)節(jié)細胞的自噬；而H37Rv標準株感染THP-1細胞6 h后LC3B和mTOR基因表達上調(diào)，調(diào)節(jié)細胞自噬水平。

分枝桿菌，結(jié)核； 自噬； 基因表達； 免疫

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)是一種胞內(nèi)感染菌，以巨噬細胞為主的固有免疫在抵抗其感染時發(fā)揮著重要作用[1]。當MTB感染宿主細胞時，巨噬細胞等吞噬細胞可以通過Toll模式識別受體(Toll like receptor,TLR)識別MTB，并啟動細胞自噬將胞內(nèi)的MTB殺滅[2-3]。參與自噬相關(guān)的蛋白質(zhì)大約有30多種，自噬相關(guān)的基因表達情況在一定程度上影響細胞內(nèi)的自噬水平[4]。本研究通過研究Ras蛋白腦組織同源類似物(Rheb)基因、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因、自噬相關(guān)蛋白5(ATG5)基因、自噬相關(guān)蛋白12(ATG12)基因和自噬相關(guān)蛋白LC3B基因表達水平，分析自噬相關(guān)基因的表達水平在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生的影響。同時，對比H37Rv標準株感染人外周血單核細胞(THP-1細胞)時自噬相關(guān)基因的表達水平，分析體內(nèi)和體外(細胞和人體)在MTB感染后自噬相關(guān)基因的變化趨勢。

材料和方法

一、研究對象

1.對象：選取2013年12月至2016年3月在首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院就診的12例初治肺結(jié)核病患者作為病例組，收集其臨床資料。選取首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院體檢健康的新入職員工和在讀學生12名作為對照組。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

2.納入排除標準：(1)病例組納入標準：①痰涂片或痰培養(yǎng)MTB呈陽性；②規(guī)范化抗結(jié)核化療時間小于1個月；③無糖尿病史；同時滿足上述3個條件即可納入。排除標準：有感染性疾病、腫瘤、免疫缺陷性疾病和自身免疫性疾病者。(2)對照組納入標準：近1年內(nèi)X線胸部攝影或CT掃描檢查正常，結(jié)核菌素純蛋白衍化物(PPD)或結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢查陰性，既往無結(jié)核病患者密切接觸史，并且無任何結(jié)核病臨床癥狀和體征。

二、試劑和耗材

PAXgene RNA管和PAXgene Blood RNA試劑盒購自美國BD公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT2First Strand Kit)購自德國凱杰公司。cDNA合成試劑盒(cDNA Synthesis SuperMix for qPCR)和實時定量PCR(Top Green qPCRSuperMix)試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。實時定量PCR 96孔板購買于美國ABI公司。H37Rv標準株和THP-1細胞保存于北京胸科醫(yī)院細菌免疫室。其他試劑還包括佛波酯(PMA)、RNA提取試劑(Trizol)、胎牛血清(Hyclone)、RPMI1640培養(yǎng)基等。

三、方法

1.血液標本處理：采集研究對象外周血約2 ml，并按照PAXgene Blood RNA試劑盒的操作步驟提取受試者白細胞RNA[5]，測量RNA的純度和濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2.THP-1細胞的培養(yǎng)和誘導分化：將THP-1細胞從凍存管內(nèi)復(fù)蘇，使用RPMI1640培養(yǎng)基(內(nèi)含體積分數(shù)10%的胎牛血清)傳代培養(yǎng)。細胞計數(shù)時使用質(zhì)量分數(shù)為0.4%臺盼藍和THP-1細胞懸液按照1∶1的比例混合均勻，取15 μl放在血球計數(shù)板后使用倒置顯微鏡計數(shù)。將計數(shù)好的THP-1細胞懸液的濃度配置為1×106個/ml，并加入PMA(終濃度為100 nmol/L)刺激誘導分化[6-7]；轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)6孔板中鋪板(每孔2 ml)，24 h后使用顯微鏡觀察細胞分化情況。

3.THP-1細胞感染處理：使用1×磷酸鹽緩沖液將培養(yǎng)好的H37Rv標準株洗滌3次，同時8000×g離心10 min，并測量吸光度(A)值。按照感染強度(multiplicity of infection，MOI)為10∶1的比例感染THP-1細胞[8]，分別在感染4 h和6 h后，使用Trizol試劑處理細胞(H37Rv標準株感染THP-1細胞試驗進行3次獨立重復(fù))。提取細胞內(nèi)的RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

4.引物設(shè)計和循環(huán)閾值(Ct值)檢測：使用引物設(shè)計軟件(Primer 5.0)設(shè)計PCR引物，選取最佳引物序列。引物由美國Invitrogen公司合成，序列見表1。使用β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，測量各個基因的Ct值，并計算各個基因的ΔCt值，ΔCt=Ct基因-Ctβ-actin。不同樣品同一基因的檢測可以通過計算兩者之間的ΔCt值差值，使用2-ΔΔCt比較基因之間的表達水平。在細胞水平試驗中其自噬基因的ΔCt值為3次獨立重復(fù)試驗測得的均值。ΔCt值在一定程度上反映了基因的表達水平，ΔCt值越低，其基因表達水平越高[9]。

表1 自噬相關(guān)基因的引物設(shè)計

5．統(tǒng)計學分析：應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用兩獨立樣本t檢驗檢測病例組和對照組年齡差異，以及病例組與對照組自噬相關(guān)基因表達水平的差異；采用Fisher確切概率法檢驗病例組和對照組的性別差異；采用配對樣本t檢驗檢測THP-1細胞感染H37Rv標準株不同時間自噬相關(guān)基因表達水平的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.一般情況：病例組12例，包括男7例，女5例；平均年齡為(36.17±15.91)歲。對照組12名，包括男5名，女7名；平均年齡為(27.92±3.37)歲。病例組與對照組比較，年齡及性別差異均無統(tǒng)計學意義(t=1.76，P=0.093；Fisher確切概率法，P=0.684)，兩組均衡可比。

2.自噬相關(guān)基因表達分析：病例組Rheb基因ΔCt值為8.71±0.58，對照組ΔCt值為7.83±0.58，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=3.74，P=0.001)，病例組Rheb基因表達下調(diào)。病例組mTOR基因ΔCt值為11.88±0.97，對照組ΔCt值為10.81±1.04，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=2.60，P=0.016)，病例組mTOR基因表達下調(diào)。而自噬相關(guān)基因ATG5、ATG12和LC3B兩組間差異均無統(tǒng)計學意義，具體見表2。使用2-ΔΔCt法比較兩組間自噬相關(guān)基因表達倍數(shù)關(guān)系，對照組Rheb基因表達水平是病例組的(1.85±0.91)倍；mTOR基因表達水平是病例組的(2.76±1.56)倍。

3.THP-1細胞感染H37Rv標準株后自噬相關(guān)基因表達情況：使用H37Rv標準株感染THP-1細胞4 h后，自噬相關(guān)基因ATG5、ATG12、LC3B、Rheb和mTOR在感染組與未感染組之間表達差異均無統(tǒng)計學意義。H37Rv標準株感染THP-1細胞6 h后，LC3B基因的ΔCt值為6.41±0.15，未感染組ΔCt值為7.04±0.05，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=4.50，P=0.046)，感染組表達上調(diào)。感染組mTOR基因ΔCt值為8.73±0.16，對照組ΔCt值為10.10±0.20，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=4.79，P=0.041)，感染組表達上調(diào)。自噬相關(guān)基因ATG5、ATG12和Rheb表達水平感染組與未感染組相比差異均無統(tǒng)計學意義(表3)。

討 論

MTB是一種胞內(nèi)感染菌，體液免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的抗體對其免疫效果比較局限，而天然免疫和細胞免疫對MTB應(yīng)答起主要作用[2]。巨噬細胞通過細胞表面的TLR識別吞噬MTB后，啟動自噬消化分解MTB，并將MTB的抗原表位通過人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA-Ι)提呈給CD4+的Th1淋巴細胞，從而啟動細胞免疫應(yīng)答[10-11]。自噬是機體免疫非常重要的環(huán)節(jié)，它既可以直接殺滅MTB，又可以為抗原提呈啟動細胞免疫作準備。

本研究發(fā)現(xiàn)，初治結(jié)核病患者中Rheb和mTOR基因表達下調(diào)，可在一定程度上促進自噬水平，抵抗MTB感染。mTOR蛋白是一種蛋白酶，當mTOR蛋白激活后將抑制細胞的自噬水平，而mTOR蛋白被雷帕霉素抑制后，使細胞內(nèi)的自噬水平升高[12]。Rheb屬于Ras家族的成員，研究發(fā)現(xiàn)，Rheb蛋白可以激活mTOR蛋白，從而抑制細胞的自噬[13]。有研究報道，使用MicroRNA155干擾Rheb基因后可以促進細胞自噬殺滅MTB[14]。Rheb和mTOR蛋白都屬于PI3K-Akt-mTOR信號通路，并且Rheb和mTOR蛋白都可以抑制細胞內(nèi)的自噬[15]。盡管發(fā)現(xiàn)在初治結(jié)核病患者和健康者之間調(diào)節(jié)自噬的基因存在表達差異(Rheb和mTOR)，但是參與自噬過程的蛋白基因ATG5、ATG12和LC3B在健康者和初治結(jié)核病患者之間并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的表達差異。究其原因，可能為：(1)無論在健康者還是初治結(jié)核病患者中細胞自噬總是處在一個穩(wěn)態(tài)中，所以這些自噬蛋白基因表達水平無明顯差異；(2)測量的基因未覆蓋到表達有明顯差異的基因；(3)可能由于本研究的樣本量較小，未檢測到存在的基因表達差異。

表2 自噬相關(guān)基因在病例組和對照組中表達水平的比較

表3 自噬相關(guān)基因?qū)HP-1細胞感染H37Rv標準株不同時間表達水平的影響

在細胞實驗結(jié)果中，使用H37Rv標準株感染THP-1細胞4 h后自噬相關(guān)基因未見明顯變化，而在感染6 h后測量自噬相關(guān)基因LC3B和mTOR較健康者表達上調(diào)，ATG5、ATG12和Rheb基因表達水平與健康者比較差異均無統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果表明，THP-1細胞感染H37Rv標準株早期并不能明顯改變自噬相關(guān)基因ATG5、ATG12和Rheb在細胞內(nèi)的表達水平；H37Rv標準株感染6 h后，發(fā)現(xiàn)LC3B和mTOR基因表達上調(diào)。這揭示了MTB作為一種胞內(nèi)感染菌可能改變被感染細胞的一些自噬相關(guān)基因的表達，并且使自噬蛋白基因LC3B和抑制自噬的基因mTOR表達同時上調(diào)。

綜上，MTB感染并不能直接使調(diào)節(jié)自噬的基因Rheb和mTOR表達下調(diào)，而是通過一系列復(fù)雜的調(diào)控影響自噬水平。同時，本研究也證實H37Rv標準株在感染THP-1細胞的相互作用過程中，基因水平上同時存在促進和抑制自噬水平的雙向調(diào)節(jié)。

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(本文編輯：李敬文)

A study on expression of autophagy related gene in tuberculosis patients undergoing initial treatment

LYüZi-zheng,WANGWei,LIUJing-ming,LIChuan-you,GAOMeng-qiu.

BacteriaImmunologyLaboratory,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,ChinaCorrespondingauthor:GAOMeng-qiu,Email:gaomqwdm@aliyun.com

Objective To explore expression of autophagy related gene in tuberculosis patients undergoing initial treatment. Methods Twelve first-treated tuberculosis patients from Beijing Chest Hospital were selected as case group and 12 newly recruited employees and students of Beijing Chest Hospital were in control group. The RNA was extracted from the peripheral blood and reversed to cDNA and then tested using qPCR. THP-1 cells infected by H37Rv were defined as infectious group and those without H37Rv were defined as the control group, then, using Trizol, RNA was extracted 4 and 6 hours after being infected with THP-1, and then reversed to cDNA and tested using qPCR. The gene of β-actin was defined as reference gene. After cycle threshold (Ct) values being tested by qPCR, we calculated theΔCt by subtracted Ct values of reference gene from autophagy genes. In addition, we used 2-ΔΔCt method to compare levels of the same genes from difference groups. Results TheΔCt values ofRhebgene in case group and control group were 8.71±0.58 versus 7.83±0.58 (t=3.74,P=0.001). TheΔCt values ofmTORgene were 11.88±0.97 versus 10.81±1.04 (t=2.60,P=0.016) in case group and control group. BothRhebgene andmTORgene were lowly expressed in case group. However, after infected for 6 hours,ΔCt values ofLC3Bgene in infected group and control group were 6.41±0.15 versus 7.04±0.05 (t=4.50,P=0.046);ΔCts ofmTORwere 8.73±0.16 versus 10.10±0.20 (t=4.79,P=0.041). TheLC3Bgene and themTORgene were highly expressed in infectious group. All the differences were statistically significant. Conclusion TheRhebandmTORgenes were lowly expressed in first-treated tuberculosis patients, which could regulate and increase the autophagy in defendingMycobacteriumtuberculosisinfection. In contrast, the gene expressions ofLC3BandmTORwere upgrading after infected by H37Rv for 6 hours.

Mycobacteriumtuberculosis; Autophagy; Gene expression; Immunity

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.01.018

北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學發(fā)展專項基金資助項目(ZYLX201304)

101149，首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院細菌免疫室(呂子征、王偉、劉京銘、李傳友)，結(jié)核科(高孟秋)

高孟秋，Email: gaomqwdm@aliyun.com

2016-06-27)