趙志常， 劉茂柏， 李 彬， 陳瑋媛， 張婧玲， 黃麗雅， 劉 蕊， 林齊立

·論著·

MicroScan WalkAway儀器對碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌檢測能力的評價

趙志常1， 劉茂柏1， 李 彬*， 陳瑋媛2， 張婧玲2， 黃麗雅2， 劉 蕊2， 林齊立2

目的 評價MicroScanWalkAway 96 Plus （MSW） 全自動微生物分析儀在碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（CRE）鑒定與預(yù)警中的指導(dǎo)價值。方法 同時用PCR法和MSW系統(tǒng)檢測福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院實驗室保存的81株CRE。以紙片擴散法和PCR法為金標(biāo)準(zhǔn)，比較該分析儀器對CRE菌株鑒定及預(yù)測是否產(chǎn)碳青霉烯酶的可靠性。結(jié)果 MSW判定CRE的符合率為69.1 %（56/81）。PCR檢測有48株細菌攜帶碳青霉烯類耐藥基因；儀器法檢測這些菌株時，高級專家系統(tǒng)（AES）預(yù)測產(chǎn)碳青霉烯酶的靈敏度為93.8 %，特異度為42.4 %，陽性預(yù)測值為70.3 %，陰性預(yù)測值為82.4 %，準(zhǔn)確度為72.8 %。結(jié)論 MSW系統(tǒng)對CRE具有較強的檢測能力。

MicroScan WalkAway 96 Plus儀器； 碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌； 高級專家系統(tǒng)

碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（CRE）常表現(xiàn)出多重耐藥或廣泛耐藥的特點； CRE形成的機制很多，其中產(chǎn)碳青霉烯酶是主要原因之一[1]。CRE給臨床治療用藥增加了很大的困難，應(yīng)予高度重視，根據(jù)細菌對藥物的敏感性制定治療方案，減少細菌耐藥性的產(chǎn)生，提高治療效果。MicroScan WalkAway 96 Plus （MSW）全自動微生物分析儀可以便捷快速地鑒定藥敏信息，已在臨床廣泛使用。本研究擬探討該系統(tǒng)在CRE檢測和預(yù)測產(chǎn)碳青霉烯酶的可靠性和臨床價值。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

收集2011年8月3日－2012年8月3日福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院通過紙片擴散法確認CRE 81株（CRE為對亞胺培南、美羅培南或多利培南任一耐藥的腸桿菌科細菌）。

1.2 主要儀器與試劑

MicroScanWalkAway 96 Plus 全自動微生物分析儀（德國西門子公司）；SIEMENS NC 50鑒定藥敏卡。

1.3 細菌鑒定與藥敏試驗

以MSW全自動微生物分析儀SIEMENS NC 50鑒定藥敏卡進行細菌鑒定與藥敏試驗，并對儀器高級專家系統(tǒng)（AES）的提示產(chǎn)碳青霉烯酶信息進行統(tǒng)計。SIEMENS NC 50鑒定藥敏卡質(zhì)控菌株根據(jù)儀器系統(tǒng)要求選擇產(chǎn)酸克雷伯菌ATCC 700324和大腸埃希菌ATCC 25922。

1.4 耐藥基因的PCR檢測及基因測序

煮沸法制備細菌DNA模板，參照文獻采用PCR檢測碳青霉烯類耐藥基因（A組KPC、GES、SME、IMI和NMC-A；B組NDM-1、IMP、VIM、SPM和GIM；D組OXA-48），測序陽性產(chǎn)物確定基因型[2]。

1.5 MSW儀器AES性能指標(biāo)

AES是自動化儀器中自帶的軟件程序，可以用來代替有豐富經(jīng)驗的專家審核，該系統(tǒng)能產(chǎn)生自動檢測報告中的技術(shù)錯誤和異常的藥物表型。AES每天審核異常藥敏規(guī)則，使檢驗醫(yī)師可對報告進行修訂或重復(fù)處理。本研究以PCR擴增檢測的碳青霉烯酶基因為金標(biāo)準(zhǔn)，進行AES提示產(chǎn)碳青霉烯酶的相關(guān)性能指標(biāo)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 MSW 檢測CRE菌株對臨床常用抗菌藥物的敏感性

81株CRE菌株對臨床常用抗菌藥物的敏感率和耐藥率，見圖1。

圖1 81株CRE菌株對臨床常用抗菌藥物的敏感率和耐藥率Figure 1 Susceptibility prof le of 81 strains of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae to commonly used antimicrobial agents

2.2 CRE菌株的分布和MSW系統(tǒng)鑒定

CRE菌株分布及MSW系統(tǒng)鑒定見表1。以紙片擴散法為比對標(biāo)準(zhǔn)，MSW判定CRE菌株的符合率為69.1 %（56/81），其中肺炎克雷伯菌的符合率最高，為86.1 %（31/36）；而大腸埃希菌的符合率僅為38.9 %（7/18）。

2.3 PCR和MSW AES系統(tǒng)檢測

81株CRE中碳青霉烯酶陽性菌株經(jīng)PCR證實有48株攜帶產(chǎn)碳青霉烯類耐藥基因，而MSW AES系統(tǒng)提示碳青霉烯酶陽性菌株共64株，見表2。

2.4 PCR基因分型和MSWW 判定

PCR擴增碳青霉烯酶基因及測序結(jié)果的碳青霉烯酶基因型分布見表3。在48株攜帶不同碳青霉烯酶基因型的CPE菌株中，MSW判定為CRE菌株的能力以及AES 檢測碳青霉烯酶陽性的提示情況有所不同，見表4。

表1 CRE菌株的分布和MSW對不同菌種鑒定情況Table 1 Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains identif ed by the MSW system

表2 CRE菌株的PCR提示產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌和MSW提示碳青霉烯酶陽性菌株對比Table 2 Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae strains identif ed by PCR versus the advanced expert system of MicroScan WalkAway 96 Plus

2.5 MSW AES 檢測碳青霉烯酶的參數(shù)指標(biāo)

以PCR擴增及基因測序的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，MSW AES 檢測碳青霉烯酶的靈敏度為93.8 %，特異度為42.4 %，陽性預(yù)測值為70.3 %，陰性預(yù)測值為82.4 %，準(zhǔn)確度為72.8 %，見表5。

3 討論

碳青霉烯類抗生素被認為是目前治療多重耐藥腸桿菌科細菌感染的最有效藥物，然而隨著后抗生素時代的到來，CRE的檢出率呈逐年上升的趨勢[3]，在臨床治療用藥上增加了難度。本研究分離的CRE，分別以紙片擴散法和PCR法檢測基因型為金標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計分析MSW檢測CRE菌株的性能指標(biāo)，探討全自動微生物分析儀對CRE菌株鑒定與預(yù)警的指導(dǎo)價值和臨床意義。

表3 碳青霉烯酶基因型病原菌構(gòu)成Table 3 Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates in terms of carbapenemase genotype

表4 MSW對不同碳青霉烯酶基因型菌株的判定和提示產(chǎn)酶情況Table 4 Performance of MicroScan WalkAway 96 Plus in differentiation of different carbapenemase genotypes of carbapenemresistant Enterobacteriaceae strains

本研究中CRE菌株對臨床常用抗生素耐藥情況嚴重，對頭孢菌素類和頭霉素類耐藥率尤為突出（均＞90 %）。值得關(guān)注的是其對氨基糖苷類抗生素阿米卡星耐藥率最低，提示臨床治療時可適當(dāng)考慮選擇該藥物。此外，收集到的菌株以肺炎克雷伯菌最多，與現(xiàn)階段的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌的分布相符[3-4]。但從CRE菌株的分布數(shù)據(jù)可見CRE已出現(xiàn)在多個腸桿菌科種屬中，這需引起我們的高度重視。MSW判定CRE的符合率為74.1 %，其中大腸埃希菌的符合率較低（38.9 %）。以往研究也發(fā)現(xiàn)MSW在檢測CRE時的靈敏度和特異度有限，且有時也存在漏檢[5-6]。因此，當(dāng)臨床實驗室使用MSW判定待測大腸埃希菌是否為CRE菌株時，應(yīng)考慮結(jié)合使用紙片擴散法或瓊脂稀釋法加以驗證，以確保無漏檢。

表5 MSW AES檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶的參數(shù)指標(biāo)Table 5 Performance of MicroScan WalkAway 96 Plus advanced expert system in predicting carbapenemase production of Enterobacteriaceae strains

MSW AES一般是根據(jù)藥敏結(jié)果中所有第三代頭孢菌素和碳青霉烯類的亞胺培南與厄他培南結(jié)果進行推斷腸桿菌科細菌是否產(chǎn)生碳青霉烯酶。當(dāng)?shù)谌^孢菌素不敏感，且同時亞胺培南或厄他培南不敏感時，儀器則會推斷該菌株產(chǎn)酶。在本研究中MSW AES檢測CRE菌株的碳青霉烯酶陽性提示率比PCR法檢測其中的碳青霉烯酶基因的檢出率高，這可能是因為MSW僅是表型監(jiān)測，其他非基因因素（如生長溫度、pH值等環(huán)境因素）引起的假陽性影響檢出率，也可能與PCR未檢測到的其他當(dāng)前未知碳青霉烯酶基因有關(guān)[7]。

此外，MSW判定為CRE的菌株數(shù)少于AES提示碳青霉烯酶陽性的菌株數(shù)。出現(xiàn)這種矛盾結(jié)果，我們分析可能是由于一些菌株出現(xiàn)碳青霉烯類抗生素中介（如本儀器配套藥敏卡中的3種藥物），因而儀器并未判定為CRE。因此，當(dāng)日常工作中遇到此類矛盾結(jié)果時，我們建議實驗室應(yīng)加貼碳青霉烯類藥敏紙片，如果條件允許，分子生物學(xué)方法（如PCR）也可考慮使用。

MSW及其AES對攜帶有IMP、VIM、NDM-1或KPC的CRE的判定能力均較高（見表4）。但值得注意的是攜帶IMP-8的CRE菌株存在差異，AES預(yù)警信息相對于儀器對CRE直接鑒定上似乎更有優(yōu)勢（93.0 % 對 78.6 %）。這也再次給實驗室一個提醒，實際操作中我們應(yīng)該更加重視AES系統(tǒng)提示信息！

由于本次研究菌株的數(shù)量與菌屬種類有限，且可供參考的國內(nèi)相關(guān)報道較少，因此，有必要使用更多的樣本來減少實驗中的偶然誤差，進一步確認此儀器判定CRE的性能。

總之，MSW和AES預(yù)測CRE菌株快速簡便，靈敏度好，可信度高，適宜在臨床實驗室中常規(guī)使用，但必要時仍需要結(jié)合紙片擴散法，以防止漏檢。

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[4] 胡付品，朱德妹，汪復(fù)，等. CHINET檢測2010年碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細菌的分布特點和藥物敏感性[J].中國感染與化療雜志， 2013， 13（1）： 1-7.

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Evaluation on the performance of Micr oScan WalkAway in detecting carbapenem-resistant Enterobacteriaceae

ZHAO Zhichang, LIU Maobai, LI Bin, CHEN Weiyuan, ZHANG Jingling, HUANG Liya, LIU Rui, LIN Qili. （Department of Pharmacy, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China）

Objective To investigate the performance of MicroScan WalkAway 96 Plus (MSW) system in detection of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE). Methods A total of 81 stock CRE strains were used in this study. Bacterial identif cation and antimicrobial susceptibility test were performed by MSW system. Beta-lactamases genes blaKPC, blaIMP, blaVIM, blaOXA-48and blaNDMwere amplif ed by PCR and subjected to sequencing analysis. Disk diffusion method and PCR were used as gold standard to evaluate the performance and reliability of MSW system in identifying carbapenem-resistant and carbapenemaseproducing Enterobacteriaceae. Results Overall, 69.1 % (56/81) of the Enterobacteriaceae strains were identif ed as CRE by the MSW system. The results of PCR showed that 48 strains were carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. When carbapenemaseproducing Enterobacteriaceae strains were identif ed by the instrument using an advanced expert system, the sensitivity was 93.8 % and specif city was 42.4 %. The positive predictive value was 70.3 %, the negative predictive value was 82.4 % and the predictive accuracy value was 72.8 %. Conclusions The MicroScan WalkAway 96 Plus system has shown good performance in detection of CRE.

MicroScan WalkAway 96 Plus system; carbapenem-resistant Enterobacteriaceae; advanced expert system

R378.2

A

1009-7708 ( 2017 ) 01-0042-04

10.16718/j.1009-7708.2017.01.008

2015-11-16

2016-05-26

國家自然科學(xué)基金（81201328)；福建省高校杰青項目（JA13134）；福建省衛(wèi)計委中青年骨干人才培養(yǎng)項目（2015-ZQN-ZD-15）。

1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，福州 350001；

*檢驗科；2. 福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)與技術(shù)工程學(xué)院。

趙志常（1982－），女，碩士研究生，主要從事細菌耐藥機制研究。

李彬, E-mail:leonlee307@hotmail.com。