固定化酶新技術(shù)
——釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶技術(shù)

孔軍，李子杰，中西秀樹，高曉冬

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

固定化酶新技術(shù)
——釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶技術(shù)

孔軍，李子杰，中西秀樹，高曉冬*

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

隨著固定化酶技術(shù)的日新月異，微膠囊技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。與傳統(tǒng)微膠囊生產(chǎn)技術(shù)不同，文章介紹了一種“天然的”微膠囊固定化酶生產(chǎn)新技術(shù)——釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶技術(shù)，詳述了該固定化技術(shù)原理及實(shí)例。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于：固定化酶的組裝“自然”完成，具有天然抗逆性，大小均一，可重復(fù)使用，綠色環(huán)保，可實(shí)現(xiàn)多種酶的共同固定。最后，對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

固定化酶；微膠囊技術(shù)；釀酒酵母孢子固定化酶；“一孢多酶”法

固定化酶技術(shù)已成為酶工程研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。與游離酶相比，固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性，并使酶能夠反復(fù)回收利用。微膠囊技術(shù)推動(dòng)了固定化酶的廣泛應(yīng)用。微膠囊固定化酶采用高分子材料將酶包裹在介質(zhì)周圍形成微小顆粒，被包裹的物質(zhì)稱為囊心或芯材，壁殼稱為囊壁或壁材[1]。微膠囊固定化酶能夠提供一種特定的反應(yīng)微環(huán)境，使反應(yīng)物或產(chǎn)物選擇性進(jìn)入或釋出[2]。微膠囊固定化酶最大的特色在于其能將囊內(nèi)和囊外空間隔離，提高了酶的穩(wěn)定性，并且可對(duì)囊內(nèi)外的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行有效調(diào)控。如今該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、化工、紡織、生物、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3]。然而傳統(tǒng)的微膠囊固定化酶技術(shù)不足之處在于：純酶和載體的準(zhǔn)備以及對(duì)組裝設(shè)備的依賴增加了生產(chǎn)成本，尤其是對(duì)產(chǎn)量要求不大，但仍需要昂貴設(shè)備進(jìn)行加工的酶微膠囊，其成本更高；微膠囊顆粒均一性欠佳，產(chǎn)品性能差異較大[4]；固定化過程產(chǎn)生有害物質(zhì)[5]，給人身安全、環(huán)境等帶來隱患；等等。因而研究探索新的酶固定化技術(shù)，開發(fā)穩(wěn)定、高效、生產(chǎn)便利的生產(chǎn)方式，改善微膠囊固定化酶產(chǎn)品性能、降低生產(chǎn)成本、減少生產(chǎn)過程中的資源消耗和環(huán)境污染等，是微膠囊固定化酶技術(shù)的主要研究?jī)?nèi)容，符合當(dāng)今工業(yè)綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的要求[6-7]。

對(duì)于釀酒酵母孢子的研究很早之前就有報(bào)道，但是將孢子應(yīng)用于酶的固定化卻鮮有報(bào)道。近些年來，隨著對(duì)釀酒酵母孢子的深入研究[8-9]，孢子的應(yīng)用領(lǐng)域逐步得到拓寬，釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶(Saccharomycescerevisiaespore microencapsulated enzyme)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)是利用基因工程技術(shù)，將可溶性分泌蛋白(即目標(biāo)酶類)基因在孢子中進(jìn)行表達(dá)，在產(chǎn)孢過程中實(shí)現(xiàn)對(duì)該蛋白的微膠囊固定化。該技術(shù)生產(chǎn)平臺(tái)僅需發(fā)酵設(shè)備，生產(chǎn)規(guī)模可根據(jù)產(chǎn)品需求量靈活調(diào)節(jié)?；趯?duì)釀酒酵母孢子壁結(jié)構(gòu)的研究，本研究室已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了多種目標(biāo)酶類的酵母孢子微膠囊固定化[10-12]。本綜述對(duì)釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶(以下簡(jiǎn)稱孢子固定化酶)的原理、孢子的組裝過程以及孢子固定化酶的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行詳細(xì)闡述，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

酵母孢子固定化酶的方法主要有以下兩種：生物學(xué)方法和化學(xué)方法。殼聚糖[13]是固定化酶的常用載體，也是野生型酵母孢子壁的重要組成成分，化學(xué)方法即通過交聯(lián)劑將目標(biāo)酶固定在“殼聚糖球”上，與目前常用的殼聚糖固定化酶操作基本相似；不同之處首先是利用孢子形成大小均一、性狀穩(wěn)定的天然的“殼聚糖球”，然后將目標(biāo)酶通過理化處理固定在“殼聚糖球”上。因此，本文對(duì)化學(xué)法孢子固定化酶的原理不做詳細(xì)闡述，僅舉例說明。生物學(xué)方法是通過基因工程技術(shù)，將需要表達(dá)的可溶性分泌類酶在孢子形成過程中直接固定在孢子壁中，形成天然的孢子固定化酶微膠囊。該技術(shù)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)是孢子壁中的殼聚糖層和二酪氨酸層。以下，將對(duì)孢子固定化酶技術(shù)的生物學(xué)原理及實(shí)例進(jìn)行詳細(xì)闡述。

1 釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶原理

釀酒酵母二倍體細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下通常進(jìn)行有絲分裂產(chǎn)生子代個(gè)體。在受到環(huán)境脅迫時(shí)，比如氮源缺乏，會(huì)迫使酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞從有絲分裂進(jìn)入減數(shù)分裂[14-18]，啟動(dòng)產(chǎn)孢程序并最終形成一個(gè)含有4個(gè)單倍體細(xì)胞的子囊，每個(gè)單倍體細(xì)胞即為孢子。在產(chǎn)孢過程中，形成了前孢子膜這個(gè)特殊的膜結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)的分泌系統(tǒng)通過重構(gòu)，將可溶性分泌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至前孢子膜內(nèi)；在前孢子膜內(nèi)形成孢子壁時(shí)，可溶性分泌蛋白被保留在孢子壁內(nèi)部。雖然，前孢子膜的外膜在孢子壁的組裝過程中消失，但是，成熟的孢子壁仍然能夠?qū)⒖扇苄苑置诘鞍捉亓艄潭ㄔ诒趦?nèi)，這主要是由于殼聚糖層和二酪氨酸層的存在。SUDA等[19]在孢子壁完整的野生型釀酒酵母孢子內(nèi)表達(dá)分泌型綠色熒光蛋白GFP時(shí)發(fā)現(xiàn)，其能被固定在孢子壁內(nèi)；但是缺少了二酪氨酸層的dit1Δ孢子卻不能。因此，在孢子中，二酪氨酸層能夠阻擋分泌型蛋白的擴(kuò)散。

釀酒酵母孢子壁包含有四種形態(tài)學(xué)上不同的結(jié)構(gòu)層次，從內(nèi)側(cè)到外側(cè)依次為甘露糖層(Mannan)、β-葡聚糖層(β-glucan)、殼聚糖層(Chitosan)和二酪氨酸層(Dityrosine)[9]。這4層結(jié)構(gòu)的合成是以從內(nèi)到外的順序依次進(jìn)行的。比如，最外層二酪氨酸層的合成只有在次外層殼聚糖層合成完畢后才開始合成[20]。對(duì)于殼聚糖層缺失或其合成有嚴(yán)重缺陷的菌株，二酪氨酸層將不能合成。源于孢子壁特有的結(jié)構(gòu)層次，酵母孢子具有高度的抗逆性，比如抗蛋白酶、抗有機(jī)試劑、抗熱等[21-22]，因此，在孢子將可溶性分泌蛋白固定在孢子壁的同時(shí)也將抗逆性賦予了固定在孢子壁內(nèi)部的蛋白。酵母孢子產(chǎn)孢過程中可溶性蛋白的分泌表達(dá)機(jī)制及孢子壁的特殊結(jié)構(gòu)層次，尤其是殼聚糖層和二酪氨酸層的存在是實(shí)現(xiàn)孢子固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)；相比于二酪氨酸層，殼聚糖層對(duì)于酶的固定更加必不可少。而釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞壁疏松，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，從內(nèi)而外依次由β-葡聚糖層(β-glucan)和甘露糖層(Mannan)組成，殼聚糖含量很少，不具備二酪氨酸層，因此對(duì)可溶性分泌蛋白的固定比孢子要少很多[10]。釀酒酵母孢子壁和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 釀酒酵母孢子壁和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)Fig.1 Saccharomyces cerevisiae spore wall and vegetative cell wall structure

釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶技術(shù)指：通過分子生物學(xué)手段在孢子中表達(dá)的可溶性分泌蛋白，在被轉(zhuǎn)運(yùn)至孢子外部時(shí)經(jīng)過孢子壁，被孢子壁的某些層次所截留：一部分鑲嵌在殼聚糖層中，一部分被截留在葡聚糖層和二酪氨酸層之間的空間中；隨著孢子的成熟，形成了天然、均一、穩(wěn)定的孢子固定化酶。同時(shí)，由于孢子壁最外層二酪氨酸層是網(wǎng)狀半透性膜，大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等不能通過，而小分子物質(zhì)如底物和產(chǎn)物等可以自由通過，底物與固定在孢子壁內(nèi)部的酶蛋白結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)孢子固定化酶對(duì)底物的酶解。

2 孢子的組裝過程

在孢子的形成過程中，孢子質(zhì)膜和孢子壁都是在母體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以從頭合成的方式進(jìn)行的[8]。孢子的形成需要2個(gè)重要的步驟：第一是前孢子膜的形成并包裹減數(shù)分裂Ⅱ期的子細(xì)胞核形成前孢子；第二是孢子壁的組裝。

2.1 前孢子膜及前孢子的形成

如圖2所示，在減數(shù)分裂Ⅱ期，在核被膜的外側(cè)對(duì)稱形成了4個(gè)紡錘極體SPB(spindle pole bodies)[23-24]。囊泡開始形成并定位在SPB的外側(cè)，在可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感蛋白受體SNARE(soluble N-ethylmaleimide- sensitive protein receptor)[25]幫助下逐漸融合，形成扁平的雙層膜結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)便是前孢子膜形成的開端。隨著減數(shù)分裂Ⅱ期核分裂的進(jìn)行，囊泡不斷地融入雙層膜結(jié)構(gòu)，最終擴(kuò)大并包裹各自的子細(xì)胞核。核分裂完成后，雙層膜最終將各自的細(xì)胞核和部分母細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)封閉在內(nèi)部。這樣在原來的母細(xì)胞中，最終形成含有四個(gè)前孢子的子囊。在每個(gè)核外部形成的雙層膜結(jié)構(gòu)稱之為前孢子膜[23-24, 26]。

圖2 前孢子膜的形成Fig.2 Formation of prosproe membrane

2.2 孢子壁的組裝

孢子壁的組裝即在前孢子膜雙層膜之間的內(nèi)腔填充孢子壁材料，該過程的起始發(fā)生在雙成膜結(jié)構(gòu)的內(nèi)腔[27]。在填充孢子壁的過程中，前孢子膜包裹的部分細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成和分泌，可溶性分泌蛋白經(jīng)過前孢子膜分泌到孢子壁外側(cè)。在反饋機(jī)制的協(xié)調(diào)作用下，孢子壁從內(nèi)而外依層組裝，只有靠?jī)?nèi)的一層完成組裝后，靠外的一層才開始組裝(圖3)：首先是最內(nèi)層甘露糖層，其次為β-葡聚糖層，再次為殼聚糖層，最后為二酪氨酸層[20]。一旦組裝完成，孢子壁便賦予孢子一系列抗逆性能[28]。

圖3 孢子壁的組裝Fig.3 Assembly of yeast spore wall

2.2.1 孢子壁合成的起始

孢子壁合成起始所必需的基因一般被認(rèn)為是GIP1基因，同時(shí)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AMA1基因也是孢子壁合成起始所必需的[29-31]。和GIP1的突變相似，AMA1突變后將導(dǎo)致孢子壁無(wú)法合成[32-33]。研究表明，AMA1可能在孢子壁形成的起始和減數(shù)第二次分裂完成的銜接中起協(xié)調(diào)作用。

2.2.2 甘露糖層和β-葡聚糖層的形成

前孢子膜閉合之后，分泌性囊泡將甘露糖蛋白運(yùn)送至前孢子膜雙層膜內(nèi)腔并大量積累以形成甘露糖層。

β-1,3-葡聚糖層的形成需要β-葡聚糖合成酶的參與，該酶在孢子質(zhì)膜上合成β-葡聚糖鏈后將其釋放入前孢子膜的內(nèi)腔，然后這些糖鏈進(jìn)一步連接組裝形成β-葡聚糖層。在釀酒酵母中，該β-葡聚糖合成酶由3個(gè)亞基組成，其中，F(xiàn)KS1基因編碼的亞基主要在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)起作用，GSC2/FKS2基因編碼的亞基主要在孢子壁組裝中起作用，F(xiàn)ks2是負(fù)責(zé)該層合成的主要蛋白[34]。FKS3基因編碼的亞基對(duì)孢子組裝起一定作用[35]，而fks3Δ缺陷菌株展現(xiàn)出孢子壁缺陷的性狀[19]。還有研究表明，多個(gè)基因?qū)Ζ?葡聚糖層的正常組裝都起到重要作用，如SPO77，SPS2，SPS22，CRR1，SSP2[36-39]。其中許多基因是序列簇產(chǎn)孢特有成員，例如，SPS2，SPS22分別與ECM33，PST1相關(guān)，CRR1與葡糖水解酶基因CRH1和CRH2相關(guān)，GAS與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞壁蛋白合成基因PIR相關(guān)[40]。這些成孢特有蛋白在組裝甘露糖層和β-葡聚糖層時(shí)發(fā)揮的作用等同于相應(yīng)基因在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞壁構(gòu)建時(shí)發(fā)揮的作用。在β-葡聚糖層組裝完畢后，前孢子膜外膜消失；雖然其具體機(jī)制尚不清楚；但是該膜的消失可以使某些孢子壁組裝因子如Osw1進(jìn)入，從而形成孢子外壁[36, 39]；同時(shí)孢子裝配好甘露糖層和β-葡聚糖層后可捕獲折射光，使得孢子在光學(xué)顯微鏡下可見。

2.2.3 殼聚糖層的形成

β-葡聚糖層組裝完成后，孢子進(jìn)行殼聚糖(脫乙酰幾丁質(zhì))層的合成。殼聚糖聚合物的自組裝與β-葡聚糖類似，首先幾丁質(zhì)合酶CSⅢ催化亞基Chs3p將幾丁質(zhì)(β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖單體)兩兩結(jié)合形成聚合物，輸送至孢子質(zhì)膜外；此時(shí)存在于孢子壁中的特異性脫乙酰酶Cda1p和Cda2p將其脫乙?；?，形成殼聚糖(β-1,4-氨基葡萄糖)[41-43]。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中變構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白Chs4p作為幾丁質(zhì)合酶的正向調(diào)控蛋白，在產(chǎn)孢過程中其功能被同源的Shc1所取代[44]。一旦殼聚糖聚合物形成，則被精確定位到孢子壁中，定位相關(guān)基因至少包括MUM3和OSW1；Mum3蛋白與酰基轉(zhuǎn)移酶同源，這可能與孢子壁組裝的催化機(jī)制一致[45]，然而Mum3蛋白的功能尚不明確；Osw1蛋白定位在孢子壁中，并可能直接參與殼聚糖層的組裝[36, 39]。同時(shí)由于殼聚糖在包裹孢子的過程中形成分支后與相鄰孢子的殼聚糖連接，因此在殼聚糖層形成的過程中，孢子橋連形成[32]；即使將子囊膜去除，由于這種橋連的存在，4個(gè)孢子仍然連接在一起。

2.2.4 二酪氨酸層的形成

該層既不是由糖類組成，也不是由蛋白質(zhì)組成，而是由含量大約為50%的非肽類N,N-二甲?；野彼峤M成[46-47]；然而其他成分以及二酪氨酸單體如何定位在孢子壁上仍然未知。該層的形成分為兩步：首先是二酪氨酸的形成，其次是二酪氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)及定位。位于孢子基質(zhì)中的DIT1和DIT2基因參與二酪氨酸的形成[48]。首先具有甲酰基轉(zhuǎn)移酶活性的Dit1p，將甲基轉(zhuǎn)移至L-酪氨酸上；作為細(xì)胞色素P450家族成員的Dit2p將2個(gè)N-甲基-酪氨酸的苯環(huán)連接在一起[48]形成二酪氨酸。新合成的二酪氨酸在ATP依賴的、位于前孢子膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Dtr1p的作用下由孢子胞質(zhì)運(yùn)送至孢子壁進(jìn)行組裝[49]。像前幾層的合成一樣，二酪氨酸需要在胞外酶的作用下組裝為聚合體的形式，但是對(duì)這些酶的具體功能還有待研究。

形成的二酪氨酸層網(wǎng)狀孔徑大小、松散程度可以通過某些基因的突變進(jìn)行調(diào)節(jié)，如OSW2基因的敲除，使得二酪氨酸層孔徑增大。對(duì)于缺失了二酪氨酸層的dit1Δ孢子和同時(shí)缺失了二酪氨酸層與殼聚糖層的chs3Δ孢子，可溶性蛋白則滲漏到孢子壁外部的子囊胞質(zhì)中[19]。以上突變，對(duì)孢子固定化酶酶學(xué)性質(zhì)改進(jìn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶實(shí)例

根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，本研究室已利用酵母孢子固定化酶技術(shù)成功地固定了多種可溶性酶，下面的實(shí)例中將分別予以介紹。

3.1 酵母孢子固定化酶的成功先例——釀酒酵母孢子微膠囊固定化α-半乳糖苷酶

施李兵等[10]為了研究二酪氨酸層對(duì)于α-半乳糖苷酶的固定是否必需及其在孢子中的定位情況，將α-半乳糖苷酶(MEL1基因編碼)與紅色熒光蛋白R(shí)FP在孢子中進(jìn)行融合表達(dá)。在此之前，研究者首先將RFP連接在信號(hào)肽C端構(gòu)建spRFP融合蛋白，并在不同孢子突變體上進(jìn)行表達(dá)(孢子固定化酶生物法)：釀酒酵母野生型孢子(孢子壁完整)、osw2Δ孢子(二酪氨酸層疏松)和dit1Δ孢子(不含有二酪氨酸層)。通過熒光共定位發(fā)現(xiàn)：野生型孢子由于二酪氨酸層的存在，在孢子壁邊緣有清晰的紅色熒光輪廓；osw2Δ孢子的二酪氨酸層雖然有一定程度的缺陷，但孢子壁周圍仍具有較強(qiáng)的清晰紅色熒光；dit1Δ缺陷型孢子由于不含有二酪氨酸層，RFP不能被固定在孢子壁上，因此彌散在子囊胞質(zhì)中，從而證實(shí)二酪氨酸層能夠作為“擴(kuò)散屏障”阻止可溶性蛋白的擴(kuò)散。

隨后，研究者為了證明殼聚糖層在孢子固定化α-半乳糖苷酶中的作用，將α-半乳糖苷酶與RFP在孢子中進(jìn)行融合表達(dá)。與單獨(dú)表達(dá)RFP的結(jié)果一致，野生型孢子和osw2Δ孢子均能夠?qū)⑷诤系鞍妆磉_(dá)定位在孢子壁上；但值得注意的是，與單獨(dú)表達(dá)RFP不同，dit1Δ孢子表達(dá)的α-半乳糖苷酶-RFP融合蛋白也能夠定位在孢子壁上；而chs3Δ孢子(不含有二酪氨酸層和殼聚糖層)表達(dá)的融合蛋白不能表達(dá)定位在孢子壁上。說明對(duì)于α-半乳糖苷酶，不需要二酪氨酸層的存在，殼聚糖層就可以將該酶表達(dá)定位在孢子壁上。

研究者為了確定最優(yōu)的表達(dá)固定體系，對(duì)不同突變株固定的α-半乳糖苷酶的活性進(jìn)行檢測(cè)。同野生型孢子和osw2Δ孢子相比，dit1Δ孢子表達(dá)的α-半乳糖苷酶的活性最高，可能的原因是由于“擴(kuò)散屏障”二酪氨酸層的缺失，使得底物更易于與酶接觸發(fā)生反應(yīng)；osw2Δ孢子表達(dá)的α-半乳糖苷酶的活性比野生型高，可能的原因是osw2Δ孢子的二酪氨酸層較野生型松散、孔徑更大，底物更容易穿過二酪氨酸層與酶接觸發(fā)生反應(yīng)。

雖然dit1Δ孢子表達(dá)的α-半乳糖苷酶的活性最高，但由于“擴(kuò)散屏障”二酪氨酸層的缺失，導(dǎo)致dit1Δ孢子表達(dá)固定的α-半乳糖苷酶更易釋放。為了驗(yàn)證這種可能性，對(duì)各種突變體孢子用含有去污劑的高鹽溶液(0.6 mol/L NaCl和0.1% Triton X-100)進(jìn)行洗滌，然后測(cè)定洗滌后的活性。結(jié)果顯示：同野生型孢子和osw2Δ孢子相比，dit1Δ孢子表達(dá)的酶活下降得最為明顯；又經(jīng)過4次洗滌，dit1Δ孢子表達(dá)的酶活下降了約50%，wt孢子和osw2Δ孢子表達(dá)的酶活下降了約25%。由此可以說明，二酪氨酸層的存在對(duì)于阻止α-半乳糖苷酶從孢子壁上的釋放起到重要作用。

為了研究孢子固定化α-半乳糖苷酶對(duì)蛋白酶的抗逆性，使用蛋白酶K對(duì)不同孢子壁缺陷型孢子固定化α-半乳糖苷酶進(jìn)行處理，并以釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中并濃縮的α-半乳糖苷酶作為對(duì)照。結(jié)果顯示：野生型孢子和osw2Δ孢子固定的α-半乳糖苷酶對(duì)蛋白酶K展現(xiàn)出很強(qiáng)的抗逆性。這是由于：二酪氨酸層作為“擴(kuò)散屏障”只能允許小分子物質(zhì)(如底物和產(chǎn)物)通過，不允許大分子物質(zhì)(如蛋白酶K、固定在孢子壁中的酶)通過。蛋白酶K與α-半乳糖苷酶隔離，從而展現(xiàn)出抗蛋白酶K降解的能力；dit1Δ孢子固定的α-半乳糖苷酶經(jīng)蛋白酶K處理后，雖然酶活下降較野生型和osw2Δ多，但仍有很高的相對(duì)酶活，說明殼聚糖層對(duì)α-半乳糖苷酶也有一定的保護(hù)作用；而游離的α-半乳糖苷酶由于不受到任何保護(hù)作用，經(jīng)蛋白酶K處理后，相對(duì)酶活僅為35%左右。此外還發(fā)現(xiàn)孢子固定的α-半乳糖苷酶具有比游離酶具有更高的溫度耐受性；同時(shí)，經(jīng)多次洗滌后，孢子固定化酶殘留酶活仍然很高。

3.2 釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶在稀少糖合成中的應(yīng)用

以葡萄糖為底物，在木糖異構(gòu)酶(XI)和D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(DPE)的聯(lián)合作用下合成具有廣泛應(yīng)用前景的D-阿洛酮糖(Psicose)是目前稀少糖研究的重點(diǎn)。為避免直接使用游離酶，本研究室李子杰和李毅[12]利用生物法和化學(xué)法兩種方法對(duì)木糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行了孢子固定化。在生物法的研究中，將XI與GFP在孢子中進(jìn)行融合表達(dá)，通過GFP的熒光定位來確定XI在孢子中的定位。對(duì)于野生型孢子和osw2Δ孢子，能夠清晰地看到GFP綠色熒光信號(hào)完好地包裹在孢子壁上，說明XI成功地固定在了孢子壁上。相對(duì)于野生型孢子和osw2Δ孢子，dit1Δ孢子由于二酪氨酸層的缺失導(dǎo)致GFP信號(hào)強(qiáng)度稍弱，但仍可以觀察到融合蛋白表達(dá)定位到孢子壁上。為了確定XI在孢子上是否具有催化活性，通過HPLC檢測(cè)固定化XI將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖的能力。結(jié)果顯示，底物D-葡萄糖在孢子固定化酶的催化作用下可以轉(zhuǎn)化為D-果糖。之后對(duì)不同孢子壁缺陷型孢子固定化XI進(jìn)行了酶活比較、重復(fù)利用率、最適溫度和最適pH等實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與施李兵研究相似，osw2Δ孢子是較野生型和dit1Δ孢子最適合用于固定化酶的載體。值得注意的是，野生型和osw2Δ孢子固定化酶在95℃高溫下的相對(duì)酶活都能達(dá)到最高酶活的60%。綜合考慮，孢子壁中二酪氨酸層的存在，一方面能有效地阻止酶的釋放，另一方面提高了酶對(duì)高溫的耐受性。

在化學(xué)法固定化酶的研究中，李毅[50]用缺少了二酪氨酸層的殼聚糖球-dit1Δ孢子作為固定化載體，對(duì)D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行了固定化研究。結(jié)果顯示，孢子殼聚糖球固定化的D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶展現(xiàn)出較游離酶更廣闊的溫度和pH耐受區(qū)間。在重復(fù)利用8次后，相對(duì)酶活仍然高達(dá)80%。最后，又利用一鍋兩酶法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)：首先利用osw2Δ孢子固定的木糖異構(gòu)酶將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-果糖，然后利用dit1Δ孢子固定的D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶將D-果糖轉(zhuǎn)化成D-阿洛酮糖。通過工藝的改進(jìn)，最終使得阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到12%，比利用游離酶高出2倍。至此，利用酵母孢子固定化酶并進(jìn)行生產(chǎn)已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室水平取得成功。

在以上2個(gè)實(shí)例中，研究者均以營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照，通過檢測(cè)帶有RFP或GFP標(biāo)簽的目的蛋白在孢子中的定位，證實(shí)了酵母孢子可以將可溶性分泌蛋白表達(dá)固定在孢子壁中；有學(xué)者利用酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行酶的固定化[51]，但相對(duì)于細(xì)胞壁簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞，孢子固定的酶量更多[10]。同時(shí)，為了比較不同孢子壁缺陷型孢子固定化酶量高低，將帶有3×HA標(biāo)簽的目的蛋白在相應(yīng)孢子中表達(dá)。野生型孢子和osw2Δ孢子表現(xiàn)出相對(duì)于dit1Δ更高的酶固定量，這與在dit1Δ孢子中表達(dá)的MEL1-RFP或GFP-XI融合蛋白熒光信號(hào)較弱相一致，說明二酪氨酸層的存在一定程度上阻止了酶的泄漏。二酪氨酸層作為保護(hù)屏障，可以保護(hù)固定在孢子壁中的酶免受蛋白酶的降解，在研究中也得到了證實(shí)[10]。之后對(duì)固定在孢子壁內(nèi)部的酶的催化活性進(jìn)行了確認(rèn)，并對(duì)不同孢子壁缺陷菌株固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。總之，以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)從各個(gè)方面證明了酵母孢子微膠囊固定化酶的可行性。

3.3 酵母孢子固定化酶的優(yōu)點(diǎn)

通過酵母孢子固定化原理及已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于酶的固定化“自然”完成，具有天然抗逆性，大小均一，可重復(fù)使用，綠色環(huán)保，可實(shí)現(xiàn)1個(gè)孢子對(duì)多個(gè)酶共同固定：

(1)成本低廉：酵母孢子固定化酶隨著孢子的形成而“自然”完成，只要在孢子內(nèi)部表達(dá)所需固定化酶的基因，便可得到孢子固定化酶微膠囊；無(wú)需考慮芯材和壁材的兼容性，避免了對(duì)純酶、固定化材料和組裝設(shè)備的依賴，降低了生產(chǎn)成本；不需要理化過程介入，避免了理化處理對(duì)產(chǎn)品性能的影響；生產(chǎn)平臺(tái)僅需發(fā)酵設(shè)備，生產(chǎn)規(guī)模可根據(jù)產(chǎn)量要求靈活調(diào)節(jié)；

(2)抗逆性強(qiáng)：由于酵母孢子壁的特殊結(jié)構(gòu)層次，其較強(qiáng)的天然抗逆性可以保護(hù)固定在其中的酶抵抗外界不利條件的影響；

(3)產(chǎn)品質(zhì)量均一：酵母產(chǎn)孢為嚴(yán)格的自然生理過程，因此，孢子固定化酶微膠囊大小一致，性狀穩(wěn)定；

(4)生產(chǎn)簡(jiǎn)便：孢子一經(jīng)產(chǎn)出無(wú)需純化，便于產(chǎn)品與酶的分離，可重復(fù)使用；

(5)安全：酵母產(chǎn)孢過程為自然生理過程，生產(chǎn)過程能耗低、污染少，產(chǎn)品作為生物質(zhì)可自然降解，綠色環(huán)保。

(6)“一孢多酶”體系初步建立：筆者已成功將肌酐降解酶系中的2種酶共表達(dá)、固定在同一孢子內(nèi)部。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，“一孢兩酶”法是可行的，較分別固定后再聯(lián)合使用表現(xiàn)出更優(yōu)越的酶學(xué)性能。下一步，筆者將對(duì)“一孢三酶”法進(jìn)行研究。

“一孢多酶法”是本研究室目前正在進(jìn)行的酵母孢子固定化酶研究項(xiàng)目之一，目的是實(shí)現(xiàn)多酶體系的孢子微膠囊固定化，即在一個(gè)孢子內(nèi)部同時(shí)表達(dá)、固定兩種或兩種以上的酶。對(duì)于共表達(dá)雙酶體系的優(yōu)點(diǎn)，有報(bào)道[51-52]稱：2種酶的共表達(dá)在空間上十分接近，形成的微環(huán)境利于第二種酶與第一種酶解產(chǎn)物的迅速結(jié)合，節(jié)省了第一種酶酶解產(chǎn)物擴(kuò)散到第二種酶的時(shí)間，并為第二種酶解反應(yīng)提供持續(xù)的底物濃度。有學(xué)者實(shí)現(xiàn)了D-葡糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的共表達(dá)[53]，且產(chǎn)率達(dá)到16%。在肌酐檢測(cè)中，肌酐經(jīng)肌酐酶水解為肌酸，肌酸被肌酸酶水解為肌氨酸和尿素，肌氨酸被肌氨酸氧化酶水解產(chǎn)生雙氧水，通過檢測(cè)雙氧水的生成量來確定肌酐的濃度[54-55]。目前，筆者已將“一孢兩酶法”成功應(yīng)用到肌酸酶和肌酐酶在孢子壁中的共表達(dá)、固定，這為“一孢多酶法”的研究和肌酐檢測(cè)試劑盒的研發(fā)打下理論基礎(chǔ)。屆時(shí)，酵母孢子對(duì)多酶體系的微膠囊固定化將成為另一優(yōu)勢(shì)。

4 討論與展望

截止目前，本研究室已經(jīng)成功地將多種固定在釀酒酵母孢子中，為孢子微膠囊固定化酶的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。綜合考察酵母孢子對(duì)不同酶的固定化效果后不難發(fā)現(xiàn)：各突變株孢子中，dit1Δ孢子固定化酶活性最高，但是經(jīng)反復(fù)使用后其酶活下降較快，不宜重復(fù)使用；這是由于dit1Δ的孢子壁缺失最外層二酪氨酸層，導(dǎo)致一部分固定不牢固的酶失去擴(kuò)散屏障而損失，同時(shí)抗逆性能減弱。而osw2Δ的酶活雖然比dit1Δ略低，但其經(jīng)過反復(fù)使用后仍有較高的酶活；而且，osw2Δ比dit1Δ抗逆性更強(qiáng)，比如經(jīng)蛋白酶K、SDS處理后殘留酶活更高，對(duì)溫度、pH的耐受性更強(qiáng)；這是由于該突變株受到二酪氨酸層保護(hù)，同時(shí)osw2Δ孢子壁的二酪氨酸層網(wǎng)孔較野生型松散，增加了底物與固定化酶的結(jié)合機(jī)會(huì)。因此，osw2Δ孢子是比較理想的固定化酶載體。因此，通過調(diào)節(jié)二酪氨酸層孔徑大小，開發(fā)固定化酶性能優(yōu)于osw2Δ的酵母孢子突變株是該研究的下一個(gè)目標(biāo)。

目前，本研究室利用酵母孢子固定化技術(shù)正在進(jìn)行的研究項(xiàng)目有：肌酸酶和肌酐酶的固定化，以期開發(fā)肌酐檢測(cè)用試劑盒；固定化稀有糖酶，用于功能性稀有糖的生產(chǎn)；其他研究項(xiàng)目，如腸胃道給藥載體的研究。雖然人的腸胃道環(huán)境和果蠅不同，但是孢子的抗逆性使其可以穿過果蠅腸胃道[56]，這為利用孢子的強(qiáng)抗逆性開發(fā)一般藥物難以到達(dá)的腸胃道中末端藥物提供了思路。因此，將孢子微膠囊固定化酶用于藥用試劑盒和功能性藥物的研發(fā)具有極大的潛力。

在研究酵母孢子固定化酶的同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)：由于殼聚糖具有吸附性的特點(diǎn)，作為殼聚糖球的dit1Δ孢子可以吸附金屬離子和負(fù)電性化合物。例如，本研究室張海妮[11]將二酪氨酸層缺失的dit1Δ孢子用作殼聚糖球，用來吸附Cu2+，并與孢子壁完整的野生型和同時(shí)缺失二酪氨酸層和殼聚糖層的chs3Δ孢子進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，作為殼聚糖球的dit1Δ孢子，吸附Cu2+能力最強(qiáng)；其次是孢子壁完整的野生型；而缺失了二酪氨酸層和殼聚糖層的chs3Δ孢子吸附Cu2+能力最弱。之后，又對(duì)孢子吸附Cr3+、Ni2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+等離子的能力進(jìn)行了研究。同樣，作為殼聚糖球的dit1Δ孢子，對(duì)各種離子的吸附量是所有細(xì)胞類型中最高的，而營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞是最低的；即便是缺失了最外2層的chs3Δ孢子，其吸附量也是營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的2倍多。由此說明，缺失了二酪氨酸層的dit1Δ孢子作為殼聚糖球用于重金屬離子的吸附是最佳選擇。同時(shí)，由于殼聚糖帶正電，又對(duì)作為殼聚糖球的dit1Δ孢子吸附帶有負(fù)電荷的牛磺膽酸能力進(jìn)行研究。與吸附金屬離子結(jié)果相似，dit1Δ孢子吸附牛黃膽酸能力優(yōu)于野生型孢子和chs3Δ孢子。上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)說明dit1Δ孢子作為殼聚糖球?qū)χ亟饘偌澳承┴?fù)電荷分子的吸附是可行的。該研究將釀酒酵母孢子的應(yīng)用從固定化酶領(lǐng)域進(jìn)一步拓展到了環(huán)保領(lǐng)域，為釀酒酵母孢子的應(yīng)用開拓了道路。

綜上所述，除了對(duì)孢子吸附能力的研究外，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)于酵母孢子固定化酶的研究是酵母孢子應(yīng)用研究的重點(diǎn)。隨著微膠囊固定化酶技術(shù)的發(fā)展，釀酒酵母孢子固定化酶作為微膠囊固定化酶技術(shù)的新成員，以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)首次展現(xiàn)在大家面前：固定化酶的組裝“自然”完成，具有天然抗逆性，大小均一，可重復(fù)使用，綠色環(huán)保，“一孢多酶體系”已經(jīng)初步建立，等等。基于以上優(yōu)點(diǎn)及研究結(jié)果，相信，酵母孢子固定化酶將會(huì)為酶的微膠囊固定化增光添彩！

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A novel way for enzyme immobilization——Saccharomycescerevisiaespore microencapsulated enzyme

KONG Jun, LI Zi-jie, Nakanishi Hideki, GAO Xiao-dong

(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology Ministry of Education,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The technologies for enzyme microencapsulation are making great progress due to development of enzyme immobilization. A novel way encapsulating enzymes “naturally” is introduced herein, i.e.,Saccharomycescerevisiaespore microencapsulated enzyme. Principles and example of this method s are exposed to readers. There are many advantages such as unnecessary preparation of core materials and wall materials, natural assembly of spore microcapsule is, without physicochemical treatment, no rely on expensive production equipments, strong stress resistance, easily manufacture, uniform and stable size. Finally, the application the yeast spore encapsulated enzyme in future was prospected herein.

immobilized enzyme; microencapsulation;Saccharomycescerevisiaespore encapsulated enzyme; “colocalization of multiple enzymes in one spore” skill

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701043

博士研究生(高曉冬教授為通訊作者,E-mail: xdgao@jiangnan.edu.cn)。

2015年國(guó)家自然科學(xué)基金(21576118)

2016-05-31，改回日期：2016-06-27