彭術(shù)軍,王 玲,陳 宏

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 陜西 楊凌 712100；2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ,重慶 402460 )

熱應(yīng)激(Heat stress)是機(jī)體對(duì)外界或內(nèi)部的熱刺激所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和。研究表明，熱應(yīng)激能引起外周血液淋巴細(xì)胞凋亡，機(jī)體免疫下降，內(nèi)環(huán)境失衡，從而嚴(yán)重影響肉牛生產(chǎn)性能，對(duì)肉牛的經(jīng)濟(jì)價(jià)值帶來巨大損失。因此，從分子遺傳角度來看，研究熱應(yīng)激對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)及作用機(jī)制具有重要意義。SNORA66是一類位于非編碼區(qū)的基因間區(qū)的核仁小RNA分子，屬于核轉(zhuǎn)錄因子，是snoRNA家族之一，廣泛分布于真核生物和原核生物中，最初起源于HeLa Cell[1]，具有類似核仁提取物的性質(zhì)(抗鹽性)，其主要指導(dǎo)其它RNA，特別是指導(dǎo)snRNA，tRNA和mRNA的轉(zhuǎn)錄后的修飾，進(jìn)而調(diào)控mRNA翻譯成蛋白質(zhì)[2,3]，因而SNORA66基因?qū)O有希望成為研究肉牛應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激的候選基因。研究表明，強(qiáng)熱應(yīng)激下，轉(zhuǎn)基因植物通過機(jī)體內(nèi)SNORA66基因的調(diào)控作用產(chǎn)生熱休克蛋白Hsp70抵御外界刺激[4]。姜同泉等[5]發(fā)現(xiàn),哺乳動(dòng)物細(xì)胞受熱應(yīng)激后會(huì)終止大部分蛋白質(zhì)的合成。另外，研究顯示，人體血液中也檢測(cè)出SNORA66基因，并且發(fā)現(xiàn)與外周血淋巴細(xì)胞凋亡、蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)、阻止癌細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)高度相關(guān)[6]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)振蕩刺激與靜置兩種狀態(tài)下，人體血清樣品中SNORA66基因的Cq值，前者明顯高于后者[7]。有關(guān)SNORA66基因作為抗應(yīng)激候選基因的研究在植物、人類等有所報(bào)道，而SNORA66基因作為肉?？箲?yīng)激基因的相關(guān)研究報(bào)道不多，熱應(yīng)激對(duì)肉牛SNORA66基因表達(dá)的差異性的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究運(yùn)用Real-time PCR方法檢測(cè) SNORA66基因的組織表達(dá)譜，同時(shí)分析SNORA66基因在不同應(yīng)激下、不同品種的差異表達(dá)情況，探討SNORA66基因的表達(dá)量與熱應(yīng)激、非熱應(yīng)激、品種的關(guān)系，為進(jìn)一步研究SNORA66基因的功能和肉?？篃釕?yīng)激選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

在重慶良種肉牛場(chǎng)選擇26月齡左右的紅安格斯和抗旱王空懷母牛各5頭，在熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激條件下利用真空采血管從頸靜脈采集血液，并迅速將樣品置于液氮內(nèi)冷凍保存，然后在實(shí)驗(yàn)室分離白細(xì)胞。

1.2 溫濕度的測(cè)定

試驗(yàn)期內(nèi)，在牛舍中部及四個(gè)角距地面1.5 m高處各懸掛干濕球溫度計(jì)，于每天上午8:00和14:00測(cè)定牛舍的干球溫度(Td)和濕球溫度(Tw)，利用公式計(jì)算溫濕指數(shù)(THI)，THI=0.72(Td+Tw)+40.6。以THI作為熱應(yīng)激程度的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)THI≤72為無熱應(yīng)激；7288為重度熱應(yīng)激狀態(tài)。

1.3 主要儀器與試劑

熒光定量PCR儀、電泳儀、CFX connectTM Real-Time System、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等；2×Taq PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、10×Loading Buffer、6×DNA loading buffer；GoldViewⅠ型核酸染色劑、RNA抽提試劑Trizol、DEPC、瓊脂糖(AGAROSE G-10)、Tris base、EDTA、硼酸。

1.4 總RNA提取與處理

本試驗(yàn)采用Trizol全血RNA提取法，其操作流程如下：

用2 mL EP管中收集1.5 mL新鮮的血液，加入紅細(xì)胞裂解液按1：3的比例分離白細(xì)胞，在3500 r/min離心6 min，若效果不好，再重新裂解一次。分離得到的白細(xì)胞，立刻用質(zhì)量好的TRIZOL裂解白細(xì)胞，或置于-20℃或-80℃保存，過后抽提。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索肉牛SNORA66基因的DNA或者mRNA為模板來設(shè)計(jì)引物，利用Primer Premier 5.0[1](在www.bio-soft.net下載)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。綜合考慮引物設(shè)計(jì)的各項(xiàng)原則，設(shè)計(jì)SNORA66基因的上、下游引物，以β-actin作為內(nèi)參基因。引物由上海英俊公司合成，序列及信息見表1：

表1 引物詳細(xì)信息

1.6 cDNA的合成

根據(jù)TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系組成如：5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)1 μL，Random 6 mers(100 μmol/L)1 μL，Total RNA(1 μg/μL) 2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足20 μL。按37℃反應(yīng)15 min，再85℃反應(yīng)5s，獲取cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 熒光定量引物普通PCR電泳檢測(cè)

根據(jù)SsoAdvancedTM Universal SYBRR Green SuPermix配置熒光PCR反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)體系如下：SsoAdvancedTM Universal SYBRR Green SuPermix 5 μL，上下引物各0.4 μL，cDNA 模板1 μL，補(bǔ)滅菌雙蒸水至10 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10s，52.9℃退火30 s，39個(gè)循環(huán)，4℃保存，最后，用1%瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

1.8 熒光定量引物擴(kuò)增效率檢測(cè)

以RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行倍比稀釋，將PCR產(chǎn)物用EASY Dilution依次梯度稀釋成(1×100～1×106)7個(gè)梯度，按上述1.6的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理：紅安格斯正常情況(HC)、紅安格斯熱應(yīng)激情況(HH)和抗旱王正常情況(KC)、抗旱王熱應(yīng)激情況(KH)進(jìn)行測(cè)定，每一品種選擇3個(gè)樣本，每個(gè)樣本(重復(fù)3次)，選取表達(dá)量最低的樣品作為計(jì)算相對(duì)表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照(NTC)。取各梯度的標(biāo)準(zhǔn)品1 μL加入反應(yīng)體系中，在同樣的反應(yīng)條件下，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增效率。根據(jù)Q-PCR儀繪制的PCR動(dòng)力學(xué)曲線，分別繪制SNORA66、β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)熒光曲線的Ct值，采用比較閾值法(2-ΔΔCT法)進(jìn)行相對(duì)定量分析結(jié)果。針對(duì)基因的相對(duì)表達(dá)量，采用Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液總RNA質(zhì)量檢驗(yàn)

采用Trizol法對(duì)肉牛外周血進(jìn)行總RNA抽提，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖譜見圖1。由圖1可見3條明顯的條帶，按遷移率由小到大依次是28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA。28S條帶較明亮，28S條帶與18S條帶之比約為2，沒有雜帶和拖尾現(xiàn)象的樣品為合格樣品。

圖1 RNA電泳結(jié)果

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

圖2顯示，SNORA66產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中只出現(xiàn)唯一符合預(yù)期長度的明亮條帶，表明不存在明顯的引物二聚體或非特異PCR產(chǎn)物，可供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 β-actin、SNORA66基因擴(kuò)增結(jié)果

圖3 肉牛SNORA66基因Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 β-actin基因Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

基因擴(kuò)增效率(%)回歸公式回歸系數(shù)(R2)β-actin94.9Y=-3.451X+30.6920.999SNORA6698.7Y=-3.353X+32.2780.995

圖3、圖4得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式和回歸系數(shù)分別如表2所示，這說明在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。曲線的擴(kuò)增效率為E=94.9%、98.7%符合要求；熔解曲線表現(xiàn)為單一的峰值，產(chǎn)物的Tm值均一。

2.4 SNORA66基因的相對(duì)表達(dá)量

經(jīng)Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件進(jìn)行分析預(yù)處理后得到每一樣品的SNORA66基因相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)果見表3、表4。從表3可知，紅安格斯牛及抗旱王牛熱應(yīng)激條件下SNORA66基因表達(dá)量均顯著高于非熱應(yīng)激條件(P<0.05)。

從表4可知，熱應(yīng)激及非熱應(yīng)激狀態(tài)下紅安格斯牛SNORA66基因表達(dá)量均顯著低于抗旱王牛SNORA66基因表達(dá)量 (P<0.05)。

表3 不同狀態(tài)下紅安格斯及抗旱王SNORA66基因的表達(dá)量

注:數(shù)據(jù)中肩標(biāo)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，附不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，附不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同

表4 非熱應(yīng)激及熱應(yīng)激狀態(tài)下紅安格斯和抗旱王SNORA66基因表達(dá)量

3 討論

3.1 不同狀態(tài)下同一肉牛品種SNORA66基因的相對(duì)表達(dá)

熱應(yīng)激下，組織器官處于異常狀態(tài)，體內(nèi)SNORA66基因的表達(dá)水平發(fā)生改變。目前，在動(dòng)物上研究熱應(yīng)激對(duì)SNORA66的影響的報(bào)道較少，而主要集中在植物和人類的研究中。在植物上，已有許多研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激較大程度影響植物中的基因表達(dá)。Jonathan等[4]研究轉(zhuǎn)基因植物在熱應(yīng)激下的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，SNORA66在熱應(yīng)激下表達(dá)發(fā)生改變，且大部分表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。另外，Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)振蕩刺激與靜置兩種狀態(tài)下，人體血清樣品中SNORA66基因的Cq值，前者明顯高于后者。另外，醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組中15號(hào)染色體上缺少SNORA66基因會(huì)導(dǎo)致Prader-willi綜合征，說明該基因與疾病的調(diào)控高度相關(guān)[8]。本研究表明，兩種狀態(tài)下安格斯及抗旱王牛外周血液中的SNORA66基因均有表達(dá)，且熱應(yīng)激下顯著高于非熱應(yīng)激，與前人研究基本一致。通過以上研究結(jié)果表明，熱應(yīng)激下動(dòng)植物體內(nèi)部分SNORA66基因存在上調(diào)表達(dá)，調(diào)節(jié)著不同的生理過程來防御熱應(yīng)激。因此，本研究推測(cè)，短時(shí)間熱應(yīng)激將導(dǎo)致肉牛的免疫功能受到抑制，機(jī)體通過提升SNORA66基因表達(dá)量,調(diào)控產(chǎn)生熱休克蛋白防御熱應(yīng)激破壞機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，而非熱應(yīng)激下則不會(huì)出現(xiàn)。同時(shí)，我們擬通過鑒定熱應(yīng)激下差異表達(dá)的SNORA66，初步探究動(dòng)植物對(duì)熱應(yīng)激與非熱應(yīng)激的應(yīng)答機(jī)制。

3.2 熱應(yīng)激條件下不同肉牛品種SNORA66基因的相對(duì)表達(dá)

熱應(yīng)激下，不同品種肉牛體溫均迅速上升，機(jī)體內(nèi)環(huán)境遭到破壞，嚴(yán)重影響牛血清生化指標(biāo)(SOD抗氧化指標(biāo)、免疫指標(biāo)、酶活性指標(biāo))。近幾年，F(xiàn)uquay[9]等研究發(fā)現(xiàn)，肉牛熱應(yīng)激是當(dāng)肉牛受到超過本身體溫調(diào)節(jié)能力的過高溫度刺激時(shí)，作用于垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)引起機(jī)體的非特異性防御反應(yīng)和特異性障礙的全身性適應(yīng)癥。研究表明，肉牛的耐熱性狀是一數(shù)量性狀，不同的品種和個(gè)體的肉牛對(duì)熱應(yīng)激的反應(yīng)存在一定的差異，抗旱王牛群耐熱性狀的遺傳力為0.15～0.30[10]。本研究表明，熱應(yīng)激期的安格斯牛和抗旱王牛的SNORA66基因表達(dá)量差異較大?？赡芘c種屬特異性和品種的形成過程有關(guān)，由于品種的形成與自然環(huán)境密切相關(guān)，不同的自然環(huán)境使不同牛的品種在外貌特征，生理和基因組成上產(chǎn)生較大的差別，因而兩品種肉牛對(duì)熱應(yīng)激的抵抗力也有顯著的差異。黃薇等[11]曾報(bào)道，在不同的人群中，基因組的連鎖不平衡的程度是不同的，即使在同一個(gè)群體中，基因組的不同區(qū)域的連鎖不平衡程度也是不同的。同樣，SNORA66基因在這2個(gè)肉牛品種中的連鎖不平衡(Linkgae Disqeuiilbrium, LD)程度也不是完全一樣的。李芳等[2,12]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子是最早被發(fā)現(xiàn)的熱休克轉(zhuǎn)錄因子，它轉(zhuǎn)錄調(diào)控?zé)嵝菘说鞍谆虻谋磉_(dá)，直接或間接參與動(dòng)物熱休克反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)SNORA66基因是一種分布于真核生物細(xì)胞核仁的小分子非編碼RNA，與熱應(yīng)激蛋白質(zhì)合成有關(guān)，該基因高度保守遺傳[2,13]，不同物種間同源性高，研究證實(shí)所有SNORA66基因都包含三個(gè)及其相似結(jié)構(gòu)：DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、三聚化結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄活化域。一旦機(jī)體受到熱應(yīng)激時(shí)，SNORA66基因接受刺激后，啟動(dòng)三聚化結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成有活性的三聚體，然后由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)結(jié)合到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因上，最后發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域的功能激活相應(yīng)基因表達(dá)，因此，不同品種肉牛細(xì)胞可能通過提高SNORA66表達(dá)量的方式來應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激所帶來的不良反應(yīng)。另外，通過尹小平[14,15]等的研究分析，品種差異造成，抗旱王耐熱性能較好，對(duì)熱的敏感度較低，機(jī)體內(nèi)含有瘤牛血液，體質(zhì)強(qiáng)壯[16]，合成熱應(yīng)激蛋白能力較強(qiáng)，熱應(yīng)激下抗旱王牛SNORA66基因表達(dá)量的上調(diào)明顯。

本研究通過對(duì)SNORA66基因表達(dá)量的研究，統(tǒng)計(jì)分析不同品種與熱應(yīng)激的相關(guān)性，從分子水平上揭示SNORA66基因與肉牛耐熱性狀之間關(guān)系，探索不同品種肉牛發(fā)生熱應(yīng)激的遺傳機(jī)理。結(jié)果表明，熱應(yīng)激狀態(tài)下紅安格斯牛外周血中SNORA66基因表達(dá)顯著低于抗旱王牛，與前人研究有類似結(jié)論。因此，筆者推測(cè)，熱應(yīng)激是通過破壞內(nèi)環(huán)境平衡，導(dǎo)致血液生化信號(hào)通路受阻、細(xì)胞凋亡、免疫功能下降，從而激活SNORA66基因調(diào)控功能，上調(diào)血液中基因表達(dá)量，以堿基配對(duì)的方式分別指導(dǎo)著核糖體RNA的甲基化和假尿嘧啶化修飾，與特定的熱休克蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖核蛋白體(snoRNP)，并以此形式存在和行使功能，防御熱應(yīng)激；從分子遺傳角度看，不同品種的肉牛在熱應(yīng)激存在差異性的基因表達(dá)機(jī)制，具體表達(dá)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，熱應(yīng)激狀態(tài)下，紅安格斯牛及抗旱王牛外周血中的SNORA66基因表達(dá)量均顯著高于非熱應(yīng)激狀態(tài)(P<0.05)；熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激狀態(tài)下，SNORA66基因的表達(dá)量具有品種差異，紅安格斯牛外周血中SNORA66基因表達(dá)量均顯著低于抗旱王牛(P<0.05)。

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