胡代花??+張嘉昕??+韓豪??王永吉

摘要：應(yīng)用超高效液相色譜，分別測定白藜蘆醇、茶多酚及大豆異黃酮與維生素D2在1 ∶[KG-3]1、1 ∶[KG-3]10、10 ∶[KG-3]1這3種質(zhì)量比例混合下，放置10、26、36 d后樣品中維生素D2穩(wěn)定性變化。結(jié)果表明，以1 ∶[KG-3]1、1 ∶[KG-3]10、10 ∶[KG-3]1質(zhì)量比例添加的3種天然抗氧化劑均對維生素D2穩(wěn)定性具有一定的保護作用，且隨著放置時間的延長，對維生素D2的穩(wěn)定性保護作用愈明顯。其中以 1 ∶[KG-3]10 質(zhì)量比例添加對維生素D2的穩(wěn)定性保護作用最佳，添加3種天然抗氧化劑36 d后維生素D2的存留率均在84%以上，與空白對照相比增加72.12%、68.08%、75.32%。茶多酚、大豆異黃酮及白藜蘆醇3種天然抗氧化劑均對維生素D2具有較好的穩(wěn)定性保護作用，其中以1 ∶[KG-3]10質(zhì)量比例混合時效果較佳。

關(guān)鍵詞：維生素D2；穩(wěn)定性；茶多酚；大白藜蘆醇；豆異黃酮；天然抗氧化劑

中圖分類號： R927.11文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0363-03

〖FQ（78。26，ZX，DY-W〗〖CDF13〗〖HT6SS〗[HJ1.3mm]

稿日期：2015-12-31

基金項目：陜西省自然科學(xué)基金（編號：2014JQ2083）；陜西省2011陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心項目[編號：QBXT-Z（P）-15-15]；陜西省漢中市科技局項目（編號：維生素D2，別稱鈣化醇或麥角骨化醇，是維生素D家族的重要一員，能調(diào)節(jié)鈣磷的代謝，促進骨骼的健康，在臨床上用于預(yù)防和治療佝僂病、骨質(zhì)軟化及甲狀旁腺功能低下等疾病[1-3]。由于維生素D2 性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、熱、氧等易降解而失效[4-6]，導(dǎo)致體內(nèi)生物利用度降低，難以保證常規(guī)制劑質(zhì)量穩(wěn)定性，從而限制了它在藥品、食品、保健食品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。目前常用β-環(huán)糊精包被或微囊化技術(shù)提高維生素D2及其制劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性[7-9]。

茶多酚、大豆異黃酮及白藜蘆醇是源于我國優(yōu)勢資源的3種天然抗氧化劑，具有較好的抗氧化性，并顯示良好的抗衰老、抗腫瘤等生物活性，在藥品、保健食品、化妝品等中具有廣闊的應(yīng)用前景[10-16]；另一方面，超高效液相色譜作為一種高效分析技術(shù)，其高分辨度、高分析效率、低溶劑消耗在色譜分析中具有顯著優(yōu)勢，并在食品質(zhì)量安全等分析檢測中廣泛應(yīng)用[17-21]。筆者所在的課題組前期建立了乙醇直接提取、超高效液相色譜分離的方法測定維生素D，方法簡便、快捷、靈敏，準確度高，分析總周期大大縮短，適合批量化分析檢測，并用建立的方法對幾種市售維生素D保健食品和藥品進行了測定，取得較滿意的結(jié)果。

為考察茶多酚、大豆異黃酮及白藜蘆醇3種天然抗氧化劑對維生素D2穩(wěn)定性的影響，本研究應(yīng)用超高效液相色譜法分別測定白藜蘆醇、茶多酚及大豆異黃酮與維生素D2在 1 ∶[KG-3]1、10 ∶[KG-3]1、1 ∶[KG-3]10這3種質(zhì)量比例混合下，在4 ℃冷藏干燥條件下放置10、26、36 d后混合樣品中維生素D2的穩(wěn)定性變化，分析白藜蘆醇、茶多酚及大豆異黃酮對維生素D2穩(wěn)定性保護作用，最終旨在尋找天然維生素D2抗氧化穩(wěn)定劑，為維生素D2相關(guān)產(chǎn)品及制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters ACQUITY-UPLC-TQD）；Sartorius萬分之一電子天平（BSA224S-CW）；低速離心機（Eppendorf 5810 R）；超聲波清洗儀（KQ-500E）；240 mm玻璃干燥器；電熱恒溫水浴鍋（HWSY21-K）；冰箱（海爾BCD-278TAJ）。

1.2試劑

維生素D2（分析純，上海晶純有限公司），維生素D2標準品（SUPELCO，100 mg），無水乙醇為分析純，白藜蘆醇（98%，[JP3]陜西森弗生物技術(shù)有限公司），茶多酚（98%，陜西森弗生物技術(shù)有限公司），大豆異黃酮（98%，陜西森弗生物技術(shù)有限公司），變色硅膠（2.0～5.6 mm，山東青島裕寶精細化工有限公司）。

維生素D2標準儲備液 （100 μg/mL ）：準確稱取 0.010 0 g 維生素D2于 100 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度；維生素D2標準使用液：準確吸取維生素D2標準儲備液 10 mL于 100 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，該溶液濃度為10.0 μg/mL。

1.3樣品處理

將維生素D2與白藜蘆醇、茶多酚、大豆異黃酮3種抗氧化劑分別按照質(zhì)量比1 ∶[KG-3]10、1 ∶[KG-3]1、10 ∶[KG-3]1各稱取9份，置于 5 mL 塑料離心管中（樣品稱取質(zhì)量見表1），加入2 mL無水乙醇，40 ℃ 超聲30 min，置于恒溫水浴鍋中60 ℃揮干溶劑，所得樣品在冰箱4 ℃下置于24 mm干燥器中干燥保存（干燥器中加入變色硅膠）。分別于10、26、36 d后取出各處理3個重復(fù)樣品，在5 mL離心管中加入2 mL乙醇，40 ℃超聲 30 min，離心10 min（3 500 r/min），殘渣繼續(xù)加入2 mL乙醇，40 ℃超聲30 min，離心10 min（3 500 r/min）。合并上清液，離心10 min（3 500 r/min）。依次將1 ∶[KG-3]10樣品溶液稀釋20倍，1 ∶[KG-3]1樣品溶液稀釋100倍，10 ∶[KG-3]1樣品溶液稀釋200倍，維生素D2空白對照溶液稀釋100倍后，吸取上清液過 0.45 μm 膜，濾液直接進色譜系統(tǒng)分析。整個過程避光操作。每個處理3次重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1未添加天然抗氧化劑維生素D2穩(wěn)定性

未添加天然抗氧化劑的維生素D2穩(wěn)定性較差，經(jīng)處理后在 4 ℃ 冷藏干燥保存條件下，造成維生素D2大量損失，10、26、36 d的存留率分別為88.21%、68.32%、50.00%，且在0.05水平差異顯著，其中維生素D2在保存26、36 d的損失率高達3168%、50%（表2至表4）。

2.2以1 ∶[KG-3]1質(zhì)量比例添加3種天然抗氧化劑對維生素D2穩(wěn)定性影響

以1 ∶[KG-3]1質(zhì)量比例添加的3種天然抗氧化劑均對維生素D2穩(wěn)定性具有一定的保護作用，且隨著放置時間的延長，對維生素D2穩(wěn)定性的保護作用愈明顯。保存10 d測定結(jié)果表明，添加3種天然抗氧化劑后維生素D2的存留率均在90%以上，且三者之間在5%水平無顯著差異，三者與空白對照也無顯著差異。保存26 d測定結(jié)果表明，添加3種天然抗氧化劑后維生素D2的存留率均在73%以上，且三者在5%水平無顯著差異，其中添加茶多酚后維生素D2的存留率與空白對照保存26 d的存留率差異顯著，而添加大豆異黃酮和白藜蘆醇后維生素D2的存留率與空白對照的存留率均無顯著差異。保存36 d測定結(jié)果表明，添加3種天然抗氧化劑后維生素D2的存留率均在72%以上，三者之間在5%水平無顯著差異，但是均與空白對照保存36 d的存留率差異顯著，其中添加茶多酚后 36 d 維生素D2存留率與空白對照相比增加了58%（表2）。

對于茶多酚而言，保存10 d和26 d的存留率無顯著差異，保存10 d和36 d的存留率差異顯著，保存26 d和36 d的存留率也無顯著差異；對于大豆異黃酮和白藜蘆醇而言，保存10 d和26、36 d的存留率差異顯著，保存26 d與36 d的存留率無顯著差異（表2）。

3結(jié)論

未添加天然抗氧化劑的維生素D2穩(wěn)定性較差，經(jīng)處理后在4 ℃冷藏干燥保存條件下，造成維生素D2大量損失，10、26、36 d的存留率分別為88.21%、68.32%、50.00%；以 1 ∶[KG-3]1、1 ∶[KG-3]10、10 ∶[KG-3]1質(zhì)量比例添加的3種天然抗氧化劑均對維生素D2穩(wěn)定性具有一定的保護作用，且隨著放置時間的延長，其對維生素D2的穩(wěn)定性保護作用愈明顯。其中以1 ∶[KG-3]10質(zhì)量比例添加對維生素D2的穩(wěn)定性保護作用最佳，添加3種天然抗氧化劑36 d后維生素D2的存留率均超過84%，與空白對照相比增加了72.72%、68.08%、75.32%。

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