紅豆杉種質(zhì)資源遺傳多樣性的目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）分析

陳明輝++張志錄++楊雨華++佟偉霜++楊風(fēng)嶺

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.028

摘要：采用目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）分子標(biāo)記技術(shù)，研究紅豆杉18份種質(zhì)的遺傳多樣性及種質(zhì)間的遺傳關(guān)系，為紅豆杉資源的保護、利用以及遺傳育種提供依據(jù)。以18份紅豆杉種質(zhì)資源為材料，從80條引物中篩選出19條重復(fù)性好、條帶清晰的引物進(jìn)行PCR擴增，利用NTSYS-pc2.10e軟件對其擴增位點多態(tài)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：19條引物共擴增出134條帶，其中97條具有多態(tài)性，多態(tài)性帶比率為72.39%。18個紅豆杉種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)在031～0.89之間，說明SCoT標(biāo)記能夠揭示材料間較高的遺傳多樣性。利用UPGMA進(jìn)行系統(tǒng)的聚類分析顯示，在相似系數(shù)0.53處可將18份紅豆杉資源分成兩大類；主坐標(biāo)分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致。紅豆杉資源具有較豐富的遺傳多樣性，SCoT分子標(biāo)記技術(shù)可有效地從分子水平揭示紅豆杉種質(zhì)資源的遺傳背景和親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：紅豆杉；目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）；遺傳多樣性；聚類分析；親緣關(guān)系

中圖分類號： S791.490.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0116-04

收稿日期：2015-09-25

基金項目：河南省科學(xué)攻關(guān)計劃 （編號：122102310652）；河南省環(huán)境科學(xué)重點學(xué)科建設(shè)項目（編號：Pxy-zdxk-2013003）。

作者簡介：陳明輝（1974—），男，河南平頂山人，博士，講師，主要從事植物生理生化及分子生物學(xué)研究。E-mail：cmh_abc@126.com。

通信作者：楊風(fēng)玲，博士，教授，主要從事植物化學(xué)研究。E-mail：yangfl0001@163.com。紅豆杉[Taxus chinensis （Pilger） Rehd.]是第四世紀(jì)孑遺植物，已在地球上生活250萬年，是我國Ⅰ級重點保護野生植物，被稱為活化石[1-2]。1971年，美國科學(xué)家Wani等首次從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）樹皮中提取獲得抗癌藥物紫杉醇（Taxol）[3]，此后紅豆杉的藥用價值及其開發(fā)在我國廣泛開展。紅豆杉生長緩慢，極少成林，資源極其貧乏，而且紫杉醇含量僅為0.01%，由于紅豆杉資源遭到嚴(yán)重破壞而數(shù)量急劇下降，目前天然紅豆杉已處于嚴(yán)重瀕危狀態(tài)；所以，關(guān)于紅豆杉的繁殖、保護與利用已成為當(dāng)前多個學(xué)科的研究熱點[4-11]。

目前紅豆杉分子標(biāo)記研究取得了一定的成果。張雪梅等通過對南方紅豆杉18個居群進(jìn)行了RFLP分析，發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉現(xiàn)在的遺傳結(jié)構(gòu)可能源于居群的片段化效應(yīng)[12]；Miao等利用SSR技術(shù)對14個居群的南方紅豆杉生境斷裂譜系和遺傳效應(yīng)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生境斷裂導(dǎo)致了云南紅豆杉近親繁殖和種群分化[13]；吳瓊等利用基于紅豆杉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序進(jìn)而發(fā)掘基因表達(dá)譜多態(tài)性標(biāo)記[14]。但這些分子標(biāo)記方法成本較高，操作復(fù)雜。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（start codon targeted polymorphism，SCoT）分子標(biāo)記技術(shù)是Collard等[15]開發(fā)的一種基于SPAR（單引物擴增反應(yīng)）的目的基因分子標(biāo)記新技術(shù)。SCoT依據(jù)植物基因中的ATG翻譯起始位點側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計單引物并對基因組進(jìn)行擴增[16]。SCoT標(biāo)記結(jié)合ISSR標(biāo)記和RAPD標(biāo)記的優(yōu)點，操作簡單、成本低廉、多態(tài)性豐富，能有效地產(chǎn)生與性狀聯(lián)系的標(biāo)記，是一種能跟蹤性狀的新的分子標(biāo)記，有利于分子輔助育種[17-18]。該分子標(biāo)記技術(shù)已被成功應(yīng)用于花生[19]、龍眼[20]、芒果[21-22]等植物。本研究利用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)，從DNA水平研究了紅豆杉18份種質(zhì)的遺傳多樣性及種質(zhì)間的遺傳關(guān)系，以期對其親緣關(guān)系有更全面了解，為資源的保護、利用以及遺傳育種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為2013—2014年采自不同地區(qū)的18份紅豆杉種質(zhì)資源（表1），取其幼嫩葉片迅速置于液氮中速凍，帶回實驗室后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。試驗用?0對SCoT分子標(biāo)記引物序列分別參照Collard等[15]和Luo等[22]設(shè)計的引物合成，所有引物由上海生工生物工程公司合成。dNTPs、DL2000 marker和TaqDNA聚合酶以及其他試劑均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2方法

1.2.1DNA提取與檢測采用改良的CTAB法[23]提取DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，同時用島津BioSpec-nano型超微量分光光度計分析儀檢測DNA樣品質(zhì)量和濃度。模板DNA稀釋至50 ng/μL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SCoT-PCR擴增PCR擴增在ABI Veriti 梯度 PCR擴增儀上進(jìn)行。采用20 μL的反應(yīng)體系，其中含50 ng/μL模板DNA 1.0 μL、10×buffer（含Mg2+）2.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、5 U Taq DNA聚合酶0.5 μL、10 μmol/L dNTPs 0.5 μL，加ddH2O至20 μL。擴增程序為94 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性50 s，復(fù)性退火（溫度隨引物而定）1 min，72 ℃ 延伸5 min，共36個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。擴增反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為1×TAE，染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照保存。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

SCoT產(chǎn)物按條帶的有無分別賦值，在相同遷移位置有帶記為1，無帶記為0，建立SCoT標(biāo)記的0、1矩陣。把得到的0、1矩陣輸入NTSYS-pc2.10e計算遺傳相似性系數(shù)，并進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建樹狀圖，分析樣品間親緣關(guān)系。利用NTSYS-pc2.10e軟件將遺傳相似系數(shù)進(jìn)行Dcenter數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，求其特征量和特征向量，得到主坐標(biāo)分析圖，進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

2結(jié)果與分析

2.1SCoT擴增片段多態(tài)性分析

從80條引物中篩選出重復(fù)性好、擴增條帶清晰、多態(tài)性強的SCoT引物19條。利用這19條引物對18份紅豆杉種質(zhì)資源進(jìn)行擴增，每條引物可擴增出4～14條帶，平均多態(tài)性條帶為5～10條。擴增出的DNA帶的大小介于100～1 800 bp，其中代表性擴增圖譜見圖1。19條引物共擴增出134個DNA位點，其中97個位點具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為72.4%，說明供試的樣品遺傳多樣性比較豐富，多態(tài)性最高的是引物SCoT8和SCoT31，均達(dá)到100%，多態(tài)性最低的是引物SCoT17，為4286%（表2）。

2.2相似系數(shù)分析

用NTSYS-pc2.10e軟件計算紅豆杉種質(zhì)間的Jaccard遺傳相似系數(shù)（表3）。表3結(jié)果表明：18個不同地區(qū)紅豆杉種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)范圍在0.31～0.89之間。其中河南濟源黑龍溝的4號與河南濟源西坪村的5號相似系數(shù)為089，河南盧氏縣柴家溝的6號與河南盧氏縣毛河村的10號、甘肅徽縣北禪寺-2的14號的相似系數(shù)都為0.89，表明4號與5號、6號與10號、6號與14號的親緣關(guān)系較近。河南獲嘉縣的3號與重慶貓兒山的18號相似系數(shù)為最小，為031，說明3號與18號親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA系統(tǒng)聚類法構(gòu)建了紅豆杉試材間的遺傳關(guān)系聚類圖（圖2）。從聚類圖（圖2）來看，在相似系數(shù)0.53為閾值時，可將所有供試材料分為Ⅰ和Ⅱ兩大類。Ⅰ類包括4份材料，分別為神龍灣的1號、雙底村的2號、獲嘉縣的3號和平頂山-2的8號；Ⅱ類包括14份材料。在閾值約為0.61時，Ⅱ類又可分成Ⅱa和Ⅱb兩個亞類，其中Ⅱa亞類包括黑龍溝的4號、西坪村的5號、平頂山-1的7號、石鼓村的9號、宣恩縣的12號、貴陽的17號等6份材料；Ⅱb亞類包括柴家溝的6號、毛河村的10號、堯山的11號、北禪寺-1的13號、北禪寺-2的14號、天水的15號、兩當(dāng)縣的16號、貓兒山的18號等8份材料。2.4主坐標(biāo)分析

根據(jù)18份紅豆杉材料SCoT標(biāo)記產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析，繪制三維散點圖（圖3）。從主坐標(biāo)圖（圖3）可看出，18份紅豆杉材料被分為3組，第1組為1號、2號、3號和8號，位于主坐標(biāo)圖的右方；第2組為4號、5號、7號、9號、12號和17號，位于主坐標(biāo)圖的左方；第3組為6號、10號、11號、13號、14號、15號、16號和18號，分布在主坐標(biāo)圖的中間偏下方。其中第2、3組距離相對較近，它們與第1組距離較遠(yuǎn)，但第3組的15號與第1組距離較近。主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示，第1組紅豆杉與第2、3組紅豆杉在分子水平上表現(xiàn)出了較大的遺傳差異，主坐標(biāo)分析可以從不同方向、不同層面更加直觀地顯示各材料間的關(guān)系。

3結(jié)論與討論

SCoT標(biāo)記是一種基于翻譯起始位點的目標(biāo)分子標(biāo)記新技術(shù)，SCoT單引物在PCR反應(yīng)中充當(dāng)上下游引物的角色，從而使得引物結(jié)合位點之間的片段得以有效擴增，可獲得豐富的遺傳信息[24-25]，所以其在紅豆杉的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分類上具有一定的可靠性。本研究將SCoT標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于紅豆杉材料的DNA多態(tài)性鑒定，在紅豆杉各材料內(nèi)均檢測到較豐富的多態(tài)性，選用的19條SCoT引物具有很高的多態(tài)性，平均多態(tài)率達(dá)到73.19%。SCoT標(biāo)記與功能基因相關(guān)，能在紅豆杉各材料之間檢測出較豐富的遺傳多態(tài)性，這與紅豆杉各資源間具有較豐富的多態(tài)性相一致，是進(jìn)一步開發(fā)特定功能基因標(biāo)記和建立分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)體系的基礎(chǔ)。

從本試驗聚類結(jié)果可以看出，在Ⅰ組的4個紅豆杉材料中，8號平頂山-2紅豆杉經(jīng)中國科學(xué)院植物研究所鑒定為東北紅豆杉，這4份紅豆杉材料聚為一個類群，說明它們親緣關(guān)系較近，同屬于東北紅豆杉體系；在第Ⅱ類的Ⅱa亞類中，有6份紅豆杉材料聚為一個類群，其中7號平頂山-1和9號石鼓村紅豆杉經(jīng)中國科學(xué)院植物研究所鑒定為南方紅豆杉，說明這個類群中的6份紅豆杉和南方紅豆杉具有密切的淵源，構(gòu)成獨特的遺傳資源。在第Ⅱ類的Ⅱb亞類中，有8份紅豆杉材料聚為一個類群，其中6號柴家溝紅豆杉經(jīng)中國科學(xué)院植物研究所鑒定為中國紅豆杉，說明這個類群中的8份紅豆杉和秦嶺一帶的中國紅豆杉遺傳關(guān)系較近。

由以上分析可知，本試驗的SCoT分子標(biāo)記數(shù)據(jù)在一定程度上反映了不同材料紅豆杉地理分布情況，說明地理因素對紅豆杉的親緣關(guān)系有很大影響；但是，有些地理距離遠(yuǎn)而遺傳距離卻比較相近，這可能與其具有相似的環(huán)境條件和常年的引種有關(guān)。

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