嵌合抗原受體修飾T細胞治療惡性淋巴瘤研究進展

蔣婷，紀青，鄧飛

(遵義醫(yī)學院病理學教研室，貴州 遵義 563000)

·綜 述·

嵌合抗原受體修飾T細胞治療惡性淋巴瘤研究進展

蔣婷，紀青，鄧飛

(遵義醫(yī)學院病理學教研室，貴州 遵義 563000)

惡性淋巴瘤(ML)是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，現(xiàn)有的常規(guī)治療手段主要為化療和放療，但不良反應較大，療效欠佳。嵌合抗原受體修飾T細胞(CAR-T)療法是近年來治療惡性腫瘤的一種新模式，在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤治療上顯示了良好的抗腫瘤效應，但CAR-T細胞也會殺傷帶有CAR相對應抗原的正常細胞，產(chǎn)生細胞因子風暴等副作用。本文從CAR原理及結(jié)構(gòu)及其在ML中的臨床應用和不良反應等方面作簡要綜述。

嵌合抗原受體；T細胞；惡性淋巴瘤；進展

惡性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，根據(jù)其病理、臨床特點及預后轉(zhuǎn)歸等分為非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma，HL)?，F(xiàn)有的常規(guī)治療手段主要為化療和放療，但不良反應較大，療效欠佳即完全緩解率低或復發(fā)率高，例如HL雖化療后完全緩解率可達70%～80%，但20%～30%的患者對化療方案原發(fā)耐受，且其中4%～50%的患者常有預后不良伴復發(fā)[1]。因此，尋找一種毒副作用小、特異性強且安全有效的治療方法十分必要。嵌合抗原受體修飾T細胞(chimeric antigen receptor modified T cells，CAR-T)療法是目前最具前景的腫瘤治療方法之一，CAR-T細胞通過抗原、抗體結(jié)合的原理特異性識別腫瘤細胞表面抗原，可不受腫瘤局部微環(huán)境免疫抑制、以非MHC限制性的方式特異性殺傷腫瘤細胞，相比以往的免疫治療手段有著更好的腫瘤特異性，更加高效的攻擊效應及攻擊持久性[2]。近年來，CAR-T療法在惡性腫瘤，特別是淋巴造血系統(tǒng)腫瘤治療上顯示了良好的抗腫瘤效應[3]。

1 CAR-T作用原理

CAR-T是通過人工手段，將識別腫瘤相關抗原的單克隆抗體序列(single chain variable fragment，scFv)和T細胞的活化序列在體外進行基因重組，形成重組質(zhì)粒，通過病毒載體、電穿孔、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)等轉(zhuǎn)染技術(shù)在體外轉(zhuǎn)染、純化、擴增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，這種經(jīng)過基因改造和修飾后的T細胞稱為CAR-T細胞。CAR-T細胞能在體內(nèi)及體外特異性識別腫瘤細胞表面抗原，在與目的抗原結(jié)合后直接介導細胞毒性，通過釋放顆粒素、穿孔酶、干擾素(IFN)和腫瘤壞死因子(TNF)等達到殺傷腫瘤細胞的目的。

2 CAR-T結(jié)構(gòu)

CAR-T細胞由胞外抗原結(jié)合區(qū)、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號肽區(qū)組成。胞外區(qū)為單克隆抗體的單鏈可變區(qū)scFv段，可變區(qū)序列能夠識別特定腫瘤抗原，目前已有多種腫瘤抗原可用作胞外區(qū)識別，包括CD19、CD20、CD30、表皮生長因子受體(VEGFR)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、人類表皮生長因子受體-2、CEA、GD2、碳酸酐酶Ⅸ等[4]。當scFv與這些腫瘤抗原結(jié)合，可通過TCRζ(CD3ζ)或Fc受體的胞內(nèi)區(qū)使T細胞活化發(fā)揮效應功能；跨膜區(qū)連接胞外與胞內(nèi)區(qū)，由同源或異源二聚體膜蛋白組成，常用的CAR跨膜區(qū)分子有CD3、CD4、CD7、CD8、CD28、4-1BB (CD137)、OX40(CD134)、DAP-10等；胞內(nèi)區(qū)具有免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)，最常見的是T細胞受體TCR/CD3ζ鏈和免疫球蛋白Fc受體FcεRIγ鏈，主要負責信號轉(zhuǎn)導功能。

根據(jù)CAR胞內(nèi)信號區(qū)的結(jié)構(gòu)不同將其分為三代。一代CAR由腫瘤相關抗原的單鏈抗體(scFv)和ITAM構(gòu)成，不含共刺激分子，能夠識別靶抗原并激活T細胞，但不轉(zhuǎn)導增殖信號和誘導細胞因子產(chǎn)生，殺傷作用有限。于是在此基礎上構(gòu)建了二代CAR和三代CAR，它們結(jié)構(gòu)上的區(qū)別在于：分別嵌入了一種或者多種來源于 CD28、4-1BB、OX40、DAP10、ICOS、CD27的胞內(nèi)共刺激分子信號結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建的這種二代CAR和三代CAR與一代CAR相比促進T細胞增殖效能更好、釋放細胞因子的水平更高、抗腫瘤效能更強[5-6]，但其改進的作用效果如何仍需要進一步驗證。

3 CAR-T在ML治療中的應用

目前臨床上應用針對ML的CAR種類很多，主要包括構(gòu)建靶向CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD123、Kappa輕鏈等抗體的CAR來修飾外周血T細胞進行臨床試驗和研究[7]。

2011年，Savoldo等[8]首次報道將靶向CD30的CAR負載于EB病毒特異性細胞毒性T細胞(EBV-CTLs)制備了CD30 CAR+)EBV-CTLs，該細胞能夠在HL SCID小鼠移植瘤模型中發(fā)揮抗腫瘤作用。2012年，Till等[9]應用靶向CD20分子，共刺激分子包括CD28和4-1BB (CD137)的第3代CAR-T細胞治療3例套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)和1例濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，F(xiàn)L)患者，回輸細胞前均予以淋巴細胞清除，輸注后第14天輸入IL-2，其中1例MCL患者達完全緩解，另外兩例持續(xù)無疾病進展期分別達12個月和24個月，F(xiàn)L總體上呈部分緩解。

相比之下，應用靶向CD19的CAR-T細胞治療NHL患者的療效尤為突出[10-12]，2013年，Kochenderfer等[13]報道了采用異基因第2代抗CD19-CAR-T細胞治療10例B細胞淋巴瘤患者，患者在輸注細胞前未接受放療或化療處理，輸注細胞后不給予IL-2，CAR-T細胞在7～14 d達峰值，持續(xù)時間不超過1個月，大多數(shù)病情穩(wěn)定，其中1例緩解期維持達32個月，但所有患者在輸注細胞后出現(xiàn)了短暫的發(fā)熱、低血壓、乏力等反應且均在兩周之內(nèi)緩解。2015年Kochenderfer等[14]再次將抗CD19-CAR-T細胞應用于B細胞淋巴瘤患者，總體均獲得部分緩解。與此同時，Schuster等[15]應用靶向CD19的CAR-T細胞免疫治療復發(fā)/難治性NHL患者的Ⅱa期臨床試驗，總反應率達67%(其中12例DLBCL患者的反應率為50%，6例FL患者反應率則為100%)，中位隨訪6個月患者的無進展生存率為59%，其良好的抗腫瘤效應，證明了CAR-T用來治療難治性惡性淋巴瘤的可行性和有效性，為CAR-T細胞免疫治療的進一步發(fā)展提供了強有力的支撐。

4 CAR-T細胞免疫治療的主要不良反應及解決途徑

這些由不同研究小組已經(jīng)發(fā)表的臨床試驗數(shù)據(jù)均證實CAR-T用來治療難治性ML的可行性和有效性，但治療過程中引起的不良反應亦不能忽視，主要包括細胞因子釋放綜合征、脫靶效應、插入突變、移植物抗宿主反應等。

4.1 細胞因子釋放綜合征(cytokine relaease syndrome，CRS)CAR-T細胞治療過程中出現(xiàn)的首要不良反應是CRS，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、心動過速、低血壓、急性呼吸窘迫綜合征或多器官功能衰竭，嚴重者可危及患者生命[17]。這與大量激活的T細胞介導的急性抗腫瘤反應有關，腫瘤細胞在短時間內(nèi)被溶解消散的同時會啟動一系列細胞因子的釋放，如IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α等。目前主要通過以下措施預防和減少CRS的發(fā)生：(1)低劑量多次回輸CAR-T細胞；(2)先培養(yǎng)回輸?shù)?代CAR-T細胞，待患者適應后，再改用第2代或第3代CAR-T細胞；(3)在CAR中導入自殺基因以控制T細胞的過度增殖[17]；(4)適當使用類固醇激素及免疫抑制劑拮抗劑緩解CRS癥狀。(5) CRS的嚴重程度與腫瘤負荷呈正相關，通過化療或者放療預處理減小腫瘤負荷，可提高CAR-T細胞的抗腫瘤效應并在一定程度上降低CRS反應。

4.2 脫靶效應 CAR針對腫瘤細胞表面的特異性抗原很少，大多為腫瘤相關性抗原，因此，CAR-T細胞靶向性殺滅腫瘤細胞的同時也會對帶有CAR相對應抗原的正常細胞產(chǎn)生殺傷，稱之為脫靶效應。Kochenderfer等[18]報道了1例抗CD19-CAR治療B細胞淋巴瘤病例，觀察發(fā)現(xiàn)在持續(xù)清除外周血B細胞達39周后患者才出現(xiàn)CD19+淋巴瘤細胞清除效果，表明脫靶效應的存在直接影響了CAR-T療法的抗腫瘤療效?，F(xiàn)階段處理方案：(1)選擇特異性更高的腫瘤相關抗原；(2)構(gòu)建能夠同時識別和結(jié)合腫瘤細胞表面一種以上抗原的CAR，因為正常細胞只表達一種抗原可避免受到損傷[19]；(3)根據(jù)靶抗原表達水平,設計與靶抗原有特定親和力的CAR；(4)構(gòu)建跨信號CAR，不直接相連CAR結(jié)構(gòu)中的T細胞活化信號CD3ζ與共刺激信號CD28分子[20]；(4)對于B細胞缺乏，可通過輸注丙種球蛋白糾正[21]。

4.3 插入突變 CAR技術(shù)是將外源性基因序列整合到正常T細胞內(nèi)，理論上正常T細胞存在一定的基因突變風險，目前尚未有相關報道，但有研究中心采用mRNA直接轉(zhuǎn)導T細胞的辦法以避免該風險。

4.4 移植物抗宿主反應(graft versus host disease，GVHD)CAR-T細胞在患者體內(nèi)長期存在可能會引起GVHD樣損傷，為減少GVHD的發(fā)生Hoyos等[22]的策略是在設計CAR-T細胞的同時整合入自殺基因如Caspase-9，通過化學誘導等方法啟動CAR-T細胞的自殺程序。且有研究表明通過給異基因造血干細胞移植后的患者輸注特異性細胞毒性T淋巴細胞并無GVHD的產(chǎn)生[23]，所有這些研究為CAR-T細胞技術(shù)用于預防GVHD的發(fā)生提供了新的思路。

5 結(jié) 語

眾多研究表明CAR-T細胞技術(shù)的問世明顯改變著ML的治療模式且有著廣闊的應用前景，然而CAR-T細胞在治療不同類型腫瘤時會表現(xiàn)出不同的作用效果，而且在攻擊腫瘤相關抗原的同時也會攻擊正常細胞和組織，由此引發(fā)的各種不良反應不容忽視。目前國外通常的做法是選用不同的單鏈抗體序列，尋找高水平表達的腫瘤相關抗原，或低劑量多次回輸?shù)确椒右越鉀Q，但現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)大都是小樣本研究，CAR-T治療方法在技術(shù)和大規(guī)模臨床應用方面仍然存在著巨大的挑戰(zhàn)。因此需要更多實驗數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)來證實這一新治療策略的安全性和有效性，相信隨著研究的深入和技術(shù)的不斷改進，CAR-T細胞免疫治療將會為更多的腫瘤患者帶來福音。

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Research progress of chimeric antigen receptor modified T cells in malignant lymphoma.

JIANG Ting,JI Qing, DENG Fei.Department of Pathology,Zunyi Medical College,Zunyi 563000,Guizhou,CHINA

Malignant lymphoma(ML)is a malignant tumor originating in the lymphoid hematopoietic system. Current conventional treatment methods to ML are mainly chemotherapy and radiotherapy,but they both cause many adverse reactions,and the therapeutic efficacy is unsatisfactory.The modified chimeric antigen receptor T cells(CAR-T) therapy is a kind of new pattern of malignant tumor therapy in recent years.It shows great effect on lymphatic hematopoietic system,but CAR-T cells will also kill the normal cells that wearing CAR antigen,which can cause cytokine storm and other risks.In this review,CAR principle and its structure,and its clinical use and existing problems in malignant lymphoma treatment are summarized.

Chimeric antigen receptor;T cells;Malignant lymphoma;Progress

R733.4

A

1003-6350（2017）04-0612-03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.031

2016-09-01)

國家自然科學基金(編號：81160300)

鄧飛。E-mail：mdproffeideng@hotmail.com