運(yùn)動(dòng)性骨疲勞大鼠血清代謝組學(xué)分析

蘭曉霞覃琨趙宏楊震高宏生趙化冰胡春秀

1武警后勤學(xué)院救援醫(yī)學(xué)系（天津 300309）2天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植食檢測(cè)中心3武警后勤學(xué)院科研部組織計(jì)劃處4武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

運(yùn)動(dòng)性骨疲勞大鼠血清代謝組學(xué)分析

蘭曉霞1覃琨1趙宏2楊震3高宏生1趙化冰1胡春秀4

1武警后勤學(xué)院救援醫(yī)學(xué)系（天津 300309）2天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植食檢測(cè)中心3武警后勤學(xué)院科研部組織計(jì)劃處4武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

目的：用代謝組學(xué)方法篩選運(yùn)動(dòng)性骨疲勞的差異代謝產(chǎn)物，為運(yùn)動(dòng)性骨疲勞的早期篩查提供依據(jù)。方法：20只雌性SD大鼠，8周齡，體重210～250 g，適應(yīng)性訓(xùn)練1周后隨機(jī)分為對(duì)照組（C組，n=10）和模型組（T組，n=10）。對(duì)照組不訓(xùn)練，模型組進(jìn)行遞增負(fù)荷的跑臺(tái)訓(xùn)練，6周訓(xùn)練結(jié)束后，用Instron 5800雙立柱萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)定大鼠脛骨骨剛度判定骨疲勞是否建模成功。血清樣品經(jīng)超高效液相色譜系統(tǒng)（UHPLC）分離后用Triple TOF 5600質(zhì)譜儀（AB SCIEX）進(jìn)行質(zhì)譜分析，應(yīng)用MetaboAnalysis軟件進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析和單維統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：構(gòu)建了正離子和負(fù)離子狀態(tài)下偏最小二乘判別分析（PLS-DA）模型，其模型評(píng)價(jià)參數(shù)（R2，Q2）分別為（1.00，0.78）和（0.92，0.82）。共篩選出21個(gè)差異代謝產(chǎn)物，主要涉及色氨酸、酪氨酸，膽汁酸和磷脂代謝及丙氨酸-葡萄糖循環(huán)。具體來(lái)說(shuō)，與對(duì)照組比較，模型組的L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、甘氨膽酸、牛黃膽酸和牛黃去氧膽酸上調(diào)，L-酪氨酸、L-犬尿氨酸、5-羥基多巴胺、5-羥色胺、吲哚乙酸、前列腺素、膽酸、石膽酸、脫氧鵝膽酸、卵磷脂、溶血磷脂酰膽堿、鞘磷脂下調(diào)。結(jié)論：用代謝組學(xué)方法可初步篩選出運(yùn)動(dòng)性骨疲勞的差異代謝物，其早期診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)有待進(jìn)一步研究。

運(yùn)動(dòng)性骨疲勞；骨剛度；代謝組學(xué)；早期診斷

運(yùn)動(dòng)性骨疲勞[1]是指正常骨在反復(fù)負(fù)荷作用下的微損傷積累，主要表現(xiàn)為隱性疼痛，疼痛部位不具體，運(yùn)動(dòng)時(shí)癥狀加重，停止運(yùn)動(dòng)或運(yùn)動(dòng)負(fù)荷減輕時(shí)疼痛癥狀隨之減輕。累積的疲勞微損傷和過(guò)多的骨重建可進(jìn)一步演變成疲勞性骨折。因此，探索骨疲勞或疲勞性骨折早期診斷方法，就成為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和軍事訓(xùn)練中的一個(gè)非常有意義的研究課題。運(yùn)動(dòng)作為一種生理應(yīng)激，在骨疲勞發(fā)生早期，機(jī)體能量代謝、脂代謝、蛋白質(zhì)代謝和氨基酸代謝可能已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的變化。目前，常規(guī)X線照射對(duì)于應(yīng)力性骨折或骨疲勞的早期診斷靈敏性較低，而核磁、CT等檢查手段又因價(jià)格昂貴而不易作為篩查的常規(guī)手段。代謝組學(xué)[2，3]能直接反映組織的生化狀態(tài)，能夠較靈敏地刻畫生命體生理病理狀態(tài)的變化，用代謝組學(xué)的方法來(lái)研究復(fù)雜疾病的早期診斷和預(yù)防頗具潛力。本研究通過(guò)建立大鼠骨疲勞模型，采用代謝組學(xué)方法篩選骨疲勞差異代謝標(biāo)志物，旨在為建立一種相對(duì)無(wú)損、敏感、簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉的運(yùn)動(dòng)性骨疲勞早篩技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象與分組

選用清潔級(jí)雌性8周齡SD大鼠20只，體重238.53±8.35 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK—（軍）2012—0004]。所有大鼠經(jīng)適應(yīng)性訓(xùn)練1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組（C組，n=10）和模型組（T組，n= 10），對(duì)照組自由飲食，干籠飼養(yǎng)，不進(jìn)行訓(xùn)練，動(dòng)物室自然照明，實(shí)驗(yàn)組采用成都泰盟科技有限公司的FT-200三通道大鼠跑步機(jī)進(jìn)行動(dòng)物訓(xùn)練。

1.2 骨疲勞模型建立與判定

骨疲勞建模訓(xùn)練方案：1次/天，6天/周，第1周25 m/min，60 min/次，坡度0°，以后每周速度增加5 m/ min，至35 m/min不再增加；訓(xùn)練時(shí)間每周依次遞增5、5、10、30、10 min/次，至120 min/次不再增加，坡度每周增加5°，至10°不再增加，共計(jì)訓(xùn)練6周。

模型判定：訓(xùn)練結(jié)束后用10%水合氯醛按0.3 ml/ kg劑量麻醉大鼠，處死后取下左右雙側(cè)脛骨，剔除肌肉組織，用浸滿生理鹽水的紗布包裹。用Instron 5800雙立柱萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，測(cè)定脛骨骨剛度，與對(duì)照組相比骨剛度下降20%作為骨疲勞判定標(biāo)準(zhǔn)[4]。設(shè)定載荷測(cè)量精度0.01 N，位移測(cè)量精度0.001 m，加載速度1.0 mm/min，跨距L=2 mm，預(yù)載3 N，勻速加載直至脛骨標(biāo)本斷裂。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 試劑與儀器

Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀（AB SCIEX）；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀（Agilent）；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf5430R）；FA（Fluka，06450）；色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×150 mm column；乙腈（Merck，1499230-935）；乙酸銨（Sigma，70221）。

1.3.2 血清取樣及處理

血清采樣及儲(chǔ)存：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用10%水合氯醛按0.3 ml/kg劑量麻醉大鼠后，行眶后靜脈叢采血。每只大鼠采血1.5 ml放入5 ml EP管中，常溫靜置30 min，然后4℃靜置1小時(shí)，離心15 min，轉(zhuǎn)速為3500 rpm，取上清液分裝于凍存管中密封，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，待測(cè)。

代謝組學(xué)的樣品處理：代謝組學(xué)分析共采用2組大鼠血清樣本，狀態(tài)為液體，每組10份生物學(xué)重復(fù)樣本。①樣本預(yù)處理：取樣品50 μL，加入200 μL預(yù)冷乙腈，渦旋混合30 s，13000 g 4℃離心15 min，取上清（分裝為100 μL/管，共兩管），真空干燥，凍干粉保存于-80℃待用；樣本制備過(guò)程中，按照上述方法平行制備QC樣本。質(zhì)譜分析時(shí)加入40 μL乙腈水溶液（乙腈：水=8：2，v/v）復(fù)溶，渦旋，13000 g 4℃離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析。②質(zhì)控樣本（QC）的制備：分別取每個(gè)樣本10 μL混合為QC。QC樣本用于測(cè)定進(jìn)樣前儀器狀態(tài)及平衡色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，并用于評(píng)價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中系統(tǒng)穩(wěn)定性。

1.3.3 色譜--質(zhì)譜分析

1.3.3.1 色譜分析

樣品采用Agilent 1290 Infinity LC HILIC超高效液相色譜系統(tǒng)（UHPLC）進(jìn)行分離。柱溫25℃；流速300 μL/min；流動(dòng)相組成A：水+25 mM乙酸銨+25 mM氨水，B：乙腈。梯度洗脫程序如下：0～1 min，為85% B；1～12 min，B從85%線性變化到65%；12～12.1分鐘B從65%線性變化到40%，12.1～15 min，B維持在40%；15～15.1 min，B從40%線性變化到85%，15.1～20 min，B維持在85%。進(jìn)樣量4 μL；整個(gè)分析過(guò)程中樣品置于4℃自動(dòng)進(jìn)樣器中。為避免儀器檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)而造成的影響，采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析。樣本隊(duì)列中每間隔10個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本設(shè)置1個(gè)QC樣品，用于監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

1.3.3.2 QQ--TTOOFF質(zhì)譜分析

分別采用電噴霧電離（ESI）正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。樣品經(jīng)UHPLC分離后用Triple TOF 5600質(zhì)譜儀（AB SCIEX）進(jìn)行質(zhì)譜分析。ESI源條件如下：Ion Source Gas1（Gas1）：60，Ion Source Gas2（Gas2）：60，Curtain gas（CUR）：20，source temperature：600℃，IonSapary Voltage Floating（ISVF）±5500 V（正負(fù)兩種模式）；TOF MS scan m/z range：50-1000 Da，product ion scan m/z range：25-1000 Da，TOF MS scan accumulation time 0.20 s/spectra，product ion scan accumulation time 0.05 s/spectra；二級(jí)質(zhì)譜采用information dependent acquisition（IDA）獲得，并且采用high sensitivity模式，Declustering potential（DP）：±60 V（正負(fù)兩種模式），Collision Energy：35±15 eV，IDA設(shè)置如下Exclude isotopes within 4 Da，Candidate ions to monitor per cycle：10。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard轉(zhuǎn)換成.mzML格式，然后采用XCMS程序進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配（＜25 ppm）和二級(jí)譜圖匹配的方式，檢索實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫(kù)和HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)。

對(duì)XCMS提取得到的數(shù)據(jù)，刪除組內(nèi)缺失值＞50%。采用autoscaling方法進(jìn)行歸一化，然后應(yīng)用MetaboAnalysis軟件進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析和單維統(tǒng)計(jì)分析，包括無(wú)監(jiān)督主成分分析（PCA）、有監(jiān)督偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）、t檢驗(yàn)和變異倍數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨疲勞模型

6周訓(xùn)練結(jié)束后，采用Instron 5800進(jìn)行脛骨的三點(diǎn)彎曲力學(xué)加載，表1顯示對(duì)照組的骨剛度為255.721± 18.113 N/mm，模型組為185.558±15.860 N/mm，t= 5.339，P=0.001，模型組比對(duì)照組的骨剛度下降27.43%，達(dá)到了骨疲勞的診斷界值，提示大鼠骨疲勞建模成功。

表1 大鼠脛骨的骨剛度、彈性模量、最大載荷比較

2.2 血清樣本的典型代謝譜圖

對(duì)照和模型組樣本經(jīng)UHPLC-Q-TOF MS分析后得到的典型TIC圖譜如圖1和圖2所示。

圖1 對(duì)照組樣品HILIC的典型TIC圖譜

圖2 模型組樣品HILIC的典型TIC圖譜

2.3 血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的主成分分析（PPCCAA）

模型組（T）和對(duì)照組（C）組樣本的PCA分析得分圖見(jiàn)圖3，由圖3-A可見(jiàn)正離子模式數(shù)據(jù)在PC1和PC2維圖上T、C組間沒(méi)有明顯的分離趨勢(shì)；由圖3-B可見(jiàn)負(fù)離子模式數(shù)據(jù)在PC1和PC2維圖上T、C組間有一定的分離趨勢(shì)。說(shuō)明模型組大鼠血清在負(fù)離子模式下檢測(cè)的代謝譜發(fā)生了一定改變，但正離子模式下檢測(cè)的代謝譜改變較小。

圖3 T-C組PCA得分圖

2.4 血清代謝組學(xué)偏最小二乘判別分析（PLLSS--DDAA）

用偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測(cè)。同時(shí)通過(guò)計(jì)算變量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）來(lái)衡量各代謝物的表達(dá)模式對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力。所有PLS-DA模型經(jīng)10次循環(huán)交互驗(yàn)證得到的模型評(píng)價(jià)參數(shù)（R2，Q2）列于表2，R2和Q2越接近1表明模型越穩(wěn)定可靠。表2結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)正離子和負(fù)離子模式數(shù)據(jù)建立的PLS-DA模型模型解釋和預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)，模型可靠。

表2 PLS-DA模型的評(píng)價(jià)參數(shù)

2.5 血清代謝組學(xué)單變量統(tǒng)計(jì)分析

采用變異倍數(shù)分析（fold change analysis，F(xiàn)C Analysis）和t檢驗(yàn)單變量分析方法，圖4顯示了以FC＞2.0且P＜0.05作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出的差異代謝物的火山圖。

2.6 差異標(biāo)志代謝物與KKGGEEEE注釋

將同時(shí)具有多維統(tǒng)計(jì)分析篩選標(biāo)準(zhǔn)（VIP＞1）和單變量統(tǒng)計(jì)分析篩選標(biāo)準(zhǔn)（FC＞2.0且P＜0.05）的代謝物作為具有顯著性差異的標(biāo)志代謝物，并將得到的差異代謝物提交到KEGG網(wǎng)站，進(jìn)行相關(guān)通路分析，詳見(jiàn)表3。這21個(gè)差異代謝產(chǎn)物涉及到了氨基酸代謝，膽汁酸代謝，磷脂代謝、丙氨酸-葡萄糖循環(huán)及腸道菌群代謝的改變。其中，氨基酸代謝的差異代謝產(chǎn)物表現(xiàn)為L(zhǎng)-賴氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸上調(diào)，L-酪氨酸，L-犬尿氨酸，5-羥基多巴胺、5-羥色胺吲哚乙酸下調(diào)；膽汁酸代謝的差異代謝產(chǎn)物表現(xiàn)為甘氨膽酸、牛黃膽酸、牛黃去氧膽酸上調(diào)，膽酸、石膽酸和脫氧鵝膽酸下調(diào)；磷脂代謝產(chǎn)物表現(xiàn)為卵磷脂、溶血磷脂酰膽堿和鞘磷脂下調(diào)。另外還有血清氨基葡萄糖、生物素和三氯葡萄糖醛酸下調(diào)。

圖4 T-C組差異代謝物的火山圖

表3 血清顯著差異代謝物及KGEE通路注釋

（續(xù)表3）

3 分析討論

3.1 代謝產(chǎn)物與運(yùn)動(dòng)性骨疲勞

3.1.1 血清 55--HHTT、LL--犬尿氨酸、吲哚乙酸和LL--亮氨酸、LL--異亮氨酸

5-羥色胺是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)[3]長(zhǎng)時(shí)間或力竭運(yùn)動(dòng)均可以使大鼠中腦、紋狀體、下丘腦和海馬的5-HT濃度顯著升高。色氨酸是5-羥色胺、犬尿氨酸、5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）等的重要前體物質(zhì)，犬尿氨酸途徑是色氨酸的主要代謝途徑。本次實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清f-TRP的表達(dá)與對(duì)照組出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別，但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，模型組大鼠L-犬尿氨酸和吲哚乙酸這兩種色氨酸的代謝產(chǎn)物表達(dá)量分別是對(duì)照組的0.40和0.29倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這可能與血清f-TRP通過(guò)血-腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)的量增多，造成其在血液中分解代謝物濃度降低有關(guān)，也可能與大鼠慢性過(guò)度疲勞后機(jī)體自身調(diào)控有關(guān)。模型組大鼠血清犬尿氨酸水平降低，可能還與大部分犬尿氨酸能夠通過(guò)血腦屏障，由血液進(jìn)入腦部，誘發(fā)抑郁癥狀有關(guān)，我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在骨疲勞發(fā)生時(shí)，出現(xiàn)明顯的一系列中樞性運(yùn)動(dòng)疲勞的神經(jīng)癥狀，如對(duì)光、聲、電的刺激不敏感，逃避反應(yīng)能力下降等。

中樞系統(tǒng)中5-HT合成量的多少主要取決于血漿中游離色氨酸（free tryptophan，f-TRP）入腦的含量，而腦內(nèi)f-TRP濃度的高低取決于血漿中f-TRP濃度和異亮氨酸、亮氨酸等支鏈氨基酸（branchedchain amino acids，BCAA）濃度及其比值的高低。就支鏈氨基酸（BACC）而言，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示模型組大鼠L-亮氨酸、L-異亮氨酸表達(dá)量升高，是對(duì)照組的1.68倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明骨疲勞時(shí)，體內(nèi)脂肪大量動(dòng)員。血漿游離脂肪酸濃度升高后，雖然為工作肌和其他器官提供了氧化代謝的底物，也節(jié)省了糖貯備的消耗，但血漿不飽和脂肪酸濃度過(guò)高時(shí)，可以對(duì)肌細(xì)胞膜的鈉泵（鈉離子三磷酸腺苷酶）及肌質(zhì)網(wǎng)的鈣泵（鈣離子三磷酸腺苷酶）的功能產(chǎn)生抑制，兩種酶水解三磷酸腺苷酶的能力減弱，影響肌質(zhì)網(wǎng)對(duì)鈣離子的攝取及肌細(xì)胞膜動(dòng)作電位形成，使肌肉收縮過(guò)程和放松過(guò)程都受到影響[5]，這也是形成運(yùn)動(dòng)性疲勞的重要原因。

在人體實(shí)驗(yàn)中，尤其是訓(xùn)練監(jiān)測(cè)或骨疲勞早期診斷時(shí)，直接進(jìn)行中樞系統(tǒng)的5-HT含量測(cè)定并不可行，體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周的5-HT分屬兩個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng)，但血液等外周組織5-HT的變化也可間接反映腦5-HT的變化，但二者之間到底是什么關(guān)系，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道非常少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠血清中5-HT表達(dá)量是對(duì)照組的0.32倍，出現(xiàn)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），推測(cè)與進(jìn)入腦內(nèi)的f-TRP增多有關(guān)，但由于實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有同時(shí)檢測(cè)腦組織中5-HT的濃度，也不能提供二者關(guān)系的直接證據(jù)。

3.1.2 血清 55--羥基多巴胺、酪氨酸

多巴胺是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，酪氨酸（tyrosine）是一種芳香族氨基酸，是合成兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)[6，7]。白寶豐等發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練可以提高大鼠中腦酪氨酸羥化酶（TH）含量，增加DA的合成量，從而增強(qiáng)了中樞的興奮性，腦內(nèi)多巴胺（DA）與激發(fā)促動(dòng)肌肉協(xié)調(diào)能力及耐力運(yùn)動(dòng)的成績(jī)密切相關(guān)，但隨著運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生，腦內(nèi)多巴胺濃度下降，降低了肌肉活動(dòng)的協(xié)調(diào)性，導(dǎo)致疲勞發(fā)生。但血清中多巴胺濃度與運(yùn)動(dòng)能力關(guān)系的研究罕見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨疲勞時(shí)血清5-羥基多巴胺表達(dá)量均較對(duì)照組下降，是對(duì)照組的0.5倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），是否血清和腦內(nèi)多巴胺水平存在同步變化的關(guān)系，有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠骨疲勞時(shí)血清L-酪氨酸是對(duì)照組的0.46倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這與以往補(bǔ)充酪氨酸可減輕自由基及過(guò)氧化對(duì)機(jī)體的損傷，提高運(yùn)動(dòng)能力，減緩體力疲勞的結(jié)果一致。

3.1.3 血清前列腺素

前列腺素（prostaglandin，PG）是存在于動(dòng)物和人體中的一類不飽和脂肪酸組成的，按其結(jié)構(gòu)的不同可分為A、B、C、D、E、F、G、H、I等類型。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠PGF1和PGF2的表達(dá)量為對(duì)照組的0.28～0.29倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PGF是前列環(huán)素PGI2的無(wú)活性形式，而PGI2是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，一方面抑制前列腺素代謝，另一方面阻滯血小板的聚集釋放，具有抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管的作用。而以花生四烯酸為前體的另一代謝產(chǎn)物血栓素A2（TXA2），其作用恰好相反，可以促進(jìn)血小板聚集，與PGI2一樣，TXA2生物半衰期僅約3 min，迅速代謝生成無(wú)活性的TXB2。因此，可通過(guò)測(cè)定TXB2和PGF的量間接地反映TXA2和PGI2的變化。有研究證實(shí)[8]，給狗添加前列腺素30天，可導(dǎo)致礦物沉積速率的增加，促進(jìn)小梁骨和皮質(zhì)骨的形成，并能增加血清Gla蛋白和堿性磷酸酶的水平；中等強(qiáng)度或有氧運(yùn)動(dòng)，可以使血液中的PGF濃度和PGF/TXB2比值增高，對(duì)于預(yù)防血栓形成所造成的心、腦血管疾病有益[9]，但過(guò)度訓(xùn)練或力竭運(yùn)動(dòng)中，大鼠血漿PGF濃度明顯降低，TXB2濃度明顯增高，TXB2/PGF顯著升高。綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠骨疲勞時(shí)，血小板聚集功能增強(qiáng)，造成組織的缺血缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力和抗疲勞能力下降；另一方面，過(guò)度運(yùn)動(dòng)所致的疲勞感增強(qiáng)，可使機(jī)體停止或減少運(yùn)動(dòng)，這可能是一種機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制。

3.1.4 其他代謝產(chǎn)物

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨疲勞組大鼠膽酸、鵝脫氧膽酸和石膽酸明顯降低，分別是對(duì)照組表達(dá)量的0.34～0.39倍，而血清甘氨膽酸、牛黃膽酸和牛黃去氧膽酸的表達(dá)量分別是對(duì)照組的3.47、3.18和3.07倍，提示骨疲勞發(fā)生時(shí)，肝細(xì)胞發(fā)生了損傷，同時(shí)，膽固醇降解作用加強(qiáng)，印證了運(yùn)動(dòng)的降脂作用[10，11]。模型組大鼠血清的卵磷脂、鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿的表達(dá)量顯著下降，可能與骨疲勞時(shí)引發(fā)自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化程度增加，進(jìn)而對(duì)紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了損害有關(guān)[12]。血清中葡萄糖和生物素表達(dá)降低可能與機(jī)體三大物質(zhì)代謝增加消耗了生物素和糖元有關(guān)。而血清L-賴氨酸表達(dá)增加可能是機(jī)體拮抗中樞性疲勞和機(jī)體自由基氧化損傷的反饋性調(diào)節(jié)。我們還發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清三氯葡萄糖醛酸濃度與對(duì)照組比較顯著下調(diào)（P＜0.05），80%的實(shí)驗(yàn)組大鼠（8/10）出現(xiàn)嚴(yán)重腸脹氣和腸梗阻現(xiàn)象，說(shuō)明大鼠骨疲勞發(fā)生時(shí)，發(fā)生了腸道菌群代謝紊亂。

3.2 代謝產(chǎn)物對(duì)于運(yùn)動(dòng)性骨疲勞的早期診斷價(jià)值

本次骨疲勞建模時(shí)間共計(jì)6周，在建模第3周時(shí)，模型組有2只大鼠就出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能力下降的外周運(yùn)動(dòng)疲勞癥狀，到訓(xùn)練第5周全部大鼠都出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)性外周疲勞癥狀，同時(shí)有3只大鼠出現(xiàn)中樞性運(yùn)動(dòng)疲勞癥狀，到訓(xùn)練第6周所有實(shí)驗(yàn)組大鼠都出現(xiàn)了中樞性運(yùn)動(dòng)疲勞的癥狀，提示外周性和中樞性運(yùn)動(dòng)疲勞可能早于骨疲勞出現(xiàn)。當(dāng)出現(xiàn)外周性和中樞性運(yùn)動(dòng)疲勞后，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷繼續(xù)加載并反復(fù)作用于骨骼，骨骼出現(xiàn)微損傷，當(dāng)這些損傷不斷積累，超過(guò)機(jī)體的修復(fù)能力時(shí)就會(huì)出現(xiàn)骨疲勞，甚至導(dǎo)致骨折[13，14]。

4 總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)骨疲勞大鼠血清中與色氨酸代謝、酪氨酸代謝、磷脂代謝、膽汁酸代謝、磷脂代謝等相關(guān)的21種代謝產(chǎn)物發(fā)生了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化，提示這些代謝產(chǎn)物可作為運(yùn)動(dòng)性骨疲勞的早期篩查的潛在生物標(biāo)志物。

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2016.1.21

院級(jí)重大項(xiàng)目（wjz2007-4）；武警醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金（WBS 200805）

趙化冰，Email：13820664530@163.com；胡春秀，Email：1183345173@qq.com