吳開林 綜述 謝青貞 審校

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北 武漢 430060)

鈣離子激活的氯離子通道蛋白TMEM16A 在女性生殖系統(tǒng)中的研究進(jìn)展

吳開林 綜述 謝青貞 審校

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北 武漢 430060)

作為鈣離子激活的氯離子通道(CaCCs)分子基礎(chǔ)的跨膜蛋白16A(TMEM16A)分布于人體多種組織器官中，對許多生理和病理過程具有重要意義。近年來，對TMEM16A在女性生殖系統(tǒng)中分布和作用的研究逐漸增多，比如參與子宮平滑肌的收縮、影響卵巢顆粒細(xì)胞雌激素的合成以及調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的形態(tài)等，這些都提示了TMEM16A在女性生殖系統(tǒng)中的生理重要性?，F(xiàn)本文將就TMEM16A在女性生殖系統(tǒng)各方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

鈣離子激活的氯離子通道；跨膜蛋白16A；女性生殖系統(tǒng)

鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)是一類受細(xì)胞內(nèi)鈣離子調(diào)節(jié)的氯離子通道，早于20世紀(jì)80年代便由Miledi在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[1]，因其參與許多生理和病理過程而備受關(guān)注。然而，人類當(dāng)時只是從功能層面認(rèn)識到了這種類型氯離子通道的存在，對其分子基礎(chǔ)的認(rèn)識經(jīng)歷了將近三十年的艱難探索，直到2008年才最終被確定。三個獨立的團(tuán)隊分別采用不同的研究方法都證明了跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)是CaCCs的分子基礎(chǔ)[2-4]。自此之后，這個領(lǐng)域進(jìn)入了一個非?；钴S的階段，有大量文章發(fā)表強(qiáng)調(diào)TMEM16A在我們身體中的重要性，比如跨上皮離子轉(zhuǎn)運、平滑肌收縮、神經(jīng)元興奮性調(diào)控、傷害感受、嗅覺生理、視覺光傳導(dǎo)以及細(xì)胞增殖等[5]。近年來，對TMEM16A在女性生殖系統(tǒng)中分布和作用的研究逐漸增多，比如參與子宮平滑肌的收縮、影響卵巢顆粒細(xì)胞雌激素的合成以及調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的形態(tài)等，這些都提示了TMEM16A在女性生殖系統(tǒng)中的生理重要性。因此，本文將就TMEM16A在女性生殖系統(tǒng)各方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 TMEM16A的結(jié)構(gòu)和功能

TMEM16A屬于“未知功能的跨膜蛋白16”家族10個成員中的一種(TMEM16A-K，但不包括TMEM16A-I)。TMEM16家族蛋白通常含有800～1 000個氨基酸殘基，定位于細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞器膜上，涉及離子運輸、磷脂爬行以及調(diào)節(jié)其他膜蛋白等功能，而其中的一些成員已演變?yōu)榧兺ǖ拦δ?，例如TMEM16A和TMEM16B。因為陰離子通道(Anion)功能和推測含有8個(Octa)跨膜片段，TMEM16家族蛋白也被稱為anoctamin(ANO1-10)。盡管如此，但是并不能確定所有TMEM16家族蛋白都具有離子通道的功能[4]。TMEM16A蛋白含有8個跨膜結(jié)構(gòu)域，并且氨基(-NH2)和羧基(-COOH)末端都在膜內(nèi)。其中跨膜區(qū)段1～4和7～8的定位是明確的，而跨膜區(qū)段4和7之間區(qū)域的情況尚存爭議。有研究提出第5和第6跨膜結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域只是部分地穿過質(zhì)膜，從而形成一個折返環(huán)結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)相當(dāng)于離子通道的孔。但這個折返環(huán)模型被另一項研究質(zhì)疑：所推測的折返環(huán)結(jié)構(gòu)的一部分實際上完全地穿過質(zhì)膜，并形成了第6跨膜結(jié)構(gòu)域[4，6]。TMEM16A作為一個陰離子通道，它的激活嚴(yán)格地依賴于細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平。但通過檢測TMEM16A的一級結(jié)構(gòu)(即蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序)，并沒有發(fā)現(xiàn)存在常見的鈣離子結(jié)合位點(例如EF手形結(jié)構(gòu)域)。盡管如此，帶有負(fù)電荷氨基酸殘基的多個區(qū)域都可能是潛在的鈣離子結(jié)合位點，例如第3個細(xì)胞內(nèi)環(huán)或EEEEAVK序列等。TMEM16A除了受到細(xì)胞質(zhì)鈣離子的直接調(diào)節(jié)外，也受到其與鈣調(diào)蛋白相互作用的間接調(diào)節(jié)。此外，磷酸化也可能參與TMEM16A通道的門控和調(diào)節(jié)[4]。TMEM16A通道能被胞內(nèi)鈣離子(鈣離子濃度通常在100～600 nM范圍內(nèi))激活產(chǎn)生氯離子電流，其也受到膜電位的影響，即正膜電位引發(fā)激活電流，而負(fù)膜電位引發(fā)失活電流，從而產(chǎn)生外向整流的電流-電壓關(guān)系。這種影響主要源于膜電位的去極化能夠增強(qiáng)通道對鈣離子的敏感性[2-4]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)鈣離子對TMEM16A通道也可能具有抑制作用，特別是在鈣離子濃度高達(dá)微摩爾級別的情況下。該機(jī)制未知，但可能涉及由鈣/鈣調(diào)蛋白激酶II所致的磷酸化[7]。TMEM16A通道有著許多可用的藥理調(diào)節(jié)劑，包括典型的CaCCs阻滯劑(如尼氟滅酸、NPPB、DIDS)、新型的TMEM16A抑制劑(如T16inh-A01、CaCCinh-A01、丹寧酸、丁香酚、苯溴馬隆)以及一種TMEM16A激動劑(Eact)[8-10]。這些藥物除了應(yīng)用于對TMEM16A通道功能的實驗研究中外，還可能有著廣泛的治療應(yīng)用，特別是針對TMEM16A所參與到的病理過程。

TMEM16A分布于人體多種組織器官中，對許多生理和病理過程具有重要意義。其中上皮是TMEM16A表達(dá)和發(fā)揮功能最重要的位置。TMEM16A表達(dá)在氣道上皮細(xì)胞中，并借助其離子轉(zhuǎn)運功能調(diào)節(jié)氣道表面液體水平，這對黏液的水合作用以及移除刺激物和病原體至關(guān)重要[11]。在胰腺和唾液腺的腺泡細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了TMEM16A的表達(dá)。TMEM16A主要參與了這些外分泌腺液體和酶的分泌[12-13]。TMEM16A在腸上皮細(xì)胞頂側(cè)膜表達(dá)和發(fā)揮功能，可能是輪狀病毒感染引起的分泌性腹瀉的病理基礎(chǔ)。TMEM16A的另一個表達(dá)位點是腎小管。研究表明，TMEM16A是一個促進(jìn)多囊腎病進(jìn)展的重要蛋白。TMEM16A還存在于多種組織器官的平滑肌細(xì)胞中，與許多病理生理過程相關(guān)。在一項研究中，TMEM16A參與了哮喘樣條件下的氣道平滑肌細(xì)胞的高反應(yīng)性[14]。在另一項研究中，自發(fā)性高血壓的動脈平滑肌高表達(dá)TMEM16A，其可能參與了依賴血管緊張素II的血管重塑[15]。有動物實驗發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下肺動脈平滑肌細(xì)胞的TMEM16A表達(dá)上調(diào)。依賴TMEM16A的CaCCs活性在肺動脈高壓中也增高。在一些感覺神經(jīng)元的電生理活動中也有TMEM16A的參與。絕大部分背根神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元都能檢測到TMEM16A的免疫染色信號，并且背根神經(jīng)節(jié)的CaCCs電流介導(dǎo)了緩激肽引發(fā)的急性傷害性疼痛[16]。此外，在嗅覺感受神經(jīng)元的單纖毛中以及視網(wǎng)膜的光感受器中都能記錄到CaCCs電流[17]。TMEM16A還參與到腫瘤的發(fā)生中。在被確認(rèn)為CaCCs之前，TMEM16A因為在不同類型的腫瘤中高表達(dá)，所以也被描述成其他名稱，例如胃腸道間質(zhì)瘤蛋白(DOG1)、口腔癌過表達(dá)蛋白2(ORAOV2)和腫瘤擴(kuò)增和過表達(dá)序列2(TAOS2)[18-21]。TMEM16A位于染色體11q13，該區(qū)段是人類腫瘤及相關(guān)不良預(yù)后發(fā)生中最常見的擴(kuò)增染色體區(qū)段之一?，F(xiàn)在TMEM16A還被作為某些特定腫瘤的生物標(biāo)志物[22]。

2 TMEM16A在女性生殖系統(tǒng)中的作用

2.1 在子宮平滑肌中的作用 子宮是一個肌性器官，其肌層甚厚，由成束或成片的平滑肌組成。子宮平滑肌的收縮受激素的調(diào)節(jié)，其收縮活動有助于精子向輸卵管的運送以及經(jīng)血的排出，特別是在分娩時子宮平滑肌能對腦垂體后葉產(chǎn)生的催產(chǎn)素發(fā)生反應(yīng)而收縮，這對胎兒的娩出意義重大。而最近，Bernstein等[23]就研究了 ANO1(即 TMEM16A)和 ANO2(即TMEM16B)在子宮收縮活動中的作用。他們用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)確定了在人和小鼠子宮平滑肌中ANO1和ANO2的表達(dá)。隨后，在小鼠子宮肌層組織中進(jìn)行ANO1和ANO2的免疫組化染色，進(jìn)一步確定了它們的蛋白表達(dá)。功能性的研究表明選擇性阻滯ANO1和ANO2能夠減少小鼠子宮平滑肌的自發(fā)性收縮。此外，ANO1和ANO2通道的阻滯能夠抑制自發(fā)性的和激動劑誘導(dǎo)的瞬時內(nèi)向電流，并消除G蛋白耦聯(lián)受體(催產(chǎn)素)所調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高。這些發(fā)現(xiàn)使ANO1和ANO2成為參與子宮收縮正常生理活動的新通道。同時，阻滯ANO1和ANO2所帶來的強(qiáng)力抑制宮縮的作用提示了我們在體內(nèi)以ANO1和ANO2為目標(biāo)可能阻止自發(fā)性早產(chǎn)進(jìn)程中的宮縮作用，這為完成有效的保胎提供了新的潛在治療靶點。

2.2 在子宮內(nèi)膜癌中的作用 國內(nèi)兩位學(xué)者利用免疫組化方法檢測到了在子宮內(nèi)膜癌組織中存在TMEM16A的表達(dá)，并且子宮內(nèi)膜癌組織中TMEM16A的表達(dá)顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織，與TMEM16A在腫瘤組織中高表達(dá)的結(jié)論相一致；此外，對子宮內(nèi)膜癌樣本不同病理特征的研究結(jié)果顯示，TMEM16A在組織學(xué)分級高的子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)高于組織學(xué)分級低者[24-25]。這些都說明TMEM16A參與了子宮內(nèi)膜癌的惡變和進(jìn)展的病理過程，與疾病的發(fā)生具有相關(guān)性，其機(jī)制可能有如下幾種：①TMEM16A通過激活ERK1/2和cylinD1信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[4]；②TMEM16A可能調(diào)節(jié)EGFR和CAMK II兩條途徑影響下游MAPK、AKT以及SRC信號通路的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[26]；③有關(guān)子宮內(nèi)膜癌的信號通路研究表明雌激素可以通過細(xì)胞膜受體快速激活子宮內(nèi)膜癌的MAPK通路[27]，因此TMEM16A也可能通過激活MAPK信號通路參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程；④也有研究認(rèn)為TMEM16A并非通過細(xì)胞增殖促進(jìn)腫瘤發(fā)展，而是其過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞本身形態(tài)改變，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞粘附能力，促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散、脫離和浸潤[28]。

2.3 在輸卵管平滑肌中的作用 輸卵管在受精過程中有著重要作用，其主要通過管壁平滑肌的收縮來完成對卵子和精子的運輸。Huang等[11]在研究不同組織的平滑肌后，發(fā)現(xiàn)在輸卵管的平滑肌中TMEM16A有顯著的表達(dá)。一個早期的研究表明前列腺素F2α(PGF2α)能夠?qū)е螺斅压芗拥氖湛s增加，其機(jī)制可能在于PGF2α能夠激活磷脂酶C(PLC)-IP3通路和Ca2+動員，這些又能夠激活CaCCs，進(jìn)而引起膜去極化和電壓門控鈣通道的開放[29-30]。由此，我們可以推測作為CaCCs分子基礎(chǔ)的TMEM16A可能參與輸卵管平滑肌的收縮。此外，有報告稱在小鼠輸卵管平滑肌中記錄到了慢波，它來源于一群專門的起搏細(xì)胞——Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICCs)，是引起輸卵管肌層收縮的重要電信號[31]。Dixon等[32]研究了由Tmem16a編碼的CaCCs在輸卵管慢波形成中的作用。他們通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)證實了在輸卵管的所有部分都存在Tmem16a的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。電生理研究顯示兩種藥理特性不同的氯離子通道阻滯劑“9-蒽甲酸”和“尼氟滅酸”都能夠引起膜電位超極化，減少慢波的持續(xù)時間，最終抑制起搏點活動。其中，“尼氟滅酸”還能夠抑制輸卵管肌層中Ca2+波的傳播。在Tmem16a-/-小鼠中能夠觀察到輸卵管慢波活動從一開始就不能發(fā)展起來。這些結(jié)果都說明了TMEM16A對輸卵管ICCs的起搏點活動是必需的。

2.4 在卵巢顆粒細(xì)胞中的作用 卵巢顆粒細(xì)胞能夠產(chǎn)生雌激素，對維持卵泡正常發(fā)育以及調(diào)節(jié)雌性生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能有著重要的作用[33]。一些早期的研究發(fā)現(xiàn)鈣離子依賴的氯離子電導(dǎo)在雞和人的顆粒細(xì)胞(GCs)中存在，并可能參與甾體類激素的合成[34-37]。有研究證實卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)一種氯離子通道——囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運體(CFTR)，它可以通過放大FSH刺激的芳香化酶的表達(dá)量進(jìn)而促進(jìn)雌激素的合成，其機(jī)制主要是以HCO3-依賴的瀑布式反應(yīng)激活核內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶來促進(jìn)芳香化酶的合成[38]。而最近，Sun等[39]也發(fā)現(xiàn)了同樣作為氯離子通道的TMEM16A在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)。在新鮮分離的GCs上用膜片鉗可以檢測到一個外向整流的鈣離子激活的氯離子電流，并且這個電流能被TMEM16A的選擇性抑制劑T16Ainh-A01完全阻斷。在卵巢GCs中抑制TMEM16A的表達(dá)或者使用T16Ainh-A01后能夠促進(jìn)GCs中雌激素的合成；而使用選擇性激動劑Eact后，雌激素的合成被抑制。此外，還發(fā)現(xiàn)在卵巢GCs中由TMEM16A調(diào)節(jié)的ERK1/2的磷酸化可以負(fù)性調(diào)節(jié)芳香化酶的表達(dá)，而芳香化酶是雌激素合成的關(guān)鍵酶。因此，ERK信號通路的激活很可能就是卵巢GCs中TMEM16A下調(diào)雌激素合成的機(jī)制。在小鼠的動情周期中可以觀察到卵巢GCs中TMEM16A的表達(dá)水平在發(fā)情前期和發(fā)情期顯著升高，在發(fā)情后期和發(fā)情間期表達(dá)量明顯下調(diào)。在孕馬血清促性腺激素(PMSG)誘導(dǎo)卵巢GCs中TMEM16A表達(dá)量上調(diào)以后，TMEM16A表達(dá)量在隨后的hCG注射后再一次顯著增加。這些現(xiàn)象都說明，在發(fā)情前期和發(fā)情期，卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)都可以顯著上調(diào)TMEM16A的表達(dá)量，提示它可能參與了LH峰后的排卵過程。在脫氫表雄酮(DHEA)誘導(dǎo)的小鼠多囊卵巢綜合征(PCOS)模型的卵巢中，TMEM16A的表達(dá)量顯著下降，這說明了TMEM16A可能與異常排卵有關(guān)。這些研究為卵泡發(fā)育和排卵調(diào)節(jié)的分子機(jī)制提供了新的思路。

2.5 在卵母細(xì)胞中的作用 兩棲動物的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出各種各樣的離子電導(dǎo)特性，對Na+、K+、Ca2+和Cl-具有選擇性，并被不同機(jī)制所激活，如電壓改變、機(jī)械刺激或細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化[40]。卵母細(xì)胞的陰離子通道包括鈣離子依賴的氯離子通道，如bestrophins和TMEM16A，以及電壓依賴的氯離子通道/轉(zhuǎn)運體，如ClCs。在非洲爪蟾中，當(dāng)卵母細(xì)胞受精后幾乎馬上產(chǎn)生一個快速的防止多精受精反應(yīng)，這就來源于由TMEM16A介導(dǎo)的CaCCs受刺激后引起一個瞬時外向電流，導(dǎo)致細(xì)胞膜電位去極化，這能防止進(jìn)一步的精卵融合[41-42]。TMEM16A除了在蛙類卵母細(xì)胞中的防止多精受精作用，還在最近Courjaret等[42]的研究中展示出調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞形態(tài)的新功能。共聚焦成像的結(jié)果顯示TMEM16A會增加卵母細(xì)胞微絨毛的長度，這個是依靠TMEM16A連接到ERM蛋白和細(xì)胞骨架蛋白實現(xiàn)的。微絨毛的延長反過來就擴(kuò)大了細(xì)胞膜的表面積。值得注意的是，TMEM16A的這個新作用是不依賴于它的離子通道功能的。卵母細(xì)胞的成熟與內(nèi)吞作用介導(dǎo)的微絨毛減少有關(guān)，這一過程對第一極化上皮的形成至關(guān)重要，而第一極化上皮可導(dǎo)致囊胚腔的形成。因此，TMEM16A塑造細(xì)胞膜的作用可能在卵子發(fā)生的過程中有一定的參與。此外，考慮到TMEM16A在富含微絨毛的不同上皮廣泛表達(dá)以及ERM蛋白和細(xì)胞骨架蛋白的功能保守性，這些發(fā)現(xiàn)對上皮微絨毛的調(diào)節(jié)具有巨大的啟示作用，有可能轉(zhuǎn)化到多數(shù)上皮中。

3 展 望

綜上所述，在女性生殖系統(tǒng)中，TMEM16A蛋白的生理特點、生理作用以及與女性生殖系統(tǒng)疾病病理聯(lián)系的研究都已取得了顯著進(jìn)展。當(dāng)前的研究表現(xiàn)出了TMEM16A蛋白在女性生育過程中的潛在功能，這將為今后不孕不育方面的治療提供新的靶點和途徑。同時，我們也應(yīng)該考慮到由于人類組織取材的困難及倫理學(xué)限制，這些研究大部分都是建立在動物模型基礎(chǔ)之上的，對人體TMEM16A缺乏深入的研究，尚有很多問題亟待解決，如：在妊娠狀態(tài)的子宮中，TMEM16A能否調(diào)控子宮平滑肌的收縮；TMEM16A在人正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)是否隨月經(jīng)周期發(fā)生動態(tài)變化；PCOS患者的卵巢顆粒細(xì)胞中TMEM16A的表達(dá)是否下調(diào)等。未來的研究仍需在TMEM16A與女性生殖系統(tǒng)某些生理過程的關(guān)系和調(diào)節(jié)機(jī)制以及特異性阻斷和激活藥物方面進(jìn)行大量深入的探索。隨著研究的不斷增多，人們對TMEM16A的認(rèn)識也將更加全面。

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Research progress of calcium-activated chloride channel TMEM16A in female reproductive system.

WU Kai-lin, XIE Qing-zhen.Reproductive Medicine Center,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

Transmembrane protein 16A(TMEM16A),the molecular basis of calcium-activated chloride channels(CaCCs),is distributed in various tissues and organs of human body and has important significance in many physiological and pathological processes.In recent years,study on distribution and function of TMEM16A in female reproductive system has gradually increased,such as the contraction of uterine smooth muscle,the synthesis of estrogen in ovarian granulosa cells and the regulation of oocyte morphology,all of which suggest the physiological importance of TMEM16A in female reproductive system.This article will review the latest research progress of TMEM16A in the female reproductive system.

Calcium-activated chloride channels(CaCCs);Transmembrane protein 16A;Female reproductive system

R711

A

1003—6350（2017）20—3360—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.20.030

國家自然科學(xué)基金（編號：81471456）

謝青貞。E-mail：qingzhenxie@hotmail.com

2017-02-16)