擬微綠球藻生長條件優(yōu)化

季 祥， 喬 巖， 成 杰， 劉鮮艷， 趙昕宇， 鄭添慧， 徐迪華， 蔡 祿

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物質(zhì)能源化利用重點實驗室，內(nèi)蒙古包頭 014010)

擬微綠球藻生長條件優(yōu)化

季 祥1，2， 喬 巖1， 成 杰1，2， 劉鮮艷1， 趙昕宇1，2， 鄭添慧1， 徐迪華1， 蔡 祿1，2

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物質(zhì)能源化利用重點實驗室，內(nèi)蒙古包頭 014010)

采用單因素試驗和正交試驗L16(45)，研究不同濃度的N、P、Fe、Mg以及維生素混合液對擬微綠球藻生長的影響。結(jié)果表明，擬微綠球藻最適生長的條件是f/2培養(yǎng)基中添加0.225 g/L NaNO3、0.015 g/L NaH2PO4·2H2O、0.018 9 g/L FeCl3·6H2O、0.025 g/L MgCl2，1 L維生素混合液體積為0.05 mL。

擬微綠球藻；礦質(zhì)元素；維生素；正交設(shè)計；生長條件

擬微綠球藻是一類屬于真眼點藻綱(Eustigmatophyceae)，近似球形的單細(xì)胞真核生物[1]，具有較高的光合作用效率和油脂含量[2]，長速度快，適合作水生動物的餌料。藻中的多不飽和脂肪酸如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等對水產(chǎn)動物的影響效果明顯[3-5]。但由于擬微綠球藻易受環(huán)境和不同營養(yǎng)鹽等多種條件的影響，其質(zhì)量和產(chǎn)量不穩(wěn)定。在生產(chǎn)過程中資金投入大，成本高，產(chǎn)量和生物量都較低。針對這種情況，本研究對擬微綠球藻的營養(yǎng)鹽含量進(jìn)行單因素試驗和正交試驗，旨在優(yōu)化其生長條件，以使其能滿足微藻現(xiàn)代化的大批量運用。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為擬微綠球藻，內(nèi)蒙古自治區(qū)生物質(zhì)能源利用重點實驗室保存。

1.2 方法

采用f/2培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為0.075 g/L NaNO3、0.005 g/L NaH2PO4·H2O；微量元素溶液是由4.16 g Na2EDTA、3.15 g FeCl3·6H2O、0.01 g CuSO4·5H2O、0.022 g ZnSO4·7H2O、0.01 g CoCl2·6H2O、0.18 g MnCl2·4H2O、0.006 g Na2MoO4·2H2O溶于去離子水中，并定容至 1 000 mL，每1 L培養(yǎng)基取1 mL；維生素混合溶液由0.1 g維生素B1、0.005 g維生素B12、0.005 g生物素溶于去離子水中，并定容至1 000 mL，每1 L培養(yǎng)基取1 mL。

培養(yǎng)基中分別添加NaNO3、NaH2PO4·2H2O、FeCl3·6H2O、MgCl2、維生素混合液，以考察不同濃度N、P、Fe、Mg和維生素混合液對藻生長影響。NaNO3濃度梯度分別為 0.019、0.038、0.075、0.150、0.225 g/L；NaH2PO4·2H2O濃度梯度分別為0.001、0.003、0.005、0.011、0.017 g/L；FeCl3·6H2O濃度梯度分別為0.000 79、0.001 57、0.003 15、0.006 30、0.009 45 g/L；MgCl2濃度梯度分別為1.245、2.491、4.981、9.962、14.943 g/L；維生素混合液加入體積梯度分別為0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mL/L。

為研究N、P、Fe、Mg和維生素混合液濃度對擬微綠球藻生長交互作用，采用5因素4水平正交設(shè)計，各因素水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaNO3濃度對擬微綠球藻生長的影響

氮源是藻類生長的限制因子之一。在藻細(xì)胞中，氮是控制光合作用的元素。當(dāng)?shù)床蛔銜r，光合作用減弱且有利于飽和脂肪酸的合成；但當(dāng)?shù)礉舛冗^高時，微藻生長也會受到抑制，不利于飽和脂肪酸的合成[6-7]。硝酸鹽一直是培養(yǎng)擬微綠球藻的一種普通氮源，不同藻類對氮源的需求量和敏感度不同。NaNO3濃度對擬微綠球藻生長的影響如圖1所示。NaNO3在較低濃度時，由于缺少氮源，導(dǎo)致擬微綠球藻的生長緩慢。在一定范圍內(nèi)，隨著NaNO3濃度的增加，其細(xì)胞數(shù)目呈上升趨勢。相關(guān)分析表明，NaNO3濃度與擬微綠球藻生物量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，當(dāng)NaNO3的濃度為 0.15 g/L 時，擬微綠球藻的D680 nm值最高，說明在此濃度下其細(xì)胞生長量最大，生長狀況最佳。因此，NaNO3最適濃度為 0.15 g/L。

表1 擬微綠球藻生長環(huán)境因素優(yōu)化L16(45)正交試驗設(shè)計

2.2 NaH2PO4·2H2O濃度對擬微綠球藻生長的影響

磷元素是構(gòu)成細(xì)胞膜、ATP、DNA和RNA的必需元素[8]，大多數(shù)藻類貯存磷源的方式為主動吸收[9]。本試驗以NaH2PO4·2H2O作為磷源，對擬微綠球藻生長的影響，結(jié)果如圖2所示。在一定范圍內(nèi)，NaH2PO4·2H2O濃度的增加，促進(jìn)擬微綠球藻對磷的吸收，其細(xì)胞的內(nèi)含物大量增加，細(xì)胞數(shù)目呈上升趨勢。相關(guān)分析可知，NaH2PO4·2H2O濃度與擬微綠球藻生物量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，當(dāng)NaH2PO4·2H2O的濃度為0.011 g/L時，擬微綠球藻的D680 nm值最高，此時磷對擬微綠球藻的影響最顯著。

2.3 FeCl3·6H2O濃度對擬微綠球藻的生長影響

鐵離子是構(gòu)成藻細(xì)胞內(nèi)一些氧化還原酶的輔基，并能以各種形式與蛋白結(jié)合，鐵元素缺乏會影響藻類細(xì)胞的正常代謝[10]。FeCl3·6H2O對擬微綠球藻生長的影響，結(jié)果如圖3所示。FeCl3·6H2O濃度較低時，擬微綠球藻細(xì)胞數(shù)目少，這是因為低濃度的鐵不利于擬微綠球藻的代謝，隨著鐵濃度的增加，擬微綠球藻細(xì)胞數(shù)目在一定范圍內(nèi)呈上升趨勢，當(dāng) FeCl3·6H2O濃度為0.006 3 g/L時D680 nm達(dá)到最大值，說明在此濃度下最適合擬微綠球藻生長。

2.4 MgCl2濃度對擬微綠球藻生長的影響

鎂是構(gòu)成葉綠素的必需元素，在葉綠素合成和光合作用中起著重要作用，應(yīng)異常會影響藻類的生長[11]。MgCl2對擬微綠球藻生長的影響，結(jié)果如圖4所示。MgCl2濃度與擬微綠球藻生物量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，當(dāng)MgCl2在濃度為1.245～2.491 g/L測出的D680 nm值較高，且十分接近，隨著MgCl2濃度不斷增加，D680 nm值出現(xiàn)下降趨勢。表明低濃度的鎂離子促進(jìn)擬微綠球藻的生長，高濃度對擬微綠球藻的生長起抑制作用。

2.5 維生素混合液濃度對擬微綠球藻生長的影響

維生素是影響微藻生長的重要因素之一。維生素混合液包括維生素B1、維生素B12和生物素。維生素B1是常用的藻類生長促進(jìn)劑，維生素B12常作為催化甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶的輔基。維生素混合液濃度對擬微綠球藻生長的影響結(jié)果如圖5所示。1 L培養(yǎng)基維生素混合液的體積量在0.5 mL時，擬微綠球藻的D680 nm值相對較大，此時是維持微藻細(xì)胞生長的最佳條件。1 L 培養(yǎng)基維生素混合液的體積量在1～3 mL，擬微綠球藻D680 nm值下降幅度大，說明這個階段的維生素混合液對微藻的生長有抑制作用。

2.6 5種營養(yǎng)鹽濃度對擬微綠球藻生長影響相互作用和優(yōu)化組合

由表2可知，5種因素對擬微綠球藻生長影響的主次順序為B>A>D>E>C，可見B、A為影響藻細(xì)胞生長的主要因素，磷源的質(zhì)量濃度水平對擬微綠球藻生長的影響最大，其次是氮源質(zhì)量濃度水平對其生長的影響。通過分析5因素的均值可知，5種營養(yǎng)鹽最優(yōu)的水平組合為A2B2C4D2E1，即NaNO3濃度為0.225 g/L，NaH2PO4·2H2O濃度為 0.015 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O濃度為0.018 90 g/L，MgCl2濃度為0.025 g/L，1 L維生素混合液體積為0.05 mL。正交試驗中NaNO3、NaH2PO4·2H2O的優(yōu)化濃度與單因素試驗的結(jié)果較吻合，而鐵、鎂、維生素混合液的最適濃度較單因素試驗低。由于正交試驗考慮了各因子的交互作用，因此后續(xù)試驗均以正交試驗的結(jié)果所得培養(yǎng)基配方進(jìn)行藻體培養(yǎng)，以獲得最大生物量。

表2 擬微綠球藻正交試驗結(jié)果

2.7 優(yōu)化后生長情況測定

擬微綠球藻在優(yōu)化后的培養(yǎng)基與f/2培養(yǎng)基中的生長相比，擬微綠球藻在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中生長情況良好(圖6)，優(yōu)化后擬微綠球藻的生物量在第4天開始超過f/2培養(yǎng)基。

3 結(jié)論

采用單因素和正交試驗，研究了NaNO3、NaH2PO4·2H2O、FeCl3·6H2O、MgCl2以及維生素混合液濃度對擬微綠球藻生長的影響。結(jié)果表明，擬微綠球藻最佳培養(yǎng)基配方為NaNO30.225 g/L、NaH2PO4·2H2O 0.015 g/L、FeCl3·6H2O 0.018 90 g/L、MgCl20.025 g/L，1 L維生素混合液體積 0.05 mL。優(yōu)化后擬微綠球藻的最大生物量(D680 nm)可達(dá)1.544，是優(yōu)化前的1.35倍。通過優(yōu)化，提高了擬微綠球藻的生物量，可以滿足微藻現(xiàn)代化的大批量生產(chǎn)。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.046

2015-12-04

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(編號：2015MS0335)；內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳自然科學(xué)重點項目(編號：NJZZ14162)；大學(xué)生創(chuàng)新基金(編號：2014026)。

季 祥(1978—)，男，內(nèi)蒙古包頭人，副教授，從事生物質(zhì)能、微藻生物技術(shù)研究。E-mail：jixiang@imust.cn。

蔡 祿，教授，博士生導(dǎo)師，從事分子生物學(xué)、生物質(zhì)能源及生物信息學(xué)研究。E-mail：nmcailu@163.com。

S968.41+9

A

1002-1302(2017)02-0154-03

季 祥，喬 巖，成 杰，等. 擬微綠球藻生長條件優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：154-156.