馮一璐，傅曉斌，吳帆，崔宏春，李紅亮

（1中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018；2杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，杭州 310024）

茶尺蠖信息素結(jié)合蛋白PBP2的基因克隆、原核表達(dá)及其結(jié)合功能

馮一璐1，傅曉斌1，吳帆1，崔宏春2，李紅亮1

（1中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018；2杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，杭州 310024）

【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中國茶區(qū)主要的鱗翅目害蟲，其幼蟲暴食性常給茶園帶來巨大損失。鱗翅目昆蟲雌雄個體間普遍存在著性信息素通訊環(huán)節(jié)，而茶尺蠖性信息素識別途徑一直鮮有報(bào)道。論文旨在通過對茶尺蠖性信息素識別過程中的結(jié)合蛋白基因進(jìn)行鑒定和功能研究，為茶尺蠖性信息素化學(xué)通訊和嗅覺信息識別傳遞機(jī)制提供理論依據(jù)。【方法】利用RT-PCR技術(shù)對從雄蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中首次鑒定和發(fā)現(xiàn)的一個茶尺蠖信息素結(jié)合蛋白基因(pheromone-binding protein, PBP)2 (EoblPBP2)進(jìn)行全長 cDNA序列克?。℅enBank登錄號為KX421383）后，將該基因與pET32a載體連接構(gòu)建表達(dá)載體。隨后向?qū)雙ET32a/EoblPBP2表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)中對其表達(dá)載體加入終濃度1 mmol·L-1的IPTG進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步利用鎳NTA瓊脂糖凝膠柱和含有咪唑的上清緩沖液分離目的蛋白，以PBS緩沖液作為透析液純化得到高濃度重組蛋白。最后通過熒光競爭法，利用 N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine，1-NPN）作為熒光報(bào)告子以放大熒光信號，隨后向重組蛋白與1-NPN混合體系中分別加入(Z, Z, Z)-3, 6, 9-十八碳三烯以及10種測試氣味后經(jīng)過分子熒光光度計(jì)掃描得到相對熒光值，計(jì)算各配基的解離常數(shù)KD，研究重組蛋白與茶尺蠖性信息素和茶樹揮發(fā)物的生理功能?！窘Y(jié)果】EoblPBP2全長為492 bp，編碼了163個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為15.9 kD，等電點(diǎn)為4.983，具有保守的6個半胱氨酸，根據(jù)分子進(jìn)化樹分析其應(yīng)歸屬于昆蟲PBPs家族。結(jié)合功能結(jié)果顯示，10種測試氣味均能將1-NPN與茶尺蠖EoblPBP2重組蛋白的混合體系于420 nm處的相對熒光值降至50%以下。其中β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、苯乙醛、癸醛和反-2-癸烯醛等5種茶樹揮發(fā)物質(zhì)與EoblPBP2重組蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng)，解離常數(shù)KD分別為7.923、14.830、30.368、28.068和 27.597 μmol·L-1。而性信息素成分之一的(Z, Z, Z)-3, 6, 9-十八碳三烯與EoblPBP2的解離常數(shù)KD僅為172.591 μmol·L-1，僅小于苯甲醇的解離常數(shù)KD230.880 μmol·L-1，而遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于上述5種氣味物質(zhì)。表明EoblPBP2重組蛋白具有茶尺蠖性信息素成分（(Z, Z, Z)-3, 6, 9-十八碳三烯）和植物揮發(fā)物質(zhì)廣譜結(jié)合能力，而其與性信息素的親和力弱于大部分測試植物揮發(fā)物?！窘Y(jié)論】EoblPBP2能與包括性信息素成分在內(nèi)的多種植物揮發(fā)物結(jié)合，可能是一種具備特殊復(fù)合功能的信息素結(jié)合蛋白，可用之進(jìn)一步研究茶尺蠖的性信息素識別和傳遞途徑。

茶尺蠖；信息素結(jié)合蛋白；原核表達(dá)；性信息素與茶樹揮發(fā)物質(zhì)；結(jié)合特征

0 引言

【研究意義】昆蟲在漫長的自然繁衍進(jìn)程中，逐漸衍變出了復(fù)雜的信息感受機(jī)制來對外界環(huán)境作出響應(yīng)，使其在取食、交配、產(chǎn)卵等多種行為中占據(jù)有利形勢，從而能夠生存下來并保持其自身種群的順利繁衍[1]，昆蟲通過各種信息素來傳遞種間或種內(nèi)信息，因此信息素對昆蟲的集合、防御、覓食、產(chǎn)卵、交配等行為起到調(diào)控作用[2]。其中作為雌雄昆蟲性行為的微量調(diào)控物質(zhì)[3]，昆蟲性信息素又稱性外激素，一般為雌蟲性腺釋放，雄性通過嗅覺感受和識別[4]，因此在雌雄成蟲之間的求偶和交配行為中發(fā)揮著重要的作用[5]。雄蟲對這種性信息素的響應(yīng)主要依賴其嗅覺器官（如觸角）上的嗅覺感受器以及其內(nèi)部相應(yīng)的識別蛋白，因此研究其感受器內(nèi)受體蛋白與性信息素的特異識別和結(jié)合關(guān)系，對于深入探討昆蟲性信息素的信息傳遞和規(guī)律具有重要的理論意義。【前人研究進(jìn)展】昆蟲嗅覺感受器的淋巴液中含有兩種水溶性球蛋白：氣味結(jié)合蛋白（odorant-binding proteins，OBPs）和化學(xué)感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）[6]，其中OBPs根據(jù)功能差異又主要分為信息素結(jié)合蛋白（pheromone binding proteins，PBPs）和普通氣味結(jié)合蛋白（general odorant binding proteins，GOBPs）[7]，GOBPs一般認(rèn)為主要與普通的氣味分子識別有關(guān)，而PBPs是VOGT等[8]于1981年首先在雄性多音大蠶蛾（Antheraea polyphemus）觸角中發(fā)現(xiàn)的一種能夠特異結(jié)合雌性釋放的性信息素蛋白；其結(jié)合過程一般認(rèn)為PBPs先與脂溶性的性信息素小分子結(jié)合，隨后運(yùn)輸至特異的嗅覺神經(jīng)元信息素嗅覺受體（pheromone receptors，PRs），PRs被激活后，觸發(fā)神經(jīng)元引發(fā)神經(jīng)沖動繼而引發(fā)嗅覺反應(yīng)，隨后信息素分子被感器支持細(xì)胞或感器淋巴腔中的氣味降解酶降解[9]。鱗翅目昆蟲中廣泛存在著性信息素，典型的如馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus）的（順，反）-5, 7-十二碳雙烯基乙酸酯（(Z, E)-5, 7-dodecadieny acetate）、家蠶（Bombyx mori）的（反，順）-8, 10-十六碳雙烯-1-醇（(E, Z)-8, 10-Hexadecam-1-ol）以及棉紅鈴蟲（Pectinophora gossypiella）（順，反）-11-十六碳雙烯乙酸酯（(Z, E)-11-hexadecadieny1 acetate）[10]等，利用這些信息素可通過開發(fā)性誘劑來誘捕雄蟲，以達(dá)到生態(tài)防控的目的。中國是世界茶樹栽培和茶葉生產(chǎn)的主要國家之一，同時茶產(chǎn)業(yè)也在中國經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)業(yè)中重要地位。茶尺蠖（Ectropis obliqua）是危害茶樹的主要害蟲之一，其幼蟲以茶葉為食，若幼蟲危害十分嚴(yán)重時，有可能造成茶樹嫩芽以及茶葉絕收，影響茶葉的質(zhì)量以及產(chǎn)量，對茶葉生產(chǎn)帶來巨大損失[11]。目前茶尺蠖的防治方法基本仍以化學(xué)防治為主，但隨著茶尺蠖逐漸產(chǎn)生的抗藥性，使化學(xué)防治效果越來越差，同時也對茶樹和生態(tài)環(huán)境帶來嚴(yán)重污染[12]。由于雌性鱗翅目昆蟲廣泛存在著性信息素，因此可以將其設(shè)計(jì)成誘芯來引誘和毒殺雄蛾[13]。茶尺蠖性信息素已于20世紀(jì)末由中國科學(xué)家完成了分離、鑒定以及人工合成，如(Z, Z, Z)-3, 6, 9-十八碳三烯(Z, Z, Z)-3, 6, 9-octadecatriene、(Z, Z)-6, 7-環(huán)氧-3, 9-十八碳二烯(Z, Z)-6, 7-epoxy-(Z, Z)-3, 9-octadecadien、(Z, Z, Z)-3, 6, 9-二十二碳三烯(Z, Z, Z)-3, 6, 9-docosatriene和(Z, Z, Z)-3, 6, 9-二十四碳三烯(Z, Z, Z)-3, 6, 9-teracosatriene等[14-15]。但無論是室內(nèi)生物測定，還是茶園試驗(yàn)，引誘率均不是特別理想，故一直未能在茶園得到有效地推廣[16]，其中一個關(guān)鍵難題是茶尺蠖所屬的尺蛾科盡管是鱗翅目中最大的科之一，但是與鱗翅目其他科害蟲的性信息素為單一成分不同的是，尺蛾科的性信息素為多元成分的混合物組成，由于其由多雙鍵體系的化學(xué)結(jié)構(gòu)和多元混合成分組成，各種成分的作用的生物學(xué)意義很難以通過實(shí)驗(yàn)來判斷，從而阻礙了茶尺蠖性信息素的應(yīng)用和推廣[17]。【本研究切入點(diǎn)】因此，通過研究茶尺蠖性信息素的識別和傳遞途徑的解析，其對茶尺蠖性信息素的各種可能成分進(jìn)行梳理和篩選，是最終實(shí)現(xiàn)茶尺蠖性信息素田間成功利用的新思路?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以前期筆者實(shí)驗(yàn)室從茶尺蠖雄蟲觸角中提取的cDNA為模板，克隆得到EoblPBP2目的基因，成功實(shí)現(xiàn)原核表達(dá)后，利用純化后獲得的EoblPBP2重組蛋白，結(jié)合競爭性熒光光譜技術(shù)探究茶尺蠖 EoblPBP2與茶樹揮發(fā)物以及性信息素的結(jié)合譜，為系統(tǒng)研究茶尺蠖的性信息素識別途徑機(jī)理提供理論支持。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015—2016年在中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料與主要試劑

茶尺蠖雄蟲觸角 cDNA為實(shí)驗(yàn)室前期保存?zhèn)溆肹18]。主要試劑為鎳NTA瓊脂糖凝膠柱、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、IPTG、尿素、氨芐青霉素和EDTA等均購于生工生物工程（上海）股份有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；N-苯基-1-萘胺（N-phenyl -1-naphthylamine，1-NPN）購于TCI公司（純度＞97%）；茶樹揮發(fā)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品購于上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司（純度均＞95%）；茶尺蠖主要性信息素成分(Z, Z, Z)-3, 6, 9-十八碳三烯購自漳州市英格爾農(nóng)業(yè)科技有限公司。由于茶尺蠖性信息素成分為長鏈烯烴，疏水性強(qiáng)而不溶于水和醇類，因此以正己烷作為溶劑進(jìn)行稀釋，其他配基則均以甲醇稀釋。pMD18-T載體、T4 DNA Ligase、DNA marker、限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I購自TaKaRa公司。pET32a(+)載體以及感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)均為筆者實(shí)驗(yàn)室自行制備保存。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 茶尺蠖EoblPBP2基因克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建

以實(shí)驗(yàn)室前期得到的茶尺蠖雄蟲觸角cDNA為模板[18]TAC-3′為上游引物，CCAAGACTTCAG-3′為下游引物進(jìn)行PBP2的基因擴(kuò)增。最終得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將目的分子量位置的明亮條帶割膠回收，與pMD18-T克隆載體在 16℃的反應(yīng)條件下連接過夜。經(jīng)菌液 PCR鑒定后進(jìn)行測序。測序成功的pMD18-T/EoblPBP2質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-32a(+)經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、Xho I進(jìn)行雙酶切，37℃反應(yīng)1 h。經(jīng)計(jì)算后，將載體片段與目的片段以1﹕3的摩爾比加入到PCR管中，16℃連接30 min。將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，鑒定為陽性的克隆送于上海桑尼公司測序。

1.3 茶尺蠖 EoblPBP2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將測序驗(yàn)證后的pET32a/EoblPBP2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（Escherichia coli）BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在氨芐抗性的 LB培養(yǎng)基平板中挑選單菌落，并進(jìn)行 PCR驗(yàn)證。挑選陽性克隆菌按 1﹕100（V/W）的比例接種于10 mL氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中。翌日以 1﹕50（V/W）的比例將過夜活化的菌液接種至200 mL LB培養(yǎng)基中（含50 μg·mL-1氨芐青霉素），搖床振蕩培養(yǎng)3 h左右利用紫外分光光度計(jì)檢測OD值。當(dāng)OD600值達(dá)到0.8左右時，取1 mL菌液作為對照，向剩余菌液中加入IPTG使其終濃度達(dá)到1 mmol·L-1，12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測目的蛋白所處的位置是上清或包涵體以此確定重組蛋白的表達(dá)形式。將確定表達(dá)形式的液體全部移至鎳NTA瓊脂糖凝膠柱，用含有不同濃度咪唑的上清緩沖液洗脫，并用SDS-PAGE檢測并確定目的蛋白所在洗脫管。將含有 EoblPBP2重組蛋白的洗脫液全部轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，在 PBS緩沖液（pH 7.4）中4℃透析72 h，將最終得到的重組蛋白利用酶標(biāo)儀測定濃度，并以PBS緩沖液稀釋至終濃度為1 μmol·L-1。

1.4 茶尺蠖EoblPBP2重組蛋白的配基結(jié)合試驗(yàn)

用島津 RF-5301 PC分子熒光光度計(jì)測試EoblPBP2重組蛋白和1-NPN相互作用以確定1-NPN能否作為熒光競爭試驗(yàn)的報(bào)告子。取3 mL 1 μmol·L-1的 EoblPBP2重組蛋白溶液于石英比色皿中。掃描時激發(fā)波長設(shè)定為290 nm，發(fā)射與激發(fā)狹縫為5 nm，逐次加入1 mmol·L-1的1-NPN溶液，每次反應(yīng)2 min，并進(jìn)行光譜掃描，直至隨著1-NPN的加入，EoblPBP2重組蛋白熒光強(qiáng)度不再上升，記錄此時1-NPN的濃度以及熒光強(qiáng)度。根據(jù)Scatchard方程進(jìn)行線性化光譜數(shù)據(jù)[19]。

式中，[Dt]為EoblPBP2重組蛋白與1-NPN混合體系中加入的1-NPN總濃度，[D]為體系中未結(jié)合的1-NPN濃度，K為EoblPBP2重組蛋白與1-NPN的結(jié)合常數(shù)，n為EoblPBP2重組蛋白與1-NPN的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，[Pt]為試驗(yàn)中EoblPBP2重組蛋白的濃度。

采用1-NPN作為熒光報(bào)告子，掃描時激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射與激發(fā)狹縫分別為5 nm，逐次向1-NPN與 EoblPBP2重組蛋白混合液中加入濃度為 10 mmol·L-1的茶樹揮發(fā)物質(zhì)以及性信息素，充分反應(yīng) 2 min，記錄相應(yīng)的熒光發(fā)射光譜與熒光強(qiáng)度，并利用公式（2）計(jì)算每種配基的解離常數(shù)[20]。

式中，KD為各種配基的解離常數(shù)，[IC50]為1-NPN熒光強(qiáng)度降至 50%時加入的各配基的濃度，[1-NPN]為反應(yīng)平衡時體系中游離的 1-NPN的濃度，K1-NPN為EoblPBP2重組蛋白與1-NPN進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)時的解離常數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 茶尺蠖EoblPBP2序列分析

EoblPBP2的測序結(jié)果已提交至NCBI注冊，序列號為KX421383。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的EoblPBP2全長如圖1所示。其氨基酸序列顯示于核苷酸序列下方。茶尺蠖PBP2基因全長492 bp，其可編碼163個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為15.9 kD，等電點(diǎn)為4.983，其中含有6個保守的半胱氨酸（Cys）（圖1圓圈標(biāo)注）。其氨基酸殘基中含有16個帶正電的氨基酸，24個帶負(fù)電的氨基酸，48個疏水性氨基酸，28個極性氨基酸。利用SignalP 4.1預(yù)測EoblPBP2蛋白的信號肽，發(fā)現(xiàn)其含有明顯的信號肽（圖1長框標(biāo)注），信號肽切割位點(diǎn)位于多肽鏈 N端第 21與 22位氨基酸（VQS-SQ）之間。

圖1 EoblPBP2核酸序列及其氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequence of EoblPBP2

利用Mega 7.0軟件[21]的鄰接法（neighbour-joining，NJ）對 EoblPBP2氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建（圖2）。進(jìn)化樹結(jié)果表明，EoblPBP2與桑青尺蠖（Ascotis selenaria cretacea）PBP2的親緣關(guān)系最近，與其余昆蟲的PBPs或OBPs親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。且與EoblPBP2親緣關(guān)系較近的序列幾乎均為PBPs，由此可以明確EoblPBP2為茶尺蠖PBPs家族成員。

圖2 EoblPBP2與其他昆蟲氣味結(jié)合蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（鄰接法）Fig.2 The neighbor-joining (NJ) tree of EoblPBP2 with odorant-binding proteins from other insect species

2.2 茶尺蠖EoblPBP2重組蛋白的表達(dá)以及分離純化

對含有 pET32/EoblPBP2重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌 BL21（DE3）菌株進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)，結(jié)果表明，EoblPBP2重組蛋白在上清（泳道3）與包涵體（泳道4）中均有表達(dá)，因此采用上清進(jìn)行蛋白的純化分離。將上清液全部移至鎳 NTA瓊脂糖凝膠柱，用含有不同濃度咪唑的上清緩沖液洗脫雜蛋白。泳道10為純化后的重組蛋白（圖3）。

2.3 茶尺蠖EoblPBP2重組蛋白配基結(jié)合試驗(yàn)

圖4為隨1-NPN濃度的增加，EoblPBP2重組蛋白在420 nm處的熒光強(qiáng)度多項(xiàng)式曲線擬合圖，其相關(guān)系數(shù)為0.9970。根據(jù)Scatchard方程對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸處理，得到的線性擬合相關(guān)系數(shù)為0.9846，相關(guān)性較好，通過計(jì)算可得1-NPN的解離常數(shù)K1-NPN為5.24 μmol·L-1，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為0.9340。由此可證明1-NPN與EoblPBP2重組蛋白結(jié)合良好，能夠作為后續(xù)EoblPBP2熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)的報(bào)告子。

圖3 EoblPBP2重組蛋白的分離純化Fig. 3 Separation and purification of recombinant protein EoblPBP2

圖4 EoblPBP2重組蛋白與1-NPN的結(jié)合曲線Fig. 4 Binding curve of EoblPBP2 recombinant protein and 1-NPN

圖5 配基與EoblPBP2重組蛋白和1-NPN的競爭結(jié)合曲線Fig. 5 Competition and bound of ligands with 1-NPN and recombinant protein EoblPBP2

選擇9種茶樹揮發(fā)物質(zhì)[18,22]和1種茶尺蠖性信息素進(jìn)行熒光競爭性結(jié)合試驗(yàn)。將1-NPN作為熒光報(bào)告子，逐次向1-NPN與EoblPBP2蛋白混合液中加入10 mmol·L-1的配基，充分反應(yīng)2 min，掃描時激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射與激發(fā)狹縫為5 nm。結(jié)果如圖5所示，10種配基均能將1-NPN與茶尺蠖EoblPBP2重組蛋白的混合體系于420 nm處的相對熒光值降至50%以下。其中，鄰苯二甲酸二丁酯、苯乙醛、β-紫羅蘭酮、癸醛、反-2-癸烯醛與EoblPBP2重組蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng)。5種茶樹揮發(fā)物中，β-紫羅蘭酮的結(jié)合能力最強(qiáng)，其解離常數(shù)KD值為7.923 μmol·L-1，其次為鄰苯二甲酸二丁酯，KD值為14.830 μmol·L-1。茶尺蠖性信息素成分之一的(Z, Z, Z)-3, 6, 9-十八碳三烯雖能使相對熒光強(qiáng)度降至50%，但是其[IC50]濃度以及解離常數(shù)均大于上述5種物質(zhì)，其與EoblPBP2重組蛋白的結(jié)合能力較這 5種物質(zhì)弱。10種配基的[IC50]濃度與解離常數(shù)見表1。

3 討論

本研究以前期從茶尺蠖觸角中提取的總 RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到了一個茶尺蠖PBP2基因。該基因全長492 bp，編碼163個氨基酸。熒光競爭性結(jié)合試驗(yàn)表明，10種配基均能將1-NPN與茶尺蠖EoblPBP2重組蛋白的混合體系于420 nm處的相對熒光值降至50%以下，鄰苯二甲酸二丁酯、苯乙醛、β-紫羅蘭酮、癸醛與反-2-癸烯醛和 EoblPBP2重組蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng)，解離常數(shù)KD均＜31 μmol·L-1。5種茶樹揮發(fā)物中，β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯和反-2-癸烯醛的結(jié)合能力最強(qiáng)（KD值分別為 7.923、14.830和 27.597 μmol·L-1），這與筆者實(shí)驗(yàn)室前期對茶尺蠖 GOBP2與茶樹揮發(fā)物的結(jié)合研究[18]結(jié)果一致。上述配基中，β-紫羅蘭酮是一種與多種昆蟲PBPs[23]、GOBPs[24]與 CSPs[25]均有較強(qiáng)結(jié)合能力的氣味分子，其結(jié)合的普遍性于茶尺蠖防治研究并沒有指導(dǎo)作用。這種普遍性是否與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)將有待進(jìn)一步的分子對接研究分析；而鄰苯二甲酸二丁酯與反-2-癸烯醛在茶樹揮發(fā)物質(zhì)種的相對含量都較低（≤1%）[23]，因此推斷鄰苯二甲酸二丁酯以及反-2-癸烯醛與茶尺蠖OBPs家族蛋白的這種高親合力似乎具有普遍性，但是有關(guān)這兩種配基在茶尺蠖嗅覺系統(tǒng)中的具體作用仍有待進(jìn)一步研究，而根據(jù)其他已報(bào)道的配基與蛋白結(jié)合的分子對接結(jié)果[26]可以推測鄰苯二甲酸二丁酯、反-2-癸烯醛與PBP2之間應(yīng)該有強(qiáng)烈的氫鍵以及疏水結(jié)合位點(diǎn)，從分子進(jìn)化分析來看，EoblPBP2應(yīng)屬于昆蟲性信息素結(jié)合蛋白PBPs家族成員（圖2），而EoblPBP2在最近報(bào)道的茶尺蠖足轉(zhuǎn)錄組的基因中也被證實(shí)屬于茶尺蠖PBPs家族（EoblPBP1-4）成員[27]。

表1 配基與EoblPBP2重組蛋白和1-NPN的熒光競爭試驗(yàn)Table 1 Competition and bound of ligands with 1-NPN and recombinant protein EoblPBP2

昆蟲PBPs蛋白一般而言是一類具有特異識別昆蟲性信息素的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[27-28]，因此理論上也應(yīng)與茶尺蠖性信息素具有較特異的結(jié)合能力，但從EoblPBP2與各種測試化學(xué)物質(zhì)的結(jié)合譜來看（表1），茶尺蠖性信息素成分之一的(Z, Z, Z)-3, 6, 9-十八碳三烯雖能與EoblPBP2產(chǎn)生一定程度的結(jié)合（KD值達(dá)到172.591 μmol·L-1），但其親和力較上述5種揮發(fā)物質(zhì)弱。同時這種結(jié)合譜又有別于茶尺蠖的另外一種GOBPs（茶樹揮發(fā)物與EoblPBP2的親和力普遍弱于EoblGOBP2[18]）的配基結(jié)合功能，說明EoblPBP2可能并非是一種典型的PBPs蛋白，這種情況與桃蛀螟Cpun-PBP1有所類似，即Cpun-PBP1與植物揮發(fā)物（莰烯）的結(jié)合能力也高于兩種性信息素組分（順-10-十六碳烯醛、十六醛）[29]。另外，本研究采用的熒光配基結(jié)合試驗(yàn)為水相體系，由于性信息素成分不溶于水（本試驗(yàn)以正己烷作為溶劑），因此是否是此原因?qū)е缕渑cEoblPBP2結(jié)合力低有待進(jìn)一步證實(shí)。除此之外，由于昆蟲PBPs家族還存在其他成員[30-31]，也有可能那些具有典型的性信息素結(jié)合功能的茶尺蠖PBPs尚未鑒定出來，亦或盡管(Z, Z, Z)-3, 6, 9-十八碳三烯是主要的茶尺蠖性信息素成分[32]，但由于茶尺蠖性信息素存在多元情況[14-15]，因此那些未測試的茶尺蠖性信息素成分是否能與 EoblPBP2或其他PBPs成員產(chǎn)生更特異的給合等，均有待進(jìn)一步測試與研究。

4 結(jié)論

EoblPBP2為茶尺蠖性信息素結(jié)合蛋白PBPs家族功能研究的第一個成員。由于尺蛾科性信息素的復(fù)雜性和特殊性，EoblPBP2也顯示了能與包括性信息素成分在內(nèi)的多種配基結(jié)合的能力，表明其是一種具備特殊復(fù)合功能的信息素結(jié)合蛋白，至于是否存在茶尺蠖性信息素特異結(jié)合的PBP蛋白，仍需進(jìn)一步研究。

[1] PILPEL Y, LANCET D. Olfaction: Good reception in fruitfly antennae. Nature, 1999, 398(6725): 285-287.

[2] 劉孟英. 昆蟲信息素與害蟲綜合治理. 中國科學(xué)院院刊, 1986(2): 160-163.

LIU M Y. Insect pheromone and integrated pest management. Bulletin of Chinese Academy of Sciences, 1986(2): 160-163. (in Chinese)

[3] KARLSON P, LüSCHER M. ‘Pheromones’: a new term for a class of biologically active substances. Nature, 1959, 183(4653): 55-56.

[4] 薛艷花, 陸俊嬌. 昆蟲性信息素生物學(xué)研究與應(yīng)用進(jìn)展. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(4): 80-83.

XUE Y H, LU J J. Progress of biology study and application of the sex pheromone of insect. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2009, 37(4): 80-83. (in Chinese)

[5] CARDé R T, BAKER T C. Sexual communication with pheromones// Chemical Ecology of Insects. Springer, 1984: 355-383.

[6] PELOSI P, ZHOU J J, BAN L, CALVELLO M. Soluble proteins in insect chemical communication. Cellular and Molecular Life Sciences, 2006, 63(14): 1658-1676.

[7] PELOSI P, MAIDA R. Odorant-binding proteins in insects. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 1995, 111(3): 503-514.

[8] VOGT R, RIDDIFORD L M. Pheromone binding and inactivation by moth antennae. Nature, 1981, 293: 161-163.

[9] DEISIG N, KROPF J, VITECEK S, PEVERGNE D, ROUYAR A, SANDOZ J C, LUCAS P, GADENNE C, ANTON S, BARROZO R. Differential interactions of sex pheromone and plant odour in the olfactory pathway of a male moth. PLoS ONE, 2012, 7(3): e33159.

[10] 孟憲佐. 我國昆蟲信息素研究與應(yīng)用的進(jìn)展. 昆蟲知識, 2000, 37(2): 75-84.

MENG X Z. Advances in research and application of insect pheromone in China. Entomological Knowledge, 2000, 37(2): 75-84. (in Chinese)

[11] 楊云秋, 宛曉春, 鄭高云, 高旭暉. 茶尺蠖性行為習(xí)性初報(bào). 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2008, 24(2): 339-342.

YANG Y Q, WAN X C, ZHENG G Y, GAO X H. Preliminary study on the habit of sex behavior of Ectropis obliqua Prout. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2008, 24(2): 339-342. (in Chinese)

[12] 朱蔚, 袁爭, 張亮, 高旭暉. 茶尺蠖綜合治理技術(shù)研究進(jìn)展. 福建茶葉, 2011, 33(6): 11-15.

ZHU W, YUAN Z, ZHANG L, GAO X H. Research progress on the comprehensive management of the tea geometrid. Fujian Tea, 2011, 33(6): 11-15. (in Chinese)

[13] 楊培迪, 高思青, 寧靜, 禹利君. 茶尺蠖生物防治研究進(jìn)展. 茶葉科學(xué)技術(shù), 2009(1): 4-7.

YANG P D, GAO S Q, NING J, YU L J. Research progress on biological control of tea geometrid. Tea Science and Technology, 2009(1): 4-7. (in Chinese)

[14] 劉天麟, 李正名, 羅志強(qiáng), 蔣益民, 么恩云. 茶尺蠖性信息素幾種活性成分的合成. 南開大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)), 1994(1): 82-86.

LIU T L, LI Z M, LUO Z Q, JIANG Y M, ME E Y. Synthesis of some bioactive components on ectropic oblique sex pheromone. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Nankaiensis, 1994(1): 82-86. (in Chinese)

[15] 么恩云, 李正名, 羅志強(qiáng), 尚稚珍, 殷坤山, 洪北邊. 茶尺蠖性信息素化學(xué)結(jié)構(gòu)研究初報(bào). 自然科學(xué)進(jìn)展, 1991, 1(5): 452-454.

ME E Y, LI Z M, LUO Z Q, SHANG Z Z, YIN K S, HONG B B. The chemical structure of the initial report of tea geometrid information. Progress in Natural Science, 1991, 1(5): 452-454. (in Chinese)

[16] 殷坤山, 洪北邊, 尚稚珍, 么恩云, 李正名. 茶尺蠖性信息素生物學(xué)綜合研究. 自然科學(xué)進(jìn)展, 1993, 3(4): 332-338.

YIN K S, HONG B B, SHANG Z Z, ME E Y, LI Z M. Comprehensive study on the biology of sex pheromones. Progress in Natural Science, 1993, 3(4): 332-338. (in Chinese)

[17] LIN M J, YE S, XIONG Y, CAI D W, ZHANG J M, HU Y Y. Expression and characterization of RNA-dependent RNA polymerase of Ectropis obliqua virus. BMB Reports, 2010, 43(4): 284-290.

[18] 趙磊, 崔宏春, 張林雅, 陳玲, 余繼忠, 李紅亮. 茶尺蠖普通氣味結(jié)合蛋白 EoblGOBP2與茶樹揮發(fā)物的結(jié)合功能研究. 茶葉科學(xué), 2014, 34(2): 165-171.

ZHAO L, CUI H C, ZHANG L Y, CHEN L, YU J Z, LI H L. Molecular binding characterization with tea plant volatiles of a general odorant-binding protein EoblGOBP2 in the tea geometrid, Ectropis oblique Prout (Lepidoptera: Geometridae). Journal of Tea Science, 2014, 34(2): 165-171. (in Chinese)

[19] 范成平, 商志才, 郭明, 俞慶森. 熒光法研究加替沙星與牛乳鐵蛋白的相互結(jié)合作用. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào) (理學(xué)版), 2005, 32(1): 62-65.

FAN C P, SHANG Z C, GUO M, YU Q S. Study on the interaction between gatifloxacin and bovine lactoferrin by fluorescence spectrophotometry. Journal of Zhejiang University (Science Edition), 2005, 32(1): 62-65. (in Chinese)

[20] CHOU T C. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies. Pharmacological Reviews, 2006, 58(3): 621-681.

[21] KUMAR S, STECHER G, TAMURA K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution, 2016, 33(7): 1870-1874.

[22] 黃安平, 韓寶瑜, 包小村. 茶刺蛾危害后茶樹揮發(fā)性有機(jī)化合物釋放變化. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2011,17(6): 819-823.

HUANG A P, HAN B Y, BAO X C. Change in volatile organic compounds from Camellia sinensis (L.) O. Kuntze damaged by Iragoides fasciata Moore (Lepidoptera: Eucleidae). Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2011, 17(6): 819-823. (in Chinese)

[23] 翁琛, 張林雅, 趙磊, 付余霞, 羅晨, 李紅亮. 中華蜜蜂性信息素結(jié)合蛋白ASP1的原核表達(dá)及配基結(jié)合特性分析. 昆蟲學(xué)報(bào), 2013, 56(10): 1110-1116.

WENG C, ZHANG L Y, ZHAO L, FU Y X, LUO C, LI H L. Prokaryotic expression and ligand binding characteristics of pheromone binding protein ASP1 in the Chinese honeybee (Apis cerana cerana). Acta Entomologica Sinica, 2013, 56(10): 1110-1116. (in Chinese)

[24] 吳帆, 黃君君, 譚靜, 唐明珠, 李紅亮. 中華蜜蜂信息素結(jié)合蛋白OBP10 的基因克隆, 原核表達(dá)和配基結(jié)合特性分析. 昆蟲學(xué)報(bào), 2016, 59(1): 25-32.

WU F, HUANG J J, TAN J, TANG M Z, LI H L. Molecular cloning, prokaryotic expression and ligand-binding characterization of a novel pheromone binding protein OBP10 in Apis cerana cerana (Hymenoptera: Apidae). Acta Entomologica Sinica, 2016, 59(1): 25-32. (in Chinese)

[25] 張萌, 吳帆, 王然, 馮一璐, 羅晨, 李紅亮. 光譜分析 Q型煙粉虱化學(xué)感受蛋白 CSP1與 β-紫羅蘭酮的相互作用. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2016, 43(1): 62-69.

ZHANG M, WU F, WANG R, FENG Y L, LUO C, LI H L. Spectroscopic analysis of the interaction between β-ionone and chemosensory protein 1 (CSP1) in Bemisia tabaci biotype Q. Journal of Plant Protection, 2016, 43(1): 62-69. (in Chinese)

[26] MA L, LI Z Q, BIAN L, CAI X M, LUO Z X, ZHANG Y J, CHEN ZM. Identification and comparative study of chemosensory genes related to host selection by legs transcriptome analysis in the tea geometrid Ectropis obliqua. PLoS ONE, 2016, 11(3): e0149591.

[27] LIU N Y, HE P, DONG S L. Binding properties of pheromonebinding protein 1 from the common cutworm Spodoptera litura. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology, 2012, 161(4): 295-302.

[28] XU W, XU X, LEAL W S, AMES J B. Extrusion of the C-terminal helix in navel orangeworm moth pheromone-binding protein (AtraPBP1) controls pheromone binding. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2011, 404(1): 335-338.

[29] 賈小儉, 郝少東, 杜艷麗, 張民照, 覃曉春, 王進(jìn)忠, 王海香, 冀衛(wèi)榮. 桃蛀螟性信息素結(jié)合蛋白Cpun-PBP1的cDNA克隆、表達(dá)譜及其配體化合物的結(jié)合特性分析. 昆蟲學(xué)報(bào), 2015, 58(11): 1167-1176.

JIA X J, HAO S D, DU L Y, ZHANG M Z, QIN X C, WANG J Z, WANG H X, JI W R. cDNA cloning, expression profiling and binding affinity assay of the pheromone binding protein Cpun-PBP1 in the yellow peach moth, Conogethes punctiferalis (Lepidoptera: Crambidae). Acta Entomologica Sinica, 2015, 58(11): 1167-1176. (in Chinese)

[30] SONG Y Q, DONG J F, QIAO H L, WU J X. Molecular characterization, expression patterns and binding properties of two pheromone-binding proteins from the oriental fruit moth, Grapholita molesta (Busck). Journal of Integrative Agriculture, 2014, 13(12): 2709-2720.

[31] GU S H, ZHOU J J, WANG G R, ZHANG Y J, GUO Y Y. Sex pheromone recognition and immunolocalization of three pheromone binding proteins in the black cutworm moth Agrotis ipsilon. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2013, 43(3): 237-251.

[32] MA T, XIAO Q, YU Y G, WANG C, ZHU C Q, SUN Z H, CHEN X Y, WEN X J. Analysis of tea geometrid (Ectropis grisescens) pheromone gland extracts using GC-EAD and GC×GC/TOFMS. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 64(16): 3161-3166.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Molecular Cloning, Prokaryotic Expression and Binding Functions of Pheromone Binding Protein 2 (PBP2) in the Ectropis obliqua

FENG YiLu1, FU XiaoBin1, WU Fan1, CUI HongChun2, LI HongLiang1
(1College of Life Science, China Jiliang University/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine, Hangzhou 310018;2Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310024)

【Objective】The larva of tea geometrid (Ectropis oblique) is a major Lepidoptera pest in tea plantation, which cancause enormous economic losses every year due to its violent foraging to tea leaves. Although pheromone communication is widely involved in the process of courtship of male moths towards females, the intrinsic pheromone cognitive mechanism has not been figured out yet in tea geometrid. This experiment aims to provide a theoretical basis of chemical communication and olfactory cognition and transportation for E. oblique, by means of the molecular characterization and functions for the binding protein involved in the process of sex pheromone cognition. 【Method】A pheromone binding protein gene, EoblPBP2, was amplified and cloned by RT-PCR (GenBank number KX421383), and then subcloned into pET32a vector. Then the recombinant plasmid pET32a/EoblPBP2 was transformed into E. coli BL21 (DE3) and induced to express recombinant protein with IPTG at the concentration of 1 mmol·L-1. Furthermore, the protein was separated by Ni2+-NTA agarose FF and bacterial supernatant buffer solution. The purified recombinant protein was purified by PBS buffer solution. Finally, for the investigation of molecular binding functions of EoblPBP2 with test ligands, the fluorescence competitive assay was applied to measure the binding profile of EoblPBP2 recombinant protein with tea geometrid sex pheromone and candidate tea leaves volatiles. With the help of the fluorescence reporter N-phenyl-1-naphthylamine (1-NPN), the binding constants of EoblPBP2 protein binding with the candidate ligands, including a sex pheromone component (Z, Z, Z)-3, 6, 9-octadecatriene and 10 plant volatiles molecules, were measured and calculated. 【Result】EoblPBP2 has 492 base pairs, encodes 163 amino acid residues with 6 conservative cysteines. The relative molecular mass is 15.9 kD and the isoelectric point is 4.983. The fluorescence experiment results indicated that there were 10 volatiles could quench relative fluorescence intensity below 50% of 1-NPN and EoblPBP2 recombinant protein complex system. Meanwhile, 5 tea volatiles, dibutyl phthalate, phenyl acetaldehyde, β-ionone, decanal, and trans-2-decenal exhibit strong binding affinity (the dissociation constant KDis 7.923, 14.830, 30.368, 28.068, and 27.597 μmol·L-1, respectively) with the EoblPBP2 recombinant protein. While the dissociation constant KDof (Z, Z, Z)-3, 6, 9-octadecatriene is only 172.591 μmol·L-1, which was evidently weaker than the candidate plant volatiles except for benzyl alcohol (the dissociation constants KDis 230.880 μmol·L-1).【Conclusion】 It was concluded that EoblPBP2 may be a PBP protein with complex biological functions, due to the multiple binding capability with test sex pheromones and plant volatiles. This study will be helpful for the further elucidation of the sex pheromone recognition and transportation in tea geometrid.

Ectropis obliqua; pheromone binding protein; prokaryotic expression; sex pheromone and tea plant volatiles; binding characteristics

2016-09-19；接受日期：2016-11-14

國家自然科學(xué)基金（31272053，31372254）、浙江省自然科學(xué)基金（LY13C140004）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-23）

聯(lián)系方式：馮一璐，E-mail：fengyilu1994@163.com。通信作者李紅亮，E-mail：hlli@cjlu.edu.cn