安振華，王柳富，李晴

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

蝦青素對(duì)微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦的生長(zhǎng)、繁殖及免疫力的影響

安振華，王柳富，李晴

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

本文目的旨在研究蝦青素對(duì)微囊藻毒素MC-LR脅迫下（25μg/L）克氏原螯蝦的免疫力及生長(zhǎng)繁殖的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)四個(gè)梯度的飼料中蝦青素添加比例分別為（0、5、10、20mg/g）養(yǎng)殖周期持續(xù)8星期。結(jié)果表明蝦青素顯著提高了克氏原螯蝦肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）和堿性磷酸（AKP）的活力（P＜0.05）。5 g/kg蝦青素的添加量即可對(duì)SOD酶活具有明顯提升（P＜0.05）；10 g/kg的蝦青素添加量對(duì)AKP的提升最為明顯（P＜0.05）；研究還發(fā)現(xiàn)蝦青素可顯著提高微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦的存活率和特定生長(zhǎng)率（SGR）（P＜0.05），提高克氏原螯蝦雌蝦的抱卵量。研究表明蝦青素作為一種抗氧化劑適宜于在克氏原螯蝦飼料中添加，并且具有提高蝦體免疫活力，緩解微囊藻毒素MC-LR對(duì)蝦體氧化脅迫的作用。

MC-LR；克氏原螯蝦；免疫指標(biāo)；蝦青素

作為世界上散布最廣泛、最具侵略性的螯蝦[1]，克氏原螯蝦對(duì)極端環(huán)境有很強(qiáng)的耐受性，并且在水華經(jīng)常爆發(fā)的一些水域也很容易存活[2]。有研究表明克氏原螯蝦可以以微小藻類為食，且會(huì)在它們的器官內(nèi)蓄積藻毒素[3]。實(shí)地調(diào)查常發(fā)現(xiàn)，在含微囊藻毒素較多的水體中，克氏原螯蝦攝食雖然正常，但往往出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢的問題。

微囊藻毒素被認(rèn)為具有破壞生物體內(nèi)氧化還原平衡的能力,除了抑制磷酸酶致毒外，氧化應(yīng)激以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換在MC致毒機(jī)制中也起著很重要的作用。MC可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和脂質(zhì)過氧化，并有可能通過某些通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究表明微囊藻毒素在魚類和其他一些水生生物的器官或組織內(nèi)隨著時(shí)間的增加，其含量會(huì)逐漸降低[4]。一些研究的結(jié)果顯示MC-LR在水生生物體內(nèi)的蓄積和引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)主要發(fā)生在肝臟中[5]，卵巢次之[6]，也許這就是生長(zhǎng)于水華爆發(fā)的水體中的克氏原螯蝦繁殖力低的原因。

蝦青素（Astaxanthin），又名變胞藻黃素或蝦紅素，有著色、促進(jìn)生長(zhǎng)和增強(qiáng)免疫力的生物功能，并且是目前為止發(fā)現(xiàn)的抗氧化能力最強(qiáng)的物質(zhì)之一，能夠有效清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基的作用[7]。本項(xiàng)目期冀于研究在微囊藻毒素MC-LR脅迫下，通過飼料中添加蝦青素對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以探討蝦青素緩解微囊藻毒素MC-LR對(duì)克氏原螯蝦脅迫的機(jī)制，為克氏原螯蝦的高效、安全生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持和基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料來源

本次實(shí)驗(yàn)使用的克氏原螯蝦購自江蘇省揚(yáng)州市市場(chǎng)，原產(chǎn)于揚(yáng)州寶應(yīng)市，選附肢齊全、健康活潑、規(guī)格一致的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)蝦，并將其置于（15± 3）℃和自然光照環(huán)境中暫養(yǎng)一個(gè)月。飼料是由江蘇富裕達(dá)糧食制品有限公司生產(chǎn)的蝦用飼料，飼料成分表見表1。MC-LR購自北京伊普瑞斯科技有限公司，溶于純凈水后保存在冰箱內(nèi)，在使用時(shí)直接按比例添加到玻璃箱中。蝦青素購自福建日冕科技股份有限公司，為單粒500 mg規(guī)格膠囊狀保存（能值34.5 kJ/g），每粒含蝦青素60 mg，膠囊內(nèi)輔料為大豆油。使用時(shí)將膠囊刺破后與飼料混合拌勻。實(shí)驗(yàn)投喂的各組飼料中因蝦青素添加量不同造成的能值差異，通過額外補(bǔ)充等能值的大豆油來平衡。

表1 飼料的能值及生化組成

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)四個(gè)蝦青素添加梯度，飼料中蝦青素添加梯度分別為0、5、10、20 mg/g，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)共用蝦96只（20.6±7.5）g。每個(gè)重復(fù)設(shè)置為8只規(guī)格一致的克氏原螯蝦成蝦（4雌4雄，組間體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異），在溫室的玻璃水族箱中飼養(yǎng)（800 mm×600 mm×400 mm），微囊藻毒素的脅迫濃度25μg/L。同時(shí)設(shè)置一組水體中無MC-LR添加的空白組，空白組所投喂的飼料中無蝦青素添加。MC-LR購自北京伊普瑞斯科技有限公司，相關(guān)濃度測(cè)定使用北京金強(qiáng)環(huán)保公司ELISA試劑盒測(cè)定。

1.3 日常飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)前測(cè)定配制飼料的生化成分和能值。實(shí)驗(yàn)中每天在8：00與18：00分兩次投喂已配置好的餌料。飼養(yǎng)水溫用加熱棒控制在（15±3）℃。每天換水量保持在水族箱容積的1/3，溶氧量保持在4.0mg/ L以上。換水時(shí)調(diào)節(jié)好不同水族箱中的MC-LR毒素的濃度，使其濃度保持恒定在25μg/L。每天記錄測(cè)定攝食和抱卵情況。若有死蝦則及時(shí)揀出，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)量蝦體體長(zhǎng)、體質(zhì)量和懷卵量。

白鷲的速度比滑翔翼快著許多，沖在最前方的白鷲已然到達(dá)了戰(zhàn)場(chǎng)。它發(fā)出一聲狠厲的嘶鳴，身子向下俯沖，伸出鋼鉤一般的利爪，勾住了一條土狼的脊骨。它雙翅一振，帶著土狼沖天而起，飛到半空時(shí)，又松開利爪將土狼丟下。土狼驚恐地嚎叫著，重重摔在巖石上，叫聲戛然而止，它的身子也變成了軟趴趴的一坨爛肉。

1.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1免疫指標(biāo)的測(cè)定每個(gè)水族箱中隨機(jī)抽樣取出4個(gè)樣本，取出每個(gè)樣本的肝胰腺，將不同重復(fù)組的肝胰腺分別放入研磨器中加入6mL的蒸餾水，按水族箱的編號(hào)對(duì)每個(gè)研磨器進(jìn)行編號(hào)。將先研磨好的待測(cè)樣品插在冰盒里保存。取研磨好的樣品1.8 mL在型號(hào)為Centrifuge 5415R的離心機(jī)內(nèi)離心后取上清液進(jìn)行后續(xù)操作。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP）采用微量酶標(biāo)法，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase SOD）采用的是WST-1法，所用的酶活測(cè)試試劑盒均來自南京建成生物工程研究所，蛋白濃度采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定，測(cè)定酶標(biāo)儀型號(hào)為IMarkTM168-1130。

AKP=（測(cè)定OD值－空白OD值/標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.02mg/mL）÷待測(cè)樣品蛋白濃度（gprot/mL）

SOD抑制率=（（A對(duì)照－A對(duì)照空白）－（A測(cè)定－A測(cè)定空白））/（A對(duì)照－A對(duì)照空白）×100%

SOD活力=SOD抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)0.24 mL/0.02 mL÷待測(cè)樣本蛋白濃度（gprot/ mL）。

1.4.2生長(zhǎng)繁殖的測(cè)定①繁殖力：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)計(jì)算克氏原螯蝦的抱卵量。②特定生長(zhǎng)率（Special growth rate SGR）SGR=（lnY2-lnY1）/t×100%，式中Y1、Y2分別表示實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)克氏原螯蝦的體質(zhì)量。③存活率：存活率=終末存活尾數(shù)/初始存活尾數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

由圖1可見，添加蝦青素可顯著提高脅迫組克氏原螯蝦肝臟中SOD的活力，其中5 g/kg蝦青素的添加量對(duì)SOD的提升最為顯著。10 g/kg以下的蝦青素添加量使得脅迫組的SOD活力遠(yuǎn)大于未脅迫組并且SOD的活力隨著蝦青素的增加而增強(qiáng)。20 g/kg蝦青素的添加量時(shí)SOD活力明顯下降。

由圖2可見，10 g/kg以上蝦青素的添加量對(duì)脅迫組AKP活力提升最為明顯，且遠(yuǎn)超未脅迫組AKP的活力，總體而言，添加蝦青素的脅迫組AKP活力均大于未脅迫組。

2.2 蝦青素對(duì)微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦生長(zhǎng)繁殖的影響

由表2可見，脅迫下克氏原螯蝦的繁殖力低于未脅迫組，但隨著蝦青素的添加，脅迫組的平均抱卵量和相對(duì)抱卵量都呈持續(xù)上升的態(tài)勢(shì)。

圖1 蝦青素對(duì)微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦體內(nèi)SOD的影響

圖2 蝦青素對(duì)微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦體內(nèi)AKP的影響

2.3 蝦青素對(duì)微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦特定生長(zhǎng)率、成活率和餌料系數(shù)的影響

由表3可見蝦青素的添加對(duì)脅迫組的特定生長(zhǎng)率、成活率影響顯著，添加量在10 g/kg時(shí)對(duì)SGR最大，且10 g/kg以上時(shí)，脅迫組的SGR大于未脅迫組。同時(shí)，蝦青素的添加顯著提高了脅迫組的成活率，由表3可看出20 g/kg的添加量時(shí)，脅迫組的成活率達(dá)到最大，但均未超過未脅迫組，且對(duì)餌料系數(shù)的影響不明顯。

3 討論

3.1 蝦青素對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)發(fā)育的影響

在促進(jìn)生長(zhǎng)方面，呂玉華[8]等的研究表明，蝦青素能使羅氏沼蝦的質(zhì)量增長(zhǎng)率顯著提高14.48%，Petit[9]等發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加蝦青素可縮短日本囊對(duì)蝦的蛻皮周期，促進(jìn)生長(zhǎng)。此外Medina[10]報(bào)道，當(dāng)凡納濱對(duì)蝦仔蝦在低鹽度海水中生活時(shí)，投喂80 mg/ kg的蝦青素降低了蝦的呼吸代謝水平。這說明，蝦青素能使低鹽度脅迫的凡納濱對(duì)蝦降低了能量消耗，促進(jìn)對(duì)蝦的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中蝦青素的添加不僅提高了克氏原螯蝦的特定生長(zhǎng)率，同時(shí)提高了其存活率和繁殖力，這說明蝦青素不僅可以緩解微囊藻毒素MC-LR造成的機(jī)體氧化應(yīng)激，同時(shí)可以緩解其在克氏原螯蝦體中的積累，尤其是在其蓄積的主要的靶器官-卵巢[6]中的積累?？紤]到微囊藻毒素MC-LR的廣泛存在，通過在飼料中添加一定量的蝦青素，可能對(duì)提高養(yǎng)殖池塘中克氏原螯蝦的出苗量有一定幫助。

表2 蝦青素對(duì)微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦繁殖力的影響

3.2 蝦青素對(duì)克氏原螯蝦免疫力的影響

現(xiàn)有研究證實(shí)生物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)[如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GPS）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）]活性的降低，將會(huì)削弱機(jī)體的抗氧化防御能力[11]，從而影響生物正常的生長(zhǎng)和呼吸功能，降低生長(zhǎng)速度和免疫力[12]。而抗氧化劑（如N-乙酰半胱氨酸、硒等）可通過減少ROS生成和降低丙二醛（MDA）水平、保護(hù)抗氧化酶的活性，減輕細(xì)胞骨架破壞，從而有效預(yù)防和對(duì)抗微囊藻毒素引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而蝦青素也正是這樣一種具有提高機(jī)體抗氧化系統(tǒng)活力，減輕氧化應(yīng)激的物質(zhì)，蝦青素同樣具有增強(qiáng)生物體對(duì)外界環(huán)境應(yīng)激抵抗力的能力。

謝劍華[13]等在日本沼蝦研究中發(fā)現(xiàn)：蝦青素可提高日本沼蝦的免疫力。溫為康[14]等通過對(duì)飼料中添加蝦青素，發(fā)現(xiàn)蝦青素能顯著提高斑節(jié)對(duì)蝦的酚氧化酶活力，其活力隨蝦青素的添加量緩慢上升，160mg/kg是略有下降，蝦青素激活了酚氧化酶原系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)蝦青素的添加除了可以提高酚氧化酶活力外，也相應(yīng)的提高了AKP和SOD的活力。這說明飼料中蝦青素的添加激活并提高了克氏原螯蝦體細(xì)胞內(nèi)的整體抗氧化能力，提高了克氏原螯蝦機(jī)體免疫力。

Chien等[15]通過對(duì)墨吉對(duì)蝦幼體飼喂含蝦青素（80mg/kg）的飼料，然后將這些對(duì)蝦置入急劇變化的環(huán)境中（鹽度從32降到0或溫度從27℃降到5℃）持續(xù)5min，再分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組（80mg/kg組）和對(duì)照組（0添加組）蝦體的平均恢復(fù)率。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)率為對(duì)照組的1.17倍。另外還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中熱應(yīng)激對(duì)蝦恢復(fù)率的影響遠(yuǎn)大于滲透壓的影響，表明蝦青素可以增強(qiáng)墨吉對(duì)蝦對(duì)外界應(yīng)激的抵抗能力。在本實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)一定量的蝦青素添加可以幫助克氏原螯蝦抵抗微囊藻毒素MC-LR帶來的氧化應(yīng)激，由此可見提高水生生物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)活力對(duì)微囊藻毒素MC-LR引起的氧化脅迫具有一定的緩解作用，這為通過添加蝦青素緩解微囊藻毒素MC-LR對(duì)克氏原螯蝦造成的氧化脅迫提供了重要的理論依據(jù)。

[1]Gherardi F，Holdich D M.Crayfish in Europe as alien species：how tomake the best of a bad situation[M].Rotterdam：A.A.Balkema，1999.

[2]Gherardi F，Lazzara L.Effects of the density of an invasive crayfish（Procambarusclarkii）on a pelagic and surface microalgae in a Mediterranean wetland[J].Archives of Hydrobiology，2006（165）:401-414.

[3]Vasconcelos V，Oliveira S，Teles F O.Impact of a toxic and non-toxic strain ofMicrocystis aeruginosa crayfishProcambarus clarkii[J].Toxicon，2001（39）：1461-1470.

[4]Smith J L，Haney JF.Food web transfer，accumulation，and depuration of microcystins，a cyanobacterial toxin，in pumpkinseed sunfish（Lepomisgibbosus）[J].Toxicon，2006（48）：580-589.

[5]Huang C H，Chang R J，Huang SL，etal.Dietary vitamin E supp lementation affects tissue lipid per oxidation of hybrid tilapia.Oreochromisniloticus×O.aureus[J].Comp.Biochemistry and Physiology.Part B，2003（134）：265-270.

[6]An Zhenuua，Sun Longsheng，Wang Ping.Acute toxicity and accumulation of m icrocystin-leucine-arginine in the crayfishProcambarusclarkii（Girard，1852）[J].Crustaceana，2015，88（4）：397-404.

[7]裴凌鵬，董?；?蝦青素改善H2O2對(duì)成骨細(xì)胞損傷的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2007，13（8）：585-587.

[8]呂玉華，金征宇，徐學(xué)明.飼料中添加法夫酵母對(duì)羅氏沼蝦的體色及生長(zhǎng)狀況的影響[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，1999（4）：15-18. [9]Petit H，Ngre-sadargues G，Castillo R，et al.The effects of dietary astaxanthin on growth and molting cycle of post larval stages of the prawn，Penaeusjaponicus（Crustacea，Decapoda）[J].Comp.Biochem Physiol.，1997（117）：539-544.

[10]Medina Z R.Metabolismo Respiratorio En Juveniles deLitopenaeusvannamei[M].Mexico：CIC ESE，2006.

[11]Prieto A L，Piehardo S，Jos A，etal.Time dependentoxidative stress responses after acute exposure to toxic cyanobacterial cells containing microcystins in tilapia fish（Oreochromis niloticus）under laboratory conditions[J].Aquat Toxicol.，2007，84（3）：337-345.

[12]Racotta I S，Palacios E，Mendez L.Metabolic responses to short and long-term exposure to hypoxia in white shrimp（Penaeusvannamei）[J].Mar Fresh Behav Physiol.，2002（35）：269-275.

[13]謝劍華，管越強(qiáng)，王靜波.蝦青素對(duì)日本沼蝦血細(xì)胞密度及吞噬活力的影響[J].河北漁業(yè)，2008，169（1）：8-11.

[14]溫為庚，林黑著，吳開暢，等.飼料中添加蝦青素對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦生長(zhǎng)和免疫指標(biāo)的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，50（3）：144-146.

[15]Chien Y H，Pan C H，Hunter B.The Resistance to Physical Stresses byPenaeusmonodonJuveniles Fed Diets Supp lemented with Astaxanthin[J].Aquaculture，2003（216）：177-191.

The effects of astaxanthin on imm unity，reproduction of Procambarus clarkii under M icrocystin-LR stress

An Zhenhua，Wang Liufu，LiQing
（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

This research aimed to study the effects of astaxanthin on immunity，reproduction of Procambarus clarkii undermicrocystin-LR（MC-LR）stress.The Procambarus clarkii were cultured under MC-LR stress（25 ug/L）and were fed with fodders containing astaxanthin（0，5，10，20 g/kg）for 8 weeks in glass tanks（800mm× 600 mm×400 mm）.The results showed that astaxanthin can significantly improve the activity of superoxide dismutase（SOD）and alkaline phosphatase（AKP）in liver of Procambarus clarkii（P＜0.05）.Astaxanthin can significantly improve the survival rate and specific growth rate（SGR）of Procambarus clarkii under MC-LR stress（P＜0.05）.The 10 g/kg contentof astaxanthin in fodder can be a practical and economic choice.

MC-LR；Procambarus clarkii；immune index；astaxanthin

Q175

：A

：1004-2091（2017）01-0030-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.01.007

2016-04-24）

江蘇省水產(chǎn)三新工程（Y2015-28）

安振華（1981-），男，講師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物生理.E-mail:anzhenhua@yzu.edu.cn