王慧，張海娟，李志東

（臨沂大學藥學院，山東臨沂 276000）

忍冬藤提取物對兔離體腸平滑肌的舒張作用及其機制

王慧，張海娟，李志東

（臨沂大學藥學院，山東臨沂 276000）

【目的】胃腸平滑肌過度收縮可引起腹痛腹瀉等臨床常見的疾病。目前，臨床上對治療胃腸平滑肌過度收縮的藥物主要以西藥為主，如鈣離子通道阻斷藥硝苯地平和抗膽堿藥阿托品等，硝苯地平長期使用可引起負性肌力和負性傳導的現象，而阿托品由于其不良反應較大，在臨床應用中受到一定的限制。因此，開發(fā)具有有效防治胃腸平滑肌痙攣、低毒、低殘留的天然中草藥意義重大。試驗以兔離體小腸平滑肌為研究對象，利用豐富的忍冬藤資源，研究忍冬藤提取物對兔離體小腸平滑肌收縮的影響，并探討其作用機制?！痉椒ā坎捎猛秒x體小腸平滑肌試驗，應用BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)，觀察忍冬藤提取物對正常狀態(tài)下兔離體小腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響；進而使用工具藥乙酰膽堿、組胺和氯化鋇致兔小腸痙攣性收縮后，觀察忍冬藤提取物對其痙攣性收縮的影響；為研究忍冬藤提取物抑制兔離體小腸平滑肌收縮的作用機制，應用 IP3受體阻斷劑肝素(HP)、肌漿網 ryanodine受體阻斷劑釕紅(RR)和一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)，探明忍冬藤提取物對兔離體小腸平滑肌作用的機制。【結果】忍冬藤提取物可濃度依賴性抑制兔離體小腸平滑肌自發(fā)性收縮，藥物濃度在7.5 g·L-1時可顯著抑制兔離體小腸平滑肌收縮的頻率(P＜0.05)，藥物濃度在5g·L-1時可極顯著抑制兔離體小腸平滑肌收縮的振幅(P＜0.05)；工具藥乙酰膽堿、組胺和氯化鋇可顯著誘導兔小腸平滑肌收縮的振幅，忍冬藤提取物可顯著抑制由乙酰膽堿、組胺和氯化鋇誘導的兔離體小腸平滑肌收縮的頻率(P＜0.05)，可極顯著抑制兔離體小腸平滑肌收縮的振幅(P＜0.01)。IP3受體阻斷劑肝素能增強忍冬藤提取物舒張兔離體小腸平滑肌收縮的作用(P＜0.01)，而肌漿網ryanodine受體阻斷劑釕紅對忍冬藤提取物舒張兔小腸平滑肌的作用無明顯影響(P＞0.05)。左旋硝基精氨酸甲酯能夠部分阻斷忍冬藤提取物舒張兔離體小腸平滑肌收縮的作用(P＜0.01)?！窘Y論】忍冬藤提取物可顯著抑制兔離體小腸平滑肌收縮的頻率和振幅，其機制可能與增加一氧化氮濃度，抑制IP3受體介導的內鈣釋放有關，但對肌漿網ryanodine受體途徑引起的內鈣釋放無關。

忍冬藤提取物；兔；小腸平滑?。烩}離子；一氧化氮

0 引言

【研究意義】仔豬腹瀉因具有發(fā)病率高、死亡快的特點，在養(yǎng)豬業(yè)危害中居首位[1]。當由胃腸平滑肌運動異常引起的仔豬功能性腹瀉時，應使用調節(jié)腸管運動的藥物，如阿托品、胃復安等，隨著該類藥物在臨床上出現的諸多副作用[2-5]，天然中草藥在胃腸道疾病的應用中日漸顯著。在獸醫(yī)臨床中忍冬藤常被用于急性細菌性痢疾和胃腸炎等病癥[6-8]，但其確切療效及作用機制尚不明確。因此，進行忍冬藤對兔腸平滑肌運動的作用及機制研究，為該藥在獸醫(yī)臨床中的應用提供堅實的理論基礎?！厩叭搜芯窟M展】一般在醫(yī)藥上將金銀花的干燥莖枝稱為忍冬藤[9]，和金銀花一樣具有抗菌消炎、清熱解毒和止腸固痢的作用?！侗静菥V目》記載：“忍冬，莖葉及花，功用皆同”。 現代研究證明，忍冬藤與金銀花具有相近的化學成分和藥理活性[10]。2003 年非典爆發(fā)流行時金銀花每千克高達百元以上，而忍冬藤一直沒有被重視利用[11]。宋士軍等報道，金銀花提取液對兔小腸平滑肌運動具有顯著抑制作用，其作用機制可能是激動β受體，抑制肌漿網釋放鈣離子和細胞外鈣離子進入細胞內有關[12]。作為和金銀花藥性相似、價格低廉、來源豐富的忍冬藤對動物胃腸道的調節(jié)作用及機理研究鮮見報道，使其在防治畜禽消化道疾病的應用中受到一定限制?！颈狙芯壳腥朦c】忍冬藤可以單方或復方出現用于治療消化道疾病，但其作用機制不明確。課題組前期研究表明，將忍冬藤粉碎后添加到仔豬飼料中，可有效防治仔豬腹瀉的發(fā)生，其作用機制可能與抑制動物胃腸道運動有關。鑒于此，本試驗采用BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)，研究忍冬藤提取物對兔小腸平滑肌運動的影響，并使用不同工具藥探明忍冬藤對動物胃腸平滑肌調控的機制。【擬解決的關鍵問題】開發(fā)忍冬藤的藥用資源，探明忍冬藤對動物胃腸道運動的調控機制，為該藥在防治動物消化道疾病的應用中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

本試驗于2013年4月至2013年10月在臨沂大學藥學院山東省魯南中藥材資源開發(fā)工程技術研究中心藥理學實驗室完成。

1.2 材料

1.2.1 藥品及來源 忍冬藤提取物不自制，原料由山東省平邑縣九間棚農業(yè)科技園忍冬藤種植基地提供；氯化鋇（批號：20080410，上海山浦化工有限公司）；乙酰膽堿（批號：15917，Acros ）；組胺（批號：H7125，Sigma ）；肝素（heparin, HP 批號：H0200000，Sigma）；釕紅（ruthenium red, RR 批號：SC-202328，Santan cruz）；左旋硝基精氨酸甲酯（nitro-L-arginine methylester , L-NAME 批號：N5751，Sigma）。

1.2.2 儀器及試劑 BL-420E生物信號采集系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；JH-2型張力傳感器（中國北京航天醫(yī)學工程研究所產品）；水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）；臺氏液（g·L-1）：NaCl 8. 0, CaCl20.2, KCl 0.2, MgCl20.1, NaHCO31.0, KH2PO40.05, 葡萄糖1.0。

1.2.3 試驗動物 選擇同批次新西蘭大白兔30只，雌雄各半，體重在（2.5±0.4）kg，購自山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 忍冬藤提取物制備 準確稱取忍冬藤50 g，加入15倍體積的15%乙醇，浸泡30 min。之后加熱至沸騰，煎煮3次，每次煎煮1 h，紗布過濾合并煎煮液。將煎煮液減壓濃縮至20—30 mL，稱量體積，加入乙醇，使含醇量達60 %。靜置24 h后，過濾，濾液繼續(xù)減壓濃縮至無醇味，收集濾液后冷凍干燥備用。

1.3.2 兔離體小腸平滑肌標本的制備 取健康家兔，禁食24 h 后，用木槌猛擊兔頭枕部致死。迅速沿腹中線打開腹腔，每只兔取十二指腸同一腸段放入盛有混合氣體的飽和臺式液中，洗凈腸內容物。將其剪成2—3 cm 的腸段作為實驗標本。

1.3.3 腸管收縮活動的記錄 打開 BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)，調零，定標，在一通道輸入接口處安裝張力換能器。調節(jié)恒溫平滑肌槽，使水溫保持在（37±0.5）℃，將臺式液加入預管內，藥物管加入16 mL臺氏液。將標本一端固定于L型通氣鉤上，另一端連接張力換能器，持續(xù)通入混合氣體（96% O2，4% CO2），每秒1—2個氣泡，溫度在37 ℃，標準負荷1 g，平衡1 h，待腸管運動穩(wěn)定后，開始進行試驗。

1.3.4 忍冬藤提取物對小腸平滑肌自主性收縮的影響待腸管收縮穩(wěn)定后, 累計加入忍冬藤提取物，使終濃度分別為2.5、5、7.5、10、12.5 g·L-1，加藥間隔時間為 5 min，對照組加入等量生理鹽水，觀察忍冬藤提取物對家兔小腸自發(fā)性收縮的影響。記錄忍冬藤提取物各濃度對小腸自發(fā)性收縮的頻率和振幅，并計算抑制率。

頻率抑制率（%）=（給藥前平均頻率- 給藥后平均頻率）/給藥前平均頻率×100%

振幅抑制率（%）=（給藥前平均振幅- 給藥后平均振幅）/給藥前平均振幅×100%

1.3.5 忍冬藤提取物對激動劑（乙酰膽堿、組胺、氯化鋇）所致腸痙攣性收縮的影響 隨機分為 4組（n=5），乙酰膽堿+忍冬藤組、組胺+忍冬藤組、氯化鋇+忍冬藤組、生理鹽水+忍冬藤組。待腸管收縮穩(wěn)定后, 各組分別給予乙酰膽堿（1 μmol·L-1）、組胺（5 mg·L-1）、氯化鋇（10 mg·L-1），對照組加入等量生理鹽水，描記腸肌收縮的運動曲線，再加入忍冬藤提取物10 g·L-1，記錄加入忍冬藤后收縮活動的頻率和振幅，計算抑制率。

1.3.6 HP、RR 和L-NAME預處理腸肌后對忍冬藤提取物舒張腸肌運動的影響 隨機分為4組（n=6），HP +忍冬藤組、RR +忍冬藤組、L-NAME+忍冬藤組、生理鹽水+忍冬藤組。待腸管收縮穩(wěn)定后, 各組分別給予HP（50 mg·L-1）、RR（10 μmol·L-1）、L-NAME（100 μmol·L-1），孵育15 min后，加入忍冬藤提取物10 g·L-1，對照組加入等量生理鹽水，記錄加入忍冬藤前后收縮活動的頻率和振幅，計算抑制率。

2 結果

2.1 忍冬藤提取物對兔離體腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響

2.5 —12.5 g·L-1忍冬藤能劑量依賴性抑制兔小腸平滑肌收縮，忍冬藤在較低濃度時對腸肌收縮的頻率和振幅均無影響，隨著藥物濃度的增加，對腸肌收縮的抑制作用增強，與對照組相比，藥物濃度在7.5 g·L-1以上時對腸肌收縮的頻率抑制率具有顯著差異（P＜0.05），藥物濃度在5 g·L-1以上時對振幅抑制率具有顯著差異（P＜0.05，圖1）。

2.2 忍冬藤對乙酰膽堿、組胺、BaCl2誘導腸肌收縮后的影響

2.2.1 忍冬藤對乙酰膽堿誘導腸平滑肌收縮的抑制作用 1 μmol·L-1乙酰膽堿可明顯增強腸平滑肌運動波形，使腸肌收縮振幅增加（27.5 ± 2.5）%，與對照組相比，具有極顯著差異（P＜0.01），但對收縮頻率無影響。加入 10 g·L-1的忍冬藤后，可明顯降低乙酰膽堿誘導的腸肌運動波形，并對收縮頻率的抑制具有顯著差異（P＜0.05）；對收縮振幅的抑制具有極顯著差異（P＜0.01, 圖2）。

2.2.2 忍冬藤對組胺誘導腸平滑肌收縮的抑制作用 5 mg·L-1組胺可明顯增強腸平滑肌運動波形，使收縮振幅增加（11 ± 1）%，與對照組相比，具有顯著差異（P＜0.05），對收縮頻率無影響。10 g·L-1忍冬藤對組胺誘導的腸平滑肌運動的波形具有抑制作用，對收縮頻率具有顯著抑制作用（P＜0.05），對收縮振幅具有極顯著抑制作用（P＜0.01，圖3）。

圖1 忍冬藤對兔小腸平滑肌運動的影響Fig.1 Effect of the C. lonicerae on intestinal smooth muscle motility

圖2 忍冬藤對乙酰膽堿誘導的腸平滑肌收縮的影響Fig. 2 Effect of C. lonicerae on intestinal smooth muscle contractions induced by acetylcholine

2.2.3 忍冬藤對BaCl2誘導腸平滑肌收縮的抑制作用10 mg·L-1BaCl2可明顯增強腸平滑肌運動波形，使腸平滑肌收縮頻率增加 8%，振幅增加14%，與對照組相比，BaCl2對收縮振幅的增強具有極顯著差異（P＜0.01）。10 g·L-1忍冬藤可顯著抑制由BaCl2誘導的腸肌收縮的頻率和振幅（圖4）。

圖3 忍冬藤對組胺誘導的腸平滑肌收縮的影響Fig.3 Effect of C. lonicerae on intestinal smooth muscle contractions induced by histamine

圖4 忍冬藤對氯化鋇誘導的腸平滑肌收縮的影響Fig.4 Effect of C. lonicerae on intestinal smooth muscle contractions induced by BaCl2

2.3 HP、RR、L-NAME預處理對忍冬藤舒張腸平滑肌的影響

10 g·L-1忍冬藤可顯著抑制腸平滑肌收縮的頻率和振幅，50 mg·L-1的 IP3受體阻斷劑肝素（heparin, HP）預孵育后，可增強忍冬藤舒張腸平滑肌的作用，對腸平滑肌收縮頻率由（76±3）%減為44.5%（P＜0.01，圖5）。

與忍冬藤比較，肌漿網 ryanodine受體阻斷劑RR（10 μmol·L-1）預孵育后對忍冬藤舒張腸平滑肌的作用無明顯影響（P＞0.05，圖6）。一氧化氮合酶抑制劑L-NAME（100 μmol·L-1）預孵育后，可極顯著增加忍冬藤舒張腸平滑肌運動的振幅（ P＜0.01，圖7）。

3 討論

胃腸平滑肌痙攣可引起腹痛、腹瀉等臨床常見的疾病。研究表明，胃腸平滑肌上主要存在某些受體（M膽堿能受體、組胺受體和 5-HT受體等）和離子通道（鈣離子通道、鉀離子通道和鈉離子通道）[13-15]。神經遞質乙酰膽堿主要通過突觸后膜的兩大受體系統(tǒng)發(fā)揮其生理作用，即煙堿型受體（N受體）和毒蕈堿型受體（M受體），其中廣泛分布于胃腸平滑肌，并對其具有調控作用的為M膽堿能受體。乙酰膽堿激動M受體，可使細胞內第二信使三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG）濃度上升，進而引起細胞內鈣離子釋放，濃度增加而產生收縮反應[16]。組胺可作用于分布在胃腸平滑肌上的H1受體，以打開細胞膜上允許Na+，K+，Ca2+通透的離子通道，導致細胞膜去極化，進而使電壓依賴性鈣通道開放，胞內游離鈣離子濃度增高，從而引起胃腸平滑肌收縮[17]。氯化鋇可通過直接刺激胃腸粘膜，引起胃腸平滑肌細胞內鈣離子釋放誘導收縮[18]。本試驗結果表明，忍冬藤提取物能濃度依賴性抑制腸平滑肌的自發(fā)性收縮，并顯著抑制由乙酰膽堿、組胺和氯化鋇誘導的腸平滑肌痙攣性收縮。

圖5 肝素對忍冬藤抑制腸平滑肌收縮的影響Fig.5 Effect of HP on intestinal smooth muscle contractions inhibited by C. lonicerae

圖6 釕紅對忍冬藤抑制腸平滑肌收縮的影響Fig. 6 Effect of RR on intestinal smooth muscle contractions inhibited by C. lonicerae

圖7 L-NAME對忍冬藤抑制腸平滑肌收縮的影響Fig. 7 Effect of L-NAME on intestinal smooth muscle contractions inhibited by C. lonicerae

因乙酰膽堿、組胺和氯化鋇引起腸平滑肌痙攣性收縮都與細胞內鈣離子濃度增多有關，故推測忍冬藤抑制腸平滑肌痙攣性收縮與降低細胞內鈣離子濃度有關。腸平滑肌收縮所需的鈣離子主要來源于細胞外通過電壓依賴性鈣離子通道進入的鈣離子和細胞肌漿網內三磷酸肌醇受體和雷諾定受體釋放的鈣離子，當胞內 Ca2+濃度達到一定水平（1—50 μmol·L-1）時, 與肌鈣蛋白或肌調蛋白結合, 觸發(fā)平滑肌收縮[19-20]。為此本試驗進一步進行了忍冬藤提取液對內鈣釋放的影響。

細胞內釋放的鈣離子主要來自于肌漿網，肌漿網內釋放的鈣離子主要通過三磷酸肌醇受體（IP3）和雷諾定受體（ryanodine）來完成。當這些受體被激活后，可引起肌漿網內鈣離子釋放，從而引起細胞內鈣離子濃度增加，誘導平滑肌收縮[21-22]。忍冬藤可能通過三磷酸肌醇受體或雷諾定受體途徑來完成其對腸平滑肌運動的抑制作用。為此，本試驗進行了 IP3受體阻斷劑肝素（HP）和雷諾定受體阻斷劑釕紅（RR）預處理下，忍冬藤對腸平滑肌的作用。結果顯示，預先應用IP3受體阻斷劑HP可顯著減弱忍冬藤對腸平滑肌收縮的振幅（P＜0.01），而預先應用雷諾定受體阻斷劑RR后，對忍冬藤舒張腸平滑肌的作用無影響（P＞0.05），由此推斷，IP3受體途徑受到抑制，引起細胞內鈣離子釋放減少可能介導忍冬藤舒張腸平滑肌的作用，但雷諾定受體途徑并未介導忍冬藤對腸平滑肌的舒張作用機制。

據報道，神經遞質NO通過激活平滑肌細胞內的鳥苷酸環(huán)化酶，使胞質內cGMP濃度增高，鈣離子濃度下降，誘導胃腸平滑肌的舒張[23-25]。本試驗采用NO合酶抑制劑L-NAME預處理腸平滑肌細胞，忍冬藤舒張平滑肌作用明顯減弱（P＜0.01），表明忍冬藤對腸平滑肌的抑制作用可能與NO濃度有關，但對其下游的鳥苷酸環(huán)化酶有無影響尚需進一步研究。

4 結論

通過忍冬藤對兔小腸平滑肌運動的影響研究，表明忍冬藤可濃度依賴性抑制自發(fā)性腸平滑肌收縮，并對乙酰膽堿、組胺和氯化鋇誘導的腸平滑肌痙攣具有顯著抑制作用；IP3受體阻斷劑HP和NO合酶抑制劑L-NAME預處理后可顯著增強忍冬藤的舒張作用，而雷諾定受體阻斷劑釕紅并沒有影響忍冬藤的舒張作用。由此得出忍冬藤抑制兔腸平滑肌收縮的作用機制可能為增加小腸平滑肌NO濃度，抑制IP3受體介導的內鈣釋放，最終使細胞內鈣離子濃度降低，平滑肌舒張而達到對腸平滑肌的解痙作用。忍冬藤對動物腸平滑肌運動具有顯著的舒張作用，因此，該藥在胃腸功能紊亂性疾病的應用中，具有廣闊的開發(fā)前景。

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（責任編輯 林鑒非）

Relaxed Effect of Caulis Lonicerae Extraction on Contraction of Intestinal Smooth Muscle of Rabbit in Vitro and Its Mechanism

WANG Hui, ZHANG HaiJuan, LI ZhiDong
( School of Pharmaceutical Sciences, Linyi University, Linyi 276000, Shandong )

【Objective】Excessive gastrointestinal smooth muscle contraction cause abdominal pain and diarrhea diseases in clinical. Recently, Ca2+channel blocker nifedipine and anticholinergic atropine are widely employed in the treatment of gastrointestinal excessive contraction. However, nifedipine has a potent negative inotropic and dromotropic effects with dose increase after long-term administration, and atropine has severe side-effects which highly limited its clinical utilization. Therefore, it is important to develop natural medicines with high activity, low toxicity and no residue. In this research, the effects of Caulis lonicerae extraction on spontaneous smooth muscle contractions in isolated rabbit small intestine were investigated and the possiblemechanism was explored.【Method】The in vitro intestine movement experiment, was conducted and the BL-420E biologic function analysis system was employed. The influences of C. lonicerae extraction on spontaneous contractions of the rabbit intestinal smooth muscle were measured. The effects of C. lonicerae extraction on spasmodic muscle contractions were measured by using acetylcholine (ACh), histamine (HA) and BaCl2. The mechanism of C. lonicerae extraction was studied by using inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor antagonist (heparin, HP), ryanodine receptor antagonist (ruthenium red, RR) and a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor (Nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME).【Result】The results showed that the extraction of Caulis lonicerae extraction dose-dependently inhibited the spontaneous contraction of intestinal smooth muscle. Caulis lonicerae extraction, at the concentration of 7.5 g·L-1, showed highly inhibition effects on the frequency of spontaneous contractions (P＜ 0.05). Meanwhile, at the concentration of 5 g·L-1, significantly inhibition effects on the amplitude of spontaneous contractions (P ＜ 0.05) were detected. ACh, HA and BaCl2significantly induced the amplitude of smooth muscle contractions, and C. lonicerae extraction notably inhibited the muscle contractions induced by ACh, HA and BaCl2(P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01). IP3receptor antagonist heparin could strengthen the relaxed effects of C. lonicerae extraction on intestinal smooth muscle, but ryanodine receptor antagonist ruthenium red had no effect on the relaxation of C. lonicerae extraction. L-NAME inhibited the relaxation of C. lonicerae extraction (P ＜ 0.01).【Conclusion】The extraction of C. lonicerae inhibited the frequency and amplitude of intestinal smooth muscle contractions of rabbits in vitro. The mechanism may be related to the increase of NO concentration in intestinal smooth muscle, and the inhibiting intracellular Ca2+released via IP3of sarcoplasmic reticulum.

extraction of Caulis lonicerae; rabbit; intestinal smooth muscle; calcium; nitric oxide

2016-01-05；接受日期：2016-12-02

國家星火計劃項目（2013GA740080）、山東省科技發(fā)展計劃項目（2013GSF11909）

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