程桂雪 劉建華 王玉玨 劉 勇 秦曉松

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院檢驗科，沈陽110004)

血清中抗磷脂酶A2受體特異性抗體的兩種檢測方法比較

程桂雪 劉建華 王玉玨 劉 勇 秦曉松

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院檢驗科，沈陽110004)

目的：比較兩種不同方法檢測特發(fā)性膜性腎病 (Idiopathic membranous nephropathy,IMN) 患者血清磷脂酶A2受體(M-Phospholipase A2 Receptor,PLA2R)抗體檢出率，評價兩種方法檢測抗體對疾病的診斷價值。方法：病例為2014年12月至2015年10月中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院收治的IMN及其他明確病理診斷的入院患者，分為IMN組和非IMN組，整理臨床資料；采用間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)對患者血清抗PLA2R抗體進行檢測。結(jié)果：IFA方法與ELISA方法檢測抗PLA2R抗體的敏感度分別為71.3%、68.5%，特異度均為100%，兩者ROCAUC分別為0.860、0.839，兩種方法的診斷效能無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，且兩種方法有較好的一致性 (κ=0.876)，一致率達93.8%；抗體陽性的患者，易出現(xiàn)血清血白蛋白水平的降低 (P<0.05)；抗體滴度越高患者的低蛋白血癥越嚴重，發(fā)生大量蛋白尿比例越高(P<0.05)。結(jié)論：兩種方法檢測血清中PLA2R抗體均有較高的敏感度和特異度，該抗體可作為IMN患者良好的診斷指標。

特發(fā)性膜性腎??；磷脂酶A2受體；抗體

膜性腎病按病因分為特發(fā)性膜性腎病(Idiopat-hic membranous nephropathy, IMN)和繼發(fā)性膜性腎病(Secondary membranous nephropathy, SMN)。 IMN占膜性腎病的70%～80%，被認為是一種自身免疫性疾病，男女比例約為1.3∶1～2.2∶1[1]。自2009年，Beck等[2]在IMN患者中發(fā)現(xiàn)，腎小球足細胞膜表達的M型磷脂酶A2受體(PLA2R)為IMN致病的靶抗原，且大多數(shù)患者有高水平的PLA2R抗體，這使人們對IMN發(fā)病機制有了更加深入的研究，并且將抗PLA2R抗體的檢測作為IMN診斷及鑒別診斷的主要手段。近年來，涌現(xiàn)出多種PLA2R抗體的檢測方法也多種多樣，如：免疫印跡法、間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence assay, IFA)、可定位激光小珠免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等，使抗PLA2R抗體的檢出更加精確，并逐步應(yīng)用于臨床[2-9]。本研究對IFA法和ELISA法檢測血清抗PLA2R抗體的性能特征進行評價，并分析抗體與臨床表現(xiàn)之間的關(guān)系，為臨床診斷提供更充分的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 IMN組 2014年12月至2015年10月期間我院腎內(nèi)科住院患者143例，入選患者均行經(jīng)皮腎活檢，所有病理標本經(jīng)過光鏡、電鏡、熒光顯微鏡的檢測，確診為膜性腎病，通過整理患者臨床資料，并結(jié)合實驗室檢查，排除感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤及藥物等引起的SMN，而確診為IMN?；颊邩颖狙寰诨颊哌M行腎活檢前留取。

1.1.2 非IMN組 隨機選取同期診斷其他腎臟病理類型51例，其中糖尿病腎病4例，紫癜性腎炎7例，IgA腎病12例，腎小球微小病變型腎病13例、狼瘡性腎炎15例。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 收集所有入組患者清晨空腹狀態(tài)下采集的靜脈血，3 000 r/min，離心10 min。分離血清，并分裝保存于-80℃冰箱待用。

1.2.2 收集臨床資料 收集所有患者的基本信息及病史，包括：性別、年齡、入選距活檢時間、激素和免疫抑制劑使用情況、是否患有高血壓、是否患有糖尿病及其他腎臟疾病；同時收集入選時實驗室檢查信息，包括：肌酐、尿素氮、胱抑素C 、總蛋白、血清白蛋白、24 h尿蛋白、自身抗體檢測、乙肝病毒標志物和乙型肝炎病毒DNA。

1.2.3 間接免疫熒光法定性測定血清抗PLA2R抗體 該方法檢測的試劑盒購自德國歐蒙公司，熒光顯微鏡(Olympus)下觀察結(jié)果。存放于-80℃冰箱的待測血清樣本解凍并混勻，測定時按1∶10稀釋。待測血清與轉(zhuǎn)染PLA2R抗原的細胞孵育，再與FITC標記的羊抗人IgG孵育，操作后封片保存于-20℃冰箱。結(jié)果判定標準：根據(jù)試劑盒說明書，滴度<1∶10，記錄結(jié)果為陰性。熒光結(jié)果由兩位醫(yī)師分別判讀，對有異議的結(jié)果，討論后給出最終結(jié)果。

1.2.4 采用ELISA方法定量測定血清抗PLA2R抗體 該方法檢測的試劑盒購自德國歐蒙公司，酶標儀(Tecan)測量光密度(OD值)及濃度。存放于-80℃冰箱的待測血清樣本解凍并混勻，測定時按1∶101稀釋，試驗操作按照試劑盒內(nèi)的說明書進行。陽性結(jié)果判定標準：根據(jù)試劑盒說明書，抗PLA2R抗體濃度<14 RU/ml,記錄結(jié)果為陰性。

1.2.5 應(yīng)用Image-Pro Plus(IPP)軟件分析熒光圖片 對IFA方法檢測的抗PLA2R抗體的生物膜片的熒光結(jié)果在相同的曝光時間下進行圖片拍攝，通過IPP軟件將熒光圖片轉(zhuǎn)換為灰度圖，再進行黑白逆轉(zhuǎn)，采用指數(shù)光密度曲線讀取生物膜片上熒光染色的SUM AREA和SUM IOD，并計算出平均熒光密度Mean Density=SUM AREA/SUM IOD。生物膜片的平均熒光密度與患者血清樣本中抗體含量成正相關(guān)，從而進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本信息及實驗室檢查結(jié)果比較 納入IMN組患者143例，男88例，女55例，平均年齡(50.92±12.50)歲；非IMN組51例，男23例，女28例，平均年齡(38.71±17.59)歲，基線資料詳見表1。

2.2 兩種方法對血清抗PLA2R抗體檢測結(jié)果及診斷評價 IFA法檢測結(jié)果顯示IMN組143例患者中，抗體陽性者有102例；非IMN組患者數(shù)51例，未檢測到抗體陽性者。該方法測定抗PLA2R抗體的敏感度為71.3%，特異度為100%，準確率79.3%。ELISA法測定抗PLA2R抗體結(jié)果顯示：IMN組143例患者中，抗體陽性者有98例；非IMN組患者數(shù)51例，未檢測到抗體陽性者，該檢測方法的敏感度為68.5%，特異度為100%，準確率76.3%。詳見表2。兩種檢測方法診斷試驗 ROC曲線下面積分別為0.860[95%CI為(0.810～0.910)]、0.839[95%CI為(0.786～0.893)]，見圖1。 兩種診斷試驗的診斷效能比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 IFA法與ELISA法對抗PLA2R抗體檢出率的一致性和差異性的比較 兩種方法對抗體檢出率的一致性達93.8%，其Kappa值為0.876，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義，兩種檢測方法有較高的一致性。對兩種方法差異性檢驗也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表1 IMN組與非IMN組基本資料

Tab.1 Major information between IMN group and non-IMN group

MajorinformationIMNgroupNon?IMNgroupPvaluetvalueSexratio(male/female，number)16∶108∶102053(χ2)Age5092±12503871±175904564Cr(μmol/L)7067±256013860±2242400362158BUN(mmol/L)548±1971135±130500023200CYS?C(mg/L)113±044181±14700043015TP(g/L)4329±6804847±108300033086ALB(g/L)2254±4612627±8620006284024hurineprotein(g/d)658±589583±84205380617eGFR[ml/(min·173m2)]9935±19808155±401000041463

Note：eGFR.estimated glomerular filtration rate.

表2 IFA法和ELISA法檢測血清抗PLA2R抗體診斷試驗結(jié)果評價

Tab.2 Evaluation of diagnostic test detecting serum anti-PLA2R antibodies

TestACCSeSpPV+PV?LR+LR?IFAtest793%713%100%100%560%+∞0280ELISAtest763%685%100%100%526%+∞0322

Note：ACC.Accuracy;Se.Sensitivity;Sp.Specificity;PV+.Positive predictive value； PV-.Negative predictive value；LR+.Positive likelihood ratio;LR.Negative likelihood ratio.

圖1 ROC曲線Fig.1 ROC curve

表3 IFA法與ELISA法抗PLA2R抗體檢出一致性及差異性的比較

Tab.3 Consistency and diversity detecting serum anti-PLA2R antibodies in IFA test or ELISA test

IFAtestPositiveNegativeTotalELISAtestPositive94397Negative98897Total10391194

表4 抗PLA2R抗體陽性組和陰性組基本資料

Tab.4 Basic information in serum anti-PLA2R antibody positive and negative group

ParametersPLA2R+PLA2R-PvalueSexratio(male/female，number)(58/36)94(22/15)370194Age5100±12185097±14310991Cr(μmol/L)71037±24966868±30820653BUN(mmol/L)546±208544±1840996CYS?C(mg/L)118±050104±0280123TP(g/L)4274±7214498±5940990Alb(g/L)2184±4662453±42600021)24hurineprotein(g/d)7064±597578±6310296eGFR[ml/(min·173m2)]9864±199110200±21000991

Note：eGFR.estimated glomerular filtration rate;1)P<0.05 was considered significant.

2.4 IMN組抗PLA2R抗體陽性組與陰性組基線資料比較 在IMN組患者中對抗PLA2R抗體陽性和陰性的患者臨床情況的比較，納入為IFA法和ELISA法檢測抗體結(jié)果一致的樣本，共131例，結(jié)果見表4?？筆LA2R抗體陽性與陰性兩組間，患者年齡、性別、血肌酐、尿素氮、24 h蛋白尿及eGFR在兩組間無統(tǒng)計學差異；但抗體陽性組和陰性組血清白蛋白的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 不同滴度抗PLA2R抗體的IMN患者血清白蛋白、大量蛋白尿情況

Tab.5 ALB and heavy proteinuria status of IMN patients in different anti-PLA2R antibody titer

Antibodytiter(RU/ml)ALB(g/L)Percentageofheavyproteinuria(>35g/d)<142454±4265135%(19/37)14-1002257±4785681%(25/44)>1002117±4506000%(30/50)Pvalue<005<005

表6 不同平均熒光密度下IMN患者血清白蛋白、大量蛋白尿情況

Tab.6 ALB and heavy proteinuria status of IMN patients in different MFI

MFIALB(g/L)Percentageofheavyproteinuria(>35g/d)<00202424±4237179%(28/39)0020-00352212±5178250%(33/40)>00352151±3878571%(42/49)Pvalue<005<005

2.5 IMN患者抗PLA2R抗體滴度與一般實驗室檢查的關(guān)系 不同水平抗體滴度的IMN患者間，血肌酐、尿素氮、胱抑素C及eGFR無統(tǒng)計學差異(P值分別為0.25、0.29、0.31和0.27)；但患者低蛋白血癥及大量蛋白尿的臨床癥狀與該抗體水平有明顯相關(guān)性，即抗體濃度越高，發(fā)生上述兩種癥狀的程度越明顯(P<0.05)，見表5。

2.6 抗PLA2R抗體的熒光密度測定 非IMN組與IMN組兩組進行熒光密度比較，其中非IMN組陽性率為0，而IMN組抗體陽性率達71.3%，表明血清抗PLA2R抗體水平在兩組中的差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。根據(jù)不同平均光密度(Mean fluorescence intensity,MFI)將IMN患者分為熒光密度陰性組(<0.020)、低水平組(0.020～0.035)、高水平組(>0.035)，PLA2R抗體的MFI與血清白蛋白、血肌酐、尿素氮、胱抑素C、eGFR及24 h蛋白尿進行分析，結(jié)果顯示血清白蛋白和24 h蛋白尿的水平都與抗體水平有相關(guān)性(P<0.05)，而與血肌酐、尿素氮、胱抑素C及eGFR 不相關(guān)(P值分別為0.32、025、0.25、0.18)。見表6。

3 討論

目前IMN患者體內(nèi)腎小球靶抗原的發(fā)現(xiàn)使人們對膜性腎病有了新的認識，多種足細胞抗原的發(fā)現(xiàn)，在某種程度上揭示了人膜性腎病的發(fā)病機制?；颊哐逯邪锌乖奶禺愋钥贵w的存在成為膜性腎病診斷及監(jiān)測疾病活動性的生物標志物。本試驗為回顧性研究，收集本次入院時腎臟病理活檢確診為膜性腎病的患者為病例組，其他腎臟病理診斷患者為病例對照組,兩組患者在性別、年齡及腎臟損傷程度上有一定差異,這主要由于每種疾病的發(fā)病人群及腎臟受累的程度不同。近年來文獻報道免疫印跡方法、IFA法及ELISA法等檢測不同種族、地區(qū)的IMN患者血清抗PLA2R抗體的陽性率為52%～82%，本試驗的血清樣本研究結(jié)果的陽性檢出率與文獻報道相符[10-14]，有些研究進一步證實腎組織沉積物中PLA2R檢出率要較血清樣本檢出率高，敏感度強[11]。既往研究中指出在SMN的患者中，血清中抗PLA2R抗體和腎組織中PLA2R抗原的檢出率極低[2,13-15]，在本實驗中納入的51例其他腎病的對照組中，兩種方法均未在血清中檢測出抗PLA2R抗體。作為臨床診斷指標，抗PLA2R抗體檢測具有很高的診斷及鑒別診斷價值。

比較兩種方法的診斷效能，IFA法和ELISA法檢測抗PLA2R抗體敏感性分別為71.3%、68.5%，特異性均為100%，ROCAUC分別為0.860、0.839，兩種方法的診斷效能接近，無差異。在諸多研究中，敏感性指標有一定差異，可能由以下幾種原因造成：①已有文獻報道了機體產(chǎn)生抗PLA2R抗體IgG有不同亞型[4,16]，采用不同測量方法，所測得的抗體含量未能包括機體產(chǎn)生的全部抗體亞型；②除PLA2R外，其他足細胞抗原，如1型血小板反應(yīng)蛋白7A域、陽離子化牛血清白蛋白；以及其他足細胞胞漿蛋白抗原也可能參與疾病的發(fā)生[17-19]；③IMN的疾病進程中，發(fā)生自發(fā)緩解的比率較高，部分研究中的研究對象在納入研究之前，已被活檢診斷為膜性腎病，納入研究時可能進入自發(fā)緩解狀態(tài)；④在發(fā)病過程中由于腎小球損傷引起持續(xù)大量的蛋白尿?qū)ρ褐挟a(chǎn)生的抗體起到了清除的作用，使患者機體中抗體含量下降[20]；⑤IMN組患者可能存在臨床尚未發(fā)現(xiàn)的繼發(fā)因素。早期研究報道腫瘤相關(guān)性MN占MN患者的5%～20%，且大約50%腎臟疾病的診斷先于腫瘤的發(fā)現(xiàn)，從MN診斷到腫瘤發(fā)現(xiàn)平均會延遲1年。兩種檢測方法對抗PLA2R抗體的檢出率在一致性較好。兩種方法在該抗體的檢出率上無差異性。本研究比較兩種方法一致率達93.8%，與以往的報道結(jié)果相近(94%～97%)[4,21,22]。

PLA2R參與的自身免疫反應(yīng)目前被認為是IMN發(fā)病的主要機制，患者體內(nèi)抗體水平與疾病進展密切相關(guān)。將研究中兩種方法檢測結(jié)果一致的IMN組通過抗PLA2R抗體檢測結(jié)果分為陽性組及陰性組，對其臨床資料及實驗室檢測指標進行分析。本試驗結(jié)果顯示IMN患者中抗PLA2R抗體陽性者較抗體陰性者易出現(xiàn)低蛋白血癥的臨床表現(xiàn)。血清中抗體與足細胞表面PLA2R結(jié)合引起腎小球的損傷，大量蛋白質(zhì)經(jīng)尿液流失，使得患者的腎病綜合征癥狀更加明顯。對于臨床癥狀嚴重的患者，未經(jīng)腎臟病理活檢確診前，便使用免疫抑制劑進行治療，該類患者機體內(nèi)抗體水平可因治療而下降[10,23-25]，本次研究中有3個患者在進行腎臟穿刺前使用了免疫抑制劑，且該類藥物的使用可能降低血清中的抗體水平，雖然3個患者的抗體定性檢測為陽性，但其濃度的高低可能由于用藥而有所改變。ELISA方法對抗體進行定量檢測，其檢測結(jié)果表明陽性患者的抗體滴度越高，低蛋白血癥越嚴重，而出現(xiàn)大量蛋白尿的患者比例越高；本研究還通過IFA法檢測抗PLA2R抗體，并利用IPP軟件檢測光密度，進行半定量分析，隨著平均光密度的升高，患者所發(fā)生的低蛋白血癥越嚴重，發(fā)生大量蛋白尿的比例越高，故兩種檢測方法均說明抗體濃度的高低與疾病的嚴重情況相關(guān)[21,26]。

本研究評價了兩種檢測方法對于血清中抗PLA2R抗體的診斷價值，其敏感性、特異性及ROCAUC相近，且具有很高的診斷效能，均可用于IMN的診斷。IFA方法可以完成抗體的定性及半定量檢測，但在結(jié)果的判讀時受主觀因素的影響較大，如果利用IPP軟件分析平均熒光密度，則可有效避免人為因素帶來的誤差。而ELISA可以對抗體進行定量檢測，操作更方便。本研究還發(fā)現(xiàn)定量檢測的抗體滴度與疾病輕重及活動性相關(guān)。為已經(jīng)商品化的兩種檢測方法在臨床上的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有助于臨床對疾病的診斷、鑒別及病情檢測。

本研究還存在以下不足，雖然有研究發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑等藥物治療與抗體的檢出率相關(guān)[10,23-25]，但在本研究中，只對患者進行了藥物使用前的抗體檢測，并未進行長期的監(jiān)測，故還需進行長期隨訪研究，明確其相關(guān)性，并進一步探討抗體滴度變化是否與疾病的緩解相關(guān)。

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[收稿2016-07-19 修回2016-10-09]

(編輯 許四平)

Comparison of two methods to detect M-phospholipase A2 receptor antibodies in serum

CHENGGui-Xue,LIUJian-Hua,WANGYu-Jue，LIUYong,QINXiao-Song.

DepartmentofClinicalLaboratory,ShengjingHospitalAffiliatedtoChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China

Objective:To compare the difference of serum levels of M-phospholipaseA2 receptor(PLA2R) antibodies in patients with idiopathic membranous nephropathy(IMN) detected by two different methods and evaluate the diagnostic value of two methods.Methods: Patients diagnosed as membranous nephropathy and other diseases with biopsy-proven from december 2014 to october 2015 in Shengjing Hospital of China Medical University were enrolled and devided into IMN group and non-IMN group.The serum levels of anti-PLA2R antibody were detected by both indirect immunofluorescence assay(IFA) and enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Results: The sensitivity of IFA and ELISA in IMN were 71.3% and 68.5%,and the specificities of two methods were the same as 100%.The area under ROC curves of anti-PLA2R antibody for IMN diagnosis were 0.860 and 0.839.The diagnostic value of IFA and ELISA was no statistically significant differences in IMN(P>0.05),and the consistency of two methods was better(κ=0.876).The IMN patients of positive anti-PLA2R antibody be susceptible to the low level of serum albumin (P<0.05).The higher levels of PLA2R antibody were linked with the worse hypoproteinemia and the higher rate of nephrotic-range proteinuria in IMN patients.Conclusion: Two methods of detecting sera PLA2R antibody have higher sensitivity and specificity,so the sera anti-PLA2R antibody was a better biomarker in the diagnosis of idiopathic membranous nephropathy.

Idiopathic membranous nephropathy;M-phospholipase A2 receptor;Antibodies

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.016

程桂雪(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事膜性腎病分子診斷方面的研究。

及指導教師：秦曉松(1972年-)，女，博士，教授，主要從事腎病分子診斷方面研究，E-mail：qinxs@sj-hospital.org。

R392

A

1000-484X(2017)02-0242-06