梁潔玲,王洋洋,司艷輝,李海珠,陳立強(qiáng)

(肇慶市第一人民醫(yī)院,廣東 肇慶 526060)

MicroRNAs(miRNA)是由18-22nt組成的非編碼RNA,其在基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。隨著序列檢測(cè)技術(shù)的提高,對(duì)miRNA的研究亦進(jìn)一步深入,而新穎的miRNA合成技術(shù)開(kāi)展也加深了我們對(duì)miRNA的認(rèn)識(shí)[1]。許多研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)報(bào)道m(xù)iRNA在癌癥、糖尿病、心臟病和自身免疫性疾病中均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,而且miRNA在多種體液中存在,包括血漿、血清、尿液、精液和唾液等；對(duì)體液miRNA進(jìn)行檢測(cè)可對(duì)某些疾病的診斷和藥物治療提供更科學(xué)的依據(jù),故miRNA可作為某些疾病的診斷標(biāo)記物并推廣應(yīng)用[2]。此文針對(duì)miRNA調(diào)節(jié)機(jī)制及近期檢測(cè)方法進(jìn)行綜述,以了解miRNA的檢測(cè)方法的最新進(jìn)展。

1 miRNA簡(jiǎn)介

真核細(xì)胞基因表達(dá)的傳統(tǒng)中心法則是DNA轉(zhuǎn)錄mRNA,再由mRNA翻譯為蛋白質(zhì)。自從miRNA被發(fā)現(xiàn),讓我們對(duì)RNA的生成和調(diào)控機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。miRNA是微小(21-22nt)的RNA,其功能主要是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的生物合成[3]。miRNA可通過(guò)識(shí)別mRNA的特定序列,抑制多種類型的mRNA轉(zhuǎn)錄和影響蛋白質(zhì)的合成。通過(guò)對(duì)miRNA的功能研究發(fā)現(xiàn),miRNA的調(diào)控錯(cuò)誤會(huì)影響多種基因表達(dá),最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。miRNA主要來(lái)自其靶基因的基因序列之間或基因內(nèi)區(qū),這類miRNA與靶基因共同轉(zhuǎn)錄,再識(shí)別細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的狀況對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控,達(dá)到細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡[4]。某些miRNA前體是由蛋白編碼基因或非蛋白編碼基因序列內(nèi)區(qū)轉(zhuǎn)錄生成,或者來(lái)源于非蛋白編碼基因RNA的外顯子序列,因此該類miRNA的表達(dá)主要作用于其靶基因。另外有部分miRNA主要作用于啟動(dòng)子序列的多順?lè)醋訁^(qū)域,在miRNA修飾成熟過(guò)程中保持多種類型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[5]。

2 miRNA生成與調(diào)控機(jī)制

miRNA的生成需要多種蛋白酶,pri-miRNA的剪切須RNAse III Drosha和DGCR8(一種雙鏈RNA結(jié)合蛋白),這種蛋白復(fù)合物是由大約70nt核苷酸組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA,pre-miRNA的3’和5’磷酸末端向外伸展,形成獨(dú)特的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[6]；這時(shí)pre-miRNA通過(guò)Exportin-5(一種Ran-GTP依賴蛋白)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后通過(guò)Dicer(RNAse III蛋白酶)剪切,同時(shí)與轉(zhuǎn)運(yùn)激活反應(yīng)性RNA結(jié)合蛋白(transactivation Response RNA-Binding Protein,TRBP)形成聯(lián)合體[7]。此時(shí)pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)會(huì)解開(kāi)并且3’末端會(huì)伸出約22nt的RNA雙鏈結(jié)構(gòu),Dicer將此RNA轉(zhuǎn)運(yùn)至Ago(Argonaute)蛋白并相互結(jié)合,構(gòu)成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-Induced Silencing Complex,RISC)；此時(shí)該RISC是前體RISC,要形成成熟的RISC還需進(jìn)行該RNA雙鏈的分離,該過(guò)程稱為RNA的鏈分選過(guò)程。RNA的鏈分選過(guò)程主要由熱力學(xué)因素決定,主要取決于RNA雙鏈的前面4個(gè)核苷酸分子。因此,首先末端分離的RNA單鏈作為向?qū)ф溕蒻iRNA復(fù)合物,而隨從鏈會(huì)被分解處理。細(xì)胞質(zhì)中成熟的RISC復(fù)合物可尋找與miRNA序列相匹配的mRNA,miRNA與mRNA根據(jù)Watson-Crick法則進(jìn)行配對(duì)結(jié)合,結(jié)合區(qū)域是mRNA的3’未翻譯區(qū)域(untranslated region,UTR ) 與miRNA的“種子序列”(即miRNA第2-8的核苷酸序列)[8]。miRNA不一定都是以DNA序列作為模板,有6%的人體miRNA以RNA作為模板進(jìn)行編輯。此外,單獨(dú)的pre-miRNA可以生成多種成熟的miRNA,每種miRNA序列的長(zhǎng)度和核苷酸順序均不相同,該類型的miRNA稱為isomiRNA。這種miRNA的編輯可改變“種子序列”的結(jié)構(gòu),從而改變miRNA與靶向mRNA的識(shí)別,此機(jī)制講改變miRNA對(duì)靶基因的選擇。細(xì)胞內(nèi)不同類型的isomiRs表達(dá)會(huì)影響不同蛋白的表達(dá),miRNA的類型和數(shù)量均能影響該細(xì)胞的生理功能,若miRNA的生成以及表達(dá)發(fā)生異常,會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞和組織的內(nèi)部功能紊亂[9]。沉默mRNA可使mRNA降解或抑制其表達(dá),miRNA與mRNA匹配結(jié)合后,通過(guò)Ago酶作用對(duì)mRNA進(jìn)行剪切,而如果miRNA與mRNA不是完全匹配,則會(huì)抑制mRNA的表達(dá),對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的過(guò)程產(chǎn)生抑制機(jī)制[10]。

3 miRNA檢測(cè)

3.1 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定miRNA

由于miRNA序列較短,難以利用其有效的特異性引物和探針對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),而有些學(xué)者利用較長(zhǎng)的pre-miRNA作為把序列進(jìn)行檢測(cè),但pre-miRNA的檢測(cè)不能真實(shí)反映miRNA的表達(dá)水平[11]。現(xiàn)在的解決方法是設(shè)計(jì)一種莖環(huán)狀的PCR引物對(duì)miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,然后對(duì)cDNA再進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。RT-PCR引物的設(shè)計(jì)有2種類型,一是有Oligod(T)特異的RT引物,該引物包含與miRNA互補(bǔ)序列加上約20個(gè)左右的Oligod(T)結(jié)構(gòu)；二是莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT-PCR引物,由可以形成特異性環(huán)莖狀的特異序列的6-8個(gè)與miRNA3’端反向互補(bǔ)堿基構(gòu)成,一個(gè)莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT引物與一條miRNA序列特異引物相互對(duì)應(yīng)。兩種引物各自有其優(yōu)點(diǎn),Oligod(T)特異的RT引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單而且檢測(cè)通量高,而莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT-PCR引物的靈敏度和特異性比前者高[12]。

3.2 生物芯片測(cè)定miRNA

生物芯片檢測(cè)miRNA的技術(shù)路線主要包括了樣品RNA的準(zhǔn)備、生物芯片的預(yù)處理、芯片的掃描及數(shù)據(jù)讀取和最后的數(shù)據(jù)分析。生物芯片經(jīng)雜交后,數(shù)據(jù)通過(guò)熒光檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)熒光的強(qiáng)度,芯片上的每一個(gè)雜交點(diǎn)都是單一的miRNA雜交信號(hào),通過(guò)設(shè)備精細(xì)讀取芯片的信息,可以獲取這些雜交信號(hào)的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)弱[13]。隨后將芯片探針類型與數(shù)據(jù)庫(kù)探針類型進(jìn)行同步處理,讀取雜交的信號(hào)進(jìn)行預(yù)處理,各個(gè)探針的表達(dá)水平形成數(shù)據(jù)再與特定基因的表達(dá)進(jìn)行背景校正,多種樣品進(jìn)行比較和數(shù)據(jù)整合,最終得到miRNA的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與多樣的統(tǒng)計(jì)手段,可做反映miRNA或者甲基化的區(qū)域的相關(guān)研究。隨著miRNA芯片技術(shù)的發(fā)展,可進(jìn)行miRNA靶基因的預(yù)測(cè),或利用分析軟件對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行功能分析；根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)信息整合,發(fā)現(xiàn)新的生物信號(hào)和代謝通路。因此,大數(shù)據(jù)庫(kù)的整合利用可完成miRNA-miRNA表達(dá)相關(guān)性分析,miRNA-靶mRNA表達(dá)相關(guān)性分析和對(duì)miRNA功能推導(dǎo),從而得到異常miRNA參與的生物學(xué)過(guò)程[14]。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述,miRNA對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控產(chǎn)生重要的調(diào)控作用,miRNA與mRNA結(jié)合而抑制其翻譯過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)大部分病理過(guò)程均出現(xiàn)miRNA表達(dá)異常,故miRNA可作為某些疾病的標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè),更深入的研究miRNA的功能和特征、檢測(cè)方法的更新為其作為診斷手段提供更合理的素材。因此,miRNA可作為疾病診斷和預(yù)測(cè)的新的標(biāo)志物,而診斷標(biāo)準(zhǔn)和診斷數(shù)據(jù)的整合,標(biāo)本的處理和保存,技術(shù)流程的規(guī)范對(duì)miRNA成為診斷標(biāo)志物至關(guān)重要。

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