韓虎魁，何川，安閩生，金加發(fā)，張春偉，陳其軍

血清長(zhǎng)鏈非編碼脫氧核糖核酸KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1水平與冠狀動(dòng)脈病變的相關(guān)性研究

韓虎魁，何川，安閩生，金加發(fā)，張春偉，陳其軍

目的：探討檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼脫氧核糖核酸（RNA） KCNQ1 重疊轉(zhuǎn)錄物 1（KCNQ1OT1）在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。?患者血清中的表達(dá)及其臨床意義。

冠狀動(dòng)脈疾病；脫氧核糖核苷類

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:36.)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦枪跔顒?dòng)脈粥樣硬化改變后使冠狀動(dòng)脈狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟結(jié)構(gòu)及功能的改變[1,2]。既往研究表明P53基因在動(dòng)脈粥樣硬化的

發(fā)生過程中同樣發(fā)揮著非常重要的作用， P53的缺失能夠顯著加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，但其具體機(jī)制尚未完全闡明[3,4]。長(zhǎng)鏈非編碼脫氧核糖核酸（RNA）是一類長(zhǎng)度超過200 nt的非編碼RNA[5]。眾多研究結(jié)果提示在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA均有參與并發(fā)揮著重要作用，然而長(zhǎng)鏈非編碼RNA在心血管系統(tǒng)疾病中的作用尚不明確[6]。有研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA可以通過物理結(jié)合P53基因輔助活化子，作為P53通路中的一個(gè)重要組分參與到P53基因?qū)ο掠位虻恼{(diào)控中去。本研究旨在研究長(zhǎng)鏈非編碼RNAKCNQ1 重疊轉(zhuǎn)錄物1（KCNQ1OT1） 在冠心病患者血清中的表達(dá)及意義，進(jìn)一步揭示長(zhǎng)鏈非編碼RNA在心血管系統(tǒng)疾病中的作用及其可能的分子機(jī)制。

1 資料與方法

研究對(duì)象：選取2013-01至 2015-12期間在我院心內(nèi)科就診的患者196例，包括98例冠心病患者（冠心病組）和98例非冠心病患者為對(duì)照組。冠心病組:冠狀動(dòng)脈造影術(shù)顯示有1支以上狹窄≥75%的患者。其中男性58例,女性40例,年齡35～88歲,平均年齡（59.2±15.0）歲。對(duì)照組: 選擇同期就診、與冠心病組患者年齡、性別及基本情況相匹配的無冠心病患者。其中男性48例,女性50例,年齡32～85歲,平均年齡（57.8±13.1）歲。所有患者間無血緣關(guān)系。采集外周血液樣本同時(shí)收集臨床資料, 包括性別、年齡、是否患有高血壓、高脂血癥、糖尿病等。所有入選病例確診后即刻用含抗凝劑的紫色采血管采集靜脈血靜置于 4℃冷藏 30 min后，室溫下 3 000 r/min離心 15 min，留取上層血清，置于-80℃冰箱備用。所有患者均簽署知情同意書,經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

血清總RNA提?。簩⒎蛛x所得血清，置于冰上融化；取 250 μl 血清樣品，加入 750 μl Trizol液，振蕩器混勻，靜置 5 min；加入 200 μl氯仿，振蕩器混勻，靜置 10 min；室溫下12 000 r/min離心10 min，留取上清液并量取其體積，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無RNA酶（Rnase） 的 EP 管中；分別加入與上清液等體積的異丙醇，振蕩器振蕩混勻，室溫下靜置 3 min；室溫下12 000 r/min離心10 min；倒出管內(nèi)液體，加用 1 ml 75%乙醇；室溫 12 000 r/min 離心 2 min；倒出乙醇，并用 Tip 槍頭將剩余液體吸干凈，晾干。每管中加入 10 μl 無 Rnase 的 ddH2O，以能夠充分溶解 RNA；用分光光度計(jì)測(cè)定總 RNA 濃度及純度。

qRT-PCR分析長(zhǎng)鏈非編碼RNA KCNQ1OT1及P53基因的表達(dá)水平：提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，在 20 μl 體系中加 2 μg 總 RNA進(jìn)行互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）的合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 采用2×SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA 作為摸板，引物濃度 0.4 μmol/L，15 μl 體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置 3 個(gè)平行樣，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)合成相應(yīng)上下游引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH） 作為內(nèi)參照。KCNQ1OT1上游引物5’-CCCAGAAATCCACACCTC GG-3’； 下游引物5’-TCCTCAGTGAGCAGATGGAGA-3’；P53 上游引物5’- TACATGGGCCGAGGCAAGATAA-3’;下游引物5’- ATAGCCCAGGGAAGTG AAG GTGTC-3’PCR反應(yīng)在定量 PCR 反應(yīng)儀上進(jìn)行。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式 RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異比較采用t檢驗(yàn)，KCNQ1OT1與P53基因相關(guān)性分析采用線性回歸法，KCNQ1OT1與各臨床特征之間的關(guān)系使用Chi-Square檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較（表1）

兩組患者一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表1 兩組患者一般資料比較

表1 兩組患者一般資料比較

注：1 mmHg=0.133 kPa

?

2.2 兩組患者血清中KCNQ1OT1與P53基因表達(dá)的比較

與對(duì)照組比較，冠心病組患者血清KCNQ1OT1表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1A）；冠心病組患者中血清 P53基因表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1B）。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)分析兩組患者血清KCNQ1OT1及P53基因的表達(dá)（n=98）

2.3 兩組肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I （cTnI）、冠脈Genisis 評(píng)分的比較（表2）

冠心病組CK、CK-MB、cTnI、冠脈Gensini評(píng)分分值均高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 兩組患者CK 、 CK-MB、 cTnI、Genisis 評(píng)分的比較

表2 兩組患者CK 、 CK-MB、 cTnI、Genisis 評(píng)分的比較

注：CK：肌酸激酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶；cTnI：心肌肌鈣蛋白I

?

2.4 冠心病組患者血清KCNQ1OT1與P53基因表達(dá)的相關(guān)分析

線性相關(guān)分析98例冠心病患者血清KCNQ1OT1與P53基因表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果提示KCNQ1OT1與P53基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.856，P＜0.001，圖2）

圖2 冠心病組患者血清KCNQ1OT1與P53的相關(guān)性分析圖

2.5 單因素及多因素Logistic回歸分析（表 3）

以冠心病為因變量（有=1，無=0），以性別、年齡、吸煙、超重（BMI＞25 kg/m2）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、尿酸（UA）、甘油三脂（TG）、糖尿病、高血壓及血清KCNQ1OT1的表達(dá)為自變量，賦值后進(jìn)行單因素非條件 Logistic 回歸分析顯示，年齡、吸煙、糖尿病、高血壓、LDL-C、KCNQ1OT1表達(dá)、超重為冠心病的危險(xiǎn)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0 5）。

進(jìn)一步多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)年齡、吸煙、糖尿病、高血壓、LDL-C水平及血清KCNQ1OT1表達(dá)是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表4）。

表3 冠心病危險(xiǎn)因素的單因素Logistic回歸分析

表4 冠心病危險(xiǎn)因素的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清KCNQ1OT1診斷冠心病的受試者工作特征（ROC ） 曲線（圖3）

ROC曲線評(píng)價(jià)血清KCNQ1OT1表達(dá)與冠心病的診斷是否有價(jià)值，患者血清KCNQ1OT1表達(dá)的敏感性為72.16%，特異性79.95%。ROC 曲線下面積（AUC）= 0.917，95% 可信區(qū)間為1.373～2.282。

圖3 血清KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1表達(dá)對(duì)冠心病的診斷的受試者工作特征曲線圖

3 討論

目前對(duì)于冠心病的病因已有很多研究和假說，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究[9-11]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類不編碼蛋白，長(zhǎng)度超過200 nt的RNA，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、染色質(zhì)重塑及組蛋白修飾、調(diào)控剪接、形成內(nèi)源性SiRNA、與蛋白質(zhì)相互作用等8個(gè)方面的功能[12]。已有研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA在腫瘤的形成及發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。然而，長(zhǎng)鏈非編碼RNA在心血管系統(tǒng)疾病中的作用仍然尚不清楚[13,14]。近期研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)名為Braveheart（Bvht）的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，該長(zhǎng)鏈非編碼RNA與心肌細(xì)胞的維持和命運(yùn)高度相關(guān)[15]。還有研究報(bào)道了長(zhǎng) 鏈 非 編 碼 RNA- ANRIL（CDKN2BAS） 與冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)性高度相關(guān)[16,17]。盡管如此，長(zhǎng)鏈非編碼RNA在心血管系統(tǒng)疾病尤其是動(dòng)脈粥樣硬化中的作用和分子機(jī)制仍不十分明確。前期通過基因芯片發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA KCNQ1OT1在冠心病組患者血清中明顯高于正常對(duì)照組，提示長(zhǎng)鏈非編碼RNA KCNQ1OT1可能參與調(diào)節(jié)冠心病的發(fā)生、發(fā)展。

KCNQ1OT1是一個(gè)位于 KCNQ1 位點(diǎn)的長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 基因。印記基因是指僅一方親本來源的同源基因表達(dá),而來自另一親本的不表達(dá)。KCNQ1OT1是一個(gè)印跡基因，只表達(dá)父源等位基因，它的轉(zhuǎn)錄物調(diào)控位于 11 號(hào)染色體 p 端 15.5 位置著絲粒的印記基因簇的其他印跡基因父源拷貝的沉默[18,19]。印記基因的異常表達(dá)引發(fā)伴有復(fù)雜突變和表型缺陷的多種人類疾病，印記基因的異常同樣可誘發(fā)心血管疾病。但 KCNQ1OT1在冠心病患者中的具體作用，目前鮮有相關(guān)報(bào)道[20]。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，冠心病組患者血清KCNQ1OT1的表達(dá)明顯增高，P53基因在冠心病組患者血清中的表達(dá)水平明顯降低；血清KCNQ1OT1與P53基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系?；颊叩哪挲g、吸煙、糖尿病、高血壓、LDL-C水平及血清KCNQ1OT1的表達(dá)是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果提示冠心病患者血清KCNQ1OT1表達(dá)顯著增加, 可能是潛在的診斷和預(yù)測(cè)冠心病預(yù)后的血清標(biāo)志物，但由于臨床病例數(shù)有限，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量的研究及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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Correlation Study Between Serum Level of LncRNA KCNQ1OT1 Overlapping Transcript and Coronary Artery Lesion in Relevant Patients

HAN Hu-kui, HE Chuan, AN Min-sheng, JIN Jia-fa, ZHANG Chun-wei, CHEN Qi-jun.
Department Cardiology, Chengdu University Affiliated Hospital, Chengdu (610081), Sichuan, China Corresponding Author: HAN Hu-kui, Email: hanfukuimed@163.com

Objective: To investigate the serum expression of long non-coding RNA overlapping transcription content KCNQ1OT1 (KCNQ1) gene in patients with coronary artery disease (CAD) and its clinical significance.Methods: A total of 196 patients treated in our hospital were divided into 2 groups: CAD group and Control group, the patients were without CAD. n=98 in each group. Expression levels of serum KCNQ1OT1 and P53 were measured by quantitative RT-PCR; the relationship between KCNQ1OT1, P53 and clinical features in relevant patients were analyzed.Results: Compared with Control group, CAD group had increased expression of serum KCNQ1OT1 and decreased expression of P53, both P＜0.05. Correlation analysis revealed that the expression of KCNQ1OT1 was negatively related to P53 (r=-0.856, P＜0.001); multi Logistic regression analysis indicated that serum KCNQ1OT1 was independently related to CAD (P＜0.05).Conclusion: CAD patients had obviously increased serum level of KCNQ1OT1; KCNQ1OT1 was independently related to CAD occurrence.

Coronary artery disease; Deoxyribonucleosides

2016-04-23）

（編輯：常文靜）

610081 四川省成都市, 成都大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科

韓虎魁 碩士研究生 研究方向?yàn)楣谛牟“l(fā)生發(fā)展及治療 Email： hanfukuimed@163.com 通訊作者：韓虎魁

R54

A

1000-3614（2017）01-0036-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.01.009

方法：納入我院收治的196例患者, 98例冠心病患者為冠心病組, 98例非冠心病患者為對(duì)照組。用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)血清KCNQ1OT1及P53基因的表達(dá)水平, 分析KCNQ1OT1與血清P53基因表達(dá)水平及臨床病例特征的相關(guān)性。

結(jié)果：與對(duì)照組比較，冠心病組患者血清KCNQ1OT1的表達(dá)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。P53基因在冠心病組患者血清中的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)血清KCNQ1OT1與P53基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.856，P＜0.001 ）。多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)血清KCNQ1OT1的表達(dá)與冠心病存在獨(dú)立相關(guān)（P＜0.05）。

結(jié)論:冠心病患者血清KCNQ1OT1表達(dá)顯著增加, 并存在獨(dú)立相關(guān)。