不同Ca2＋養(yǎng)殖條件下三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織細(xì)胞的鈣含量及其對(duì)碳酸酐酶的影響

周子睿，施志儀，李文娟，尚 朝，尚 攀

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

不同Ca2＋養(yǎng)殖條件下三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織細(xì)胞的鈣含量及其對(duì)碳酸酐酶的影響

周子睿，施志儀，李文娟，尚 朝，尚 攀

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

為了探討三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）在不同鈣離子濃度養(yǎng)殖時(shí)，內(nèi)臟團(tuán)和外套膜細(xì)胞對(duì)環(huán)境中鈣離子的吸收，以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度對(duì)碳酸酐酶的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定了5種鈣離子的環(huán)境濃度（0 mM、0.5 mM、1.25 mM、2 mM、3 mM），采用流式細(xì)胞儀測(cè)定內(nèi)臟團(tuán)和外套膜組織細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，用熒光定量PCR檢測(cè)α－碳酸酐酶基因（HcCA）表達(dá)，并用乙酸對(duì)硝基苯酯的水解間接測(cè)定碳酸酐酶活性，以期能闡明環(huán)境中鈣濃度對(duì)組織細(xì)胞鈣含量的影響，和組織細(xì)胞內(nèi)不同鈣含量與碳酸酐酶基因表達(dá)和酶活性之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，在相同環(huán)境的鈣離子濃度下，活體三角帆蚌的內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞中鈣含量顯著高于外套膜細(xì)胞（P＜0.05），并且表明從0 mM到2 mM濃度，內(nèi)臟團(tuán)和外套膜細(xì)胞內(nèi)的鈣含量顯著上升（P＜0.05），在3 mM濃度時(shí)出現(xiàn)下降（P＜0.05）。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋含量較低時(shí)，HcCA在內(nèi)臟團(tuán)和外套膜中的表達(dá)量均顯著低于細(xì)胞內(nèi)Ca2＋含量較高組（P＜0.05），但細(xì)胞內(nèi)Ca2＋熒光強(qiáng)度為8×104時(shí)達(dá)到飽和且開(kāi)始下降，而HcCA的表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)Ca2＋熒光強(qiáng)度為6×104已經(jīng)最高，并開(kāi)始下降。環(huán)境鈣離子濃度在0mM、0.5mM時(shí)碳酸酐酶活性顯著高于1.25 mM、2 mM、3 mM濃度組（P＜0.05），而且1.25 mM、2 mM、3 mM濃度組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），由此發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶在0.5 mM鈣離子濃度中活性較高但表達(dá)量卻較低，而在1.25 mM和2 mM濃度中表達(dá)量高但活性較低，并且碳酸酐酶外套膜細(xì)胞酶活性在各濃度均顯著高于內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞（P＜0.05）。本研究為三角帆蚌水體最適養(yǎng)殖鈣濃度提供了重要依據(jù)。

三角帆蚌；外套膜；內(nèi)臟團(tuán)；鈣離子；碳酸酐酶

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我國(guó)最主要的淡水珍珠培育品種之一［1］。珍珠和貝殼主要成分均為CaCO3（占95%以上），Ca2＋在維持正常生理功能的同時(shí)也承擔(dān)著珍珠和貝殼相關(guān)的生物礦化的重要作用。因此，研究育珠貝鈣離子相關(guān)的代謝特點(diǎn)對(duì)珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)具有非常重要的意義。目前對(duì)于貝類(lèi)生物礦化及鈣離子的代謝仍是貝類(lèi)育珠的研究熱點(diǎn)。

碳酸酐酶在貝類(lèi)中廣泛存在［2］，在生物礦化中發(fā)揮著重要的作用［3－5］。碳酸酐酶主要通過(guò)催化CO2水解為HCO－3來(lái)參與礦化過(guò)程中CaCO3結(jié)晶的形成，參與了貝殼珍珠層和棱柱層的形成。另有一些研究表明，碳酸酐酶能夠調(diào)節(jié)貝類(lèi)外套膜中Ca2＋的運(yùn)輸［6］。這些研究表明碳酸酐酶既參與了調(diào)控CaCO3結(jié)晶過(guò)程中的HCO－3產(chǎn)生，又參與了為結(jié)晶提供鈣源的運(yùn)輸。在對(duì)合浦珠母貝（Pinctada fucata）的礦化研究中發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶在外套膜組織中的活性與貝殼的形成有密切關(guān)系［7］。顯然，碳酸酐酶研究對(duì)三角帆蚌珍珠形成有重大意義。

近年來(lái)，隨著大型流式細(xì)胞儀以及相應(yīng)流式細(xì)胞術(shù)的興起，為在細(xì)胞層面研究鈣離子的流動(dòng)提供了比激光共聚焦顯微鏡法更加快速、簡(jiǎn)便、靈敏、成本低廉的方法［8］。通過(guò)熒光染料結(jié)合鈣離子，在紫外光或可見(jiàn)光激發(fā)下使指示劑發(fā)出熒光，從而通過(guò)流式細(xì)胞儀快速檢測(cè)熒光強(qiáng)度代表的鈣離子濃度。鈣離子熒光探針Fluo－4／AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的染料，F(xiàn)luo－4／AM穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo－4，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)luo－4若以游離配體形式存在時(shí)幾乎是非熒光性的，但是當(dāng)它與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，具有很強(qiáng)的專(zhuān)一性。該技術(shù)將更準(zhǔn)確地分析細(xì)胞內(nèi)鈣離子的吸收和含量。該技術(shù)手段在其它高等生物中的應(yīng)用已經(jīng)成熟［9］，但是對(duì)于貝類(lèi)，特別是淡水珍珠貝，目前仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合鈣離子探針熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)鈣離子，測(cè)定三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)和外套膜組織細(xì)胞鈣離子含量，用RT-PCR定量法測(cè)定了α－碳酸酐酶（HcCA）的基因表達(dá)量和Western-Blot免疫印跡法測(cè)定蛋白含量，最后用乙酸對(duì)硝基苯酯在碳酸酐酶作用下的水解間接測(cè)定碳酸酐酶的活性，以期能闡明環(huán)境中鈣濃度對(duì)組織細(xì)胞鈣含量的影響，和組織細(xì)胞內(nèi)不同鈣含量與碳酸酐酶基因表達(dá)和酶活性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用蚌前處理

實(shí)驗(yàn)用三角帆蚌取自上海海洋大學(xué)浦東濱海養(yǎng)殖基地。200 ind蚌取回后進(jìn)行內(nèi)臟團(tuán)與外套膜插核手術(shù)，插核手術(shù)使用的珠核經(jīng)貝殼打磨而成。手術(shù)之前將珠核進(jìn)行高壓滅菌干燥。清洗實(shí)驗(yàn)蚌外殼泥土和藻類(lèi)，插核前將其離水放置30～60 min。在每ind實(shí)驗(yàn)蚌的外套膜和內(nèi)臟團(tuán)靠近性腺前端部位分別插入直徑為2.5 mm的珠核，并將制作好的外套膜小片貼在珠核上。取下U型架，插核手術(shù)完成。根據(jù)文獻(xiàn)中的記載，以及本實(shí)驗(yàn)室對(duì)校園周?chē)拥棱}離子檢測(cè)得到大致水體中鈣離子濃度在0.7～1.1 mM范圍內(nèi)，因此將實(shí)驗(yàn)蚌平均分為五組養(yǎng)殖在鈣離子濃度為0、0.5、1.25、2、3 mM的水體中，水溫控制在24℃，每15 d換水一次，每5 d喂食黃豆?jié){10 mL·10 L－1，培養(yǎng)4個(gè)月。取樣時(shí)取出珍珠，切下珍珠附近5 mm×5 mm×3 mm組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

胰蛋白酶、抗生素、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)置于上海生工公司；胎牛血清來(lái)自Gibco公司；Fluo－4／AM采用甲醇溶解后蒸餾水定容（上海翊圣公司）；BAC試劑盒來(lái)自上海生工用于測(cè)定蛋白標(biāo)曲以及樣品蛋白含量；鈣離子標(biāo)準(zhǔn)品用CaCl2· 2H2O配置成150 mM的母液加入水體中；用異丙醇溶解PMSF后加入RIP弱裂解液中裂解剪碎后的組織細(xì)胞，試劑購(gòu)買(mǎi)自上海生工；RT-PCR定量試驗(yàn)中Trizol購(gòu)自Invitrogen；使用M-MLV Reverse Transcriptase（Promega，北京）反轉(zhuǎn)試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA；定量體系中的SYBR Green Supermix為美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；Western-Blot蛋白免疫印跡中的碳酸酐酶一抗（Anti-CAI兔抗）、二抗（HRP羊抗兔），GAPDH（兔抗）一抗、二抗（HRP羊抗兔）均購(gòu)買(mǎi)自上海生工公司。實(shí)驗(yàn)主要使用的儀器有C6流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）、分光光度計(jì)（Thermo）、恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)5810R（Eppendorf）、酶標(biāo)儀（Thermo）、蛋白電泳儀（Bio-Rad）、天能成像系統(tǒng)（天能科技上海公司）、iMageQuant Las 4000成像系統(tǒng)（通用電氣）、PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad）、半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）等。

1.3 三角帆蚌細(xì)胞FLuo-4／AM鈣離子探針?lè)跤?/p>

從不同濃度體系蚌中取出外套膜內(nèi)臟團(tuán)組織各5份，清水沖洗后放入含PBS培養(yǎng)皿中，放入含75%的酒精中消毒30 s，依次放入抗生素濃度為2%、5%、10%，5%、2%的PBS中抑菌除菌，每個(gè)濃度10 min。在5 mL離心管中剪碎加入胰酶37℃水浴消化25min，15min后開(kāi)始取酶液放入切片中觀察消化情況，消化完成后震蕩?kù)o置5 min取2 mL上清分裝于2個(gè)1.5 mL離心管中（共10管，5管試驗(yàn)組，5管對(duì)照組）。加入含血清培養(yǎng)基終止消化后1 200 rpm離心3 min去上清，再用PBS洗滌3次。加入Fluo-4／AM溶液，覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)，震蕩后37℃孵育30 min，加入PBS洗滌細(xì)胞3次，以充分除去染液。重懸細(xì)胞后在37℃培養(yǎng)箱孵育約30 min，以確保AM體在細(xì)胞內(nèi)的完全去酯化作用。PBS溶液、胰酶消化液、孵育液均使用CaCl2調(diào)節(jié)溶液鈣離子濃度與培養(yǎng)時(shí)水體一致。

1.4 流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)

上樣前用DDH2O、1%84消毒液快速上樣2 min以清洗流式細(xì)胞儀液態(tài)系統(tǒng)，在流式細(xì)胞儀中用488 mm激發(fā)，F(xiàn)LI-H熒光通道收集熒光信號(hào)，慢速收集104個(gè)細(xì)胞，每個(gè)樣品上樣前用槍吹打數(shù)次重懸細(xì)胞。

1.5 熒光定量PCR

將不同Ca2＋濃度的外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織取1／2剪碎加入Trizol中勻漿（另外1／2用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)和酶活力測(cè)定），進(jìn)行總RNA提取。提取完畢后，用Nanodrop 2000C（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）分光光度儀檢測(cè)其純度和濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。按照MMLV Reverse Transcriptase的操作要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

根據(jù)NCBI上公布的合浦珠母貝GAPDH基因（KM816643.1）和三角帆蚌HcCA基因（KF206121.1）序列設(shè)計(jì)定量引物［10］（表1）。熒光定量采用CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System平臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先進(jìn)行目的基因（HcCA）和內(nèi)參基因（GAPDH）的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)，然后進(jìn)行目的基因的定量實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系為20μL，包括10μL的2×iQ TM SYBR Green Supermix（Bio-Rad，美國(guó)）、1.0μL cDNA、上下游引物各0.5μL和8.0μL dH2O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1 min；95℃10 s，60℃15 s和72℃20 s，采集熒光40次，72℃7 min，反應(yīng)終止，添加溶解曲線生成程序：95℃到60℃每降0.5℃（5 s）采集一次熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用溶解曲線分析產(chǎn)物專(zhuān)一性，結(jié)果用2－ΔΔCt法進(jìn)行初步數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中R值均大于0.9，相應(yīng)的擴(kuò)增效（E）均在95%～100%之間。

1.6 Western-Blot免疫印跡

1.6.1 組織中蛋白上清液的制備和濃度測(cè)定

將1.5中剩下1／2組織加入RIPA中勻漿，直至裂解液中組織塊消失充分裂解后，12 000 rpm離心5 min，取上清。取部分上清蛋白用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后到0.5 mg·mL－1，然后按照下表（表2）分裝于96孔酶標(biāo)板，用PBS緩沖液補(bǔ)齊至每孔20μL。再分別取待測(cè)蛋白質(zhì)1μL和PBS緩沖液19μL混勻是總體積為20μL，將BCA試劑按照A液（50）∶B液（1）的比例配置BCA工作液向上述每個(gè)孔中加入200μL，在37℃反應(yīng)30 min，在562 nm處測(cè)定吸光度，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本蛋白濃度。

1.6.2 三角帆蚌HcCA抗體篩選

用HcCA蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選比對(duì)，選擇同源性最高的人類(lèi)CAI作為一抗。

1.6.3 Western-Blot檢測(cè)組織中HcCA的含量

按照天根聚丙烯酰胺凝膠試劑盒配置濃度為10%的分離膠和5%的濃縮膠，灌膠后將上樣液和四倍體積5×上樣緩沖液混合于100℃沸水中煮沸5 min，使蛋白變性，冰上驟冷，3 000轉(zhuǎn)· min－1離心1 min。上樣并加入6μL預(yù)染彩色蛋白Marker進(jìn)行電泳，根據(jù)蛋白Marker，判斷目標(biāo)蛋白的位置，然后終止電泳。電泳結(jié)束后在水中撬膠，修膠后將膠浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min。根據(jù)膠的形狀裁剪與膠形狀大小一致的加厚濾紙及PVDF膜，PVDF于無(wú)水甲醇中浸15 s，隨后在半干轉(zhuǎn)印槽中按照“濾紙－膜－膠－濾紙”的順序依次鋪好，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（20 V、30 min）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，用TBS緩沖液全部沖洗PVDF膜，然后轉(zhuǎn)移到已配好的封閉液中，在脫色搖床上室溫?fù)u晃封閉2 h。取出膜，于搖床上用TBST洗膜5min×3次，在孵育袋中加入封閉液稀釋的HcCA抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶2 000），4℃孵育過(guò)夜，用TBST洗膜5 min×3次，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶2 000）和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。最后用TBST洗膜15 min×5次。膜于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑（試劑A∶試劑B＝1∶1）反應(yīng)2 min，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮膜包好PVDF膜，放入iMageQuant Las4000成像系統(tǒng)中曝光，成像。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所用到的PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for the PCR used in the present study

表2 蛋白標(biāo)曲溶液配比表Tab.2 Standard protein solution ratio curve table

將成像系統(tǒng)中的圖像使用Quantity one軟件分析，比較HcCA蛋白與GAPDH蛋白條帶光密度值。

1.7 三角帆蚌碳酸酐酶活力測(cè)定

從上述蛋白裂解液中取出少量作為酶液，隨后在分光光度計(jì)中依次加入1.9mL 15mmol·L－1Tris-H2SO4緩沖液（pH 7.6），0.1 mL的酶液和1 mL 3 mmol·L－1的乙酸對(duì)硝基苯酯，室溫反應(yīng)5 min后在348 nm處用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光值，以不加酶液為空白對(duì)照。酶活定義為：在室溫下，每min水解1μmol乙酸對(duì)硝基苯酯所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

公式為：酶活力（U·gprot－1）＝（測(cè)定乙酸對(duì)硝基苯酯體積－標(biāo)準(zhǔn)乙酸對(duì)硝基苯酯體積）×3／5 ÷樣品中總蛋白含量

準(zhǔn)確稱(chēng)取63 mg乙酸對(duì)硝基苯酯溶于10 mL甲醇中，將溶液以1∶10.6的比例溶于蒸餾水中制成3 mmol·L－1母液在酶標(biāo)儀按下表分別加入試劑，按下表（表3）分別加入試劑，混合均勻，室溫下于348 nm處比色，用相同體積的蒸餾水為空白對(duì)照。

表3 乙酸對(duì)硝基苯酯標(biāo)曲溶液配比表Tab.3 Ratio of acetic acid to nitrobenzene ester

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件ANOVA單因子方差分析顯著性，使用Lsd檢驗(yàn)，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定及水環(huán)境鈣離子濃度對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響

2.1.1 流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)設(shè)門(mén)分析

由于三角帆蚌的開(kāi)放式循環(huán)系統(tǒng)，抗生素不能完全取出細(xì)菌，在分析流式數(shù)據(jù)前應(yīng)先根據(jù)細(xì)胞分群設(shè)門(mén)以排除細(xì)菌及消化過(guò)度的細(xì)胞碎片影響（圖1）。設(shè)門(mén)完成后使用FL1-A對(duì)FL1-H作圖，再次設(shè)門(mén)以排除未完全消化的非單個(gè)細(xì)胞（圖2）。最后用FL1-H對(duì)Count作圖統(tǒng)計(jì)鈣離子含量，以平均熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（圖3）。

圖1 排除細(xì)菌以及細(xì)胞碎片設(shè)門(mén)Fig.1 Set of removing bacteria and cell debris

2.1.2 不同環(huán)境鈣離子濃度對(duì)外套膜細(xì)胞及內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的影響

流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，外套膜細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度在0 mM到2 mM，濃度均呈明顯上升趨勢(shì)（P＜0.05），如圖4所示細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度在2 mM濃度達(dá)到頂峰，而在3 mM濃度出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）。從0 mM到2 mM濃度，熒光強(qiáng)度總體呈上升趨勢(shì)可能是因?yàn)槭艿剿w中總的鈣離子含量影響，3 mM濃度可能由于水體內(nèi)鈣離子含量過(guò)高引起細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，抑制了鈣離子的進(jìn)入。而內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞中鈣離子熒光強(qiáng)度隨濃度變化趨勢(shì)與外套膜細(xì)胞相同，但整體熒光強(qiáng)度大于外套膜細(xì)胞。環(huán)境鈣離子濃度為0 mM時(shí)依然有熒光，鈣的來(lái)源可能是豆?jié){投放。另外，外套膜細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度均低于內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞，差異顯著（P＜0.05）。

圖2 排除非單一細(xì)胞設(shè)門(mén)Fig.2 Set for exclusion of non single cell

圖3 熒光強(qiáng)度Fig.3 Fluorescence intensity

2.2 HcCA在不同環(huán)境鈣離子下的基因相對(duì)表達(dá)和蛋白相對(duì)表達(dá)

2.2.1 HcCA在不同環(huán)境鈣離子下的基因表達(dá)量

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HcCA基因在不同濃度Ca2＋中的相對(duì)表達(dá)模式（圖5）。結(jié)果表明，HcCA基因在實(shí)驗(yàn)中各個(gè)濃度均有表達(dá)，但0 mM與0.5 mM實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量顯著低于1.25、2、3 mM濃度表達(dá)量（除3 mM組內(nèi)臟團(tuán)表達(dá)量，P＜0.05），但在同組織比較中（外套膜、內(nèi)臟團(tuán)）這兩個(gè)濃度組差異不顯著（P＞0.05）。在1.25、2、3 mM濃度組中，濃度呈下降趨勢(shì)，但1.25 mM組與2mM組差異不顯著（P＞0.05），與3mM組不管是內(nèi)臟團(tuán)組織還是外套膜組織表達(dá)量都顯著下降，差異顯著（P＜0.05）。同濃度下不同組織進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有3 mM濃度試驗(yàn)組外套膜與內(nèi)臟團(tuán)表達(dá)量差異顯著（P＜0.05），其它濃度組差異均不顯著（P＞0.05）。

圖4 三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度Fig.4 Ca2＋concentration in the mantle and visceral mass of mussel shell

圖5 三角帆蚌HcCA基因在各個(gè)Ca2＋濃度中的表達(dá)Fig.5 Expression of H.cumingii HcCA gene in various Ca2＋concentrations

2.2.2 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HcCA蛋白的表達(dá)

通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HcCA蛋白的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)中條帶大小結(jié)果如圖6所示，HcCA表達(dá)水平在1.25、2 mM處理組明顯強(qiáng)于其它3個(gè)處理組，0、0.5 mM處理組條帶明顯弱于其它試驗(yàn)組。所有濃度處理組HcCA與GAPDH光密度比如表4所示。

圖6 三角帆蚌HcCA在各個(gè)Ca2＋濃度相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of Hyriopsis cumingii HcCA protein in different Ca2＋concentrations

表4 HcCA與GAPDH的蛋白光密度比Tab.4 Protein light density ratio of GAPDH and HcCA

2.3 不同鈣離子濃度下對(duì)三角帆蚌碳酸酐酶活性影響

以吸光值為橫坐標(biāo)，乙酸對(duì)硝基苯酯的體積為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＝0.998，以吸光值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線做出標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＝0.996，把數(shù)據(jù)帶入酶活性計(jì)算公式得出各濃度外套膜內(nèi)臟團(tuán)組織酶活性。不同鈣離子濃度培養(yǎng)下對(duì)三角帆蚌碳酸酐酶活性影響可以由圖7看出，外套膜及內(nèi)臟團(tuán)中的碳酸酐酶活性在環(huán)境鈣離子濃度為0～0.5 mM時(shí)，均顯著高于1.25～3 mM環(huán)境濃度的活性（P＜0.05），并且1.25、2、3 mM環(huán)境濃度的碳酸酐酶活性是不顯著的（P＞0.05）。而外套膜碳酸酐酶活性在每個(gè)濃度都比內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞高，差異顯著（P＜0.05），與外套膜內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度情況相反。

圖7 不同鈣離子濃度三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)的碳酸酐酶活性Fig.7 Activity of carbonic anhydrase of different Ca2＋concentrations in Hyriopsis cumingii mantle and visceral mass

3 討論

貝殼和珍珠都是貝類(lèi)進(jìn)行鈣代謝后最終以碳酸鈣結(jié)晶形式沉積而成的［11］。環(huán)境Ca2＋濃度對(duì)三角帆蚌的生長(zhǎng)和珍珠質(zhì)的沉積具有十分重要的影響。因此，實(shí)時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)變化，是非常重要的。然而目前己有的研究結(jié)果對(duì)三角帆蚌養(yǎng)殖適宜的環(huán)境鈣離子濃度仍存在較大爭(zhēng)議，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子含量研究也鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)外套膜與內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量在0 mM到2 mM濃度均呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量在2 mM濃度達(dá)到頂峰，而在3 mM濃度時(shí)出現(xiàn)快速下降，差異顯著（P＜0.05）。任崗［10］的研究表明2齡三角帆蚌不管是從體重增重還是從珍珠質(zhì)沉積方面看水中鈣離子濃度在1.25～1.75mM是最適濃度，有利于三角帆蚌生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)環(huán)境鈣離子濃度達(dá)到2 mM時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子接近飽和，在3 mM濃度出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子大幅下降，這可能是任崗研究結(jié)果的原因之一。而從外套膜與內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度相互比較來(lái)看，呈現(xiàn)外套膜胞內(nèi)鈣離子濃度小于內(nèi)臟團(tuán)，而李文娟等［12］研究離體細(xì)胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)外套膜細(xì)胞對(duì)鈣離子吸收遠(yuǎn)高于內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞，這可能是活體內(nèi)與離體后所處環(huán)境造成細(xì)胞對(duì)鈣吸收的影響，使得鈣流入細(xì)胞量有所轉(zhuǎn)變。

碳酸酐酶（Carbonic anhydrase，CA）是一種細(xì)胞內(nèi)催化酶，是目前己知的催化反應(yīng)速率最快的酶之一。單純的CO2水合過(guò)程是十分緩慢的，一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)僅為5×10－2·s－1，但在碳酸酐酶催化下，速率常數(shù)最高可提高到1.6×106· s－1［13－14］，碳酸酐酶可逆催化CO2生成碳酸氫鹽的水合反應(yīng)，在生物體內(nèi)承擔(dān)著多樣的生理學(xué)功能，具有高度的生物學(xué)意義。本研究表明，當(dāng)環(huán)境Ca2＋處于0 mM到0.5 mM濃度較低水平時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋含量受環(huán)境影響而表現(xiàn)為較低（熒光強(qiáng)度低于2×104）時(shí)，HcCA在內(nèi)臟團(tuán)和外套膜中的表達(dá)量也較低，均顯著低于細(xì)胞內(nèi)Ca2＋含量較高的組（P＜0.05），這說(shuō)明過(guò)低的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度會(huì)影響HcCA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。當(dāng)環(huán)境Ca2＋濃度達(dá)到1.25mM濃度時(shí)，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋熒光強(qiáng)度達(dá)到了5×104～6×104，HcCA表達(dá)量達(dá)到最高值（P＜0.05），隨著環(huán)境濃度繼續(xù)上升到2 mM，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋含量繼續(xù)上升（熒光強(qiáng)度達(dá)到6×104～8×104）并達(dá)到了飽和，但發(fā)現(xiàn)HcCA基因及蛋白表達(dá)量并未隨著繼續(xù)上升，反而呈下降趨勢(shì)，但差異不明顯（P＞0.05）。當(dāng)環(huán)境濃度達(dá)到3 mM，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋熒光強(qiáng)度已經(jīng)下降到2×104（外套膜細(xì)胞）、2×106（內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞），HcCA表達(dá)量也隨之下降（P＜0.05），并出現(xiàn)了一個(gè)顯著的不同組織間差異（P＜0.05），這可能暗示著在細(xì)胞內(nèi)Ca2＋達(dá)到飽和前，三角帆蚌機(jī)體中的內(nèi)臟團(tuán)與外套膜間可能存在某種機(jī)制平衡HcCA的表達(dá)，具體原因仍需進(jìn)一步研究。從總體趨勢(shì)看，細(xì)胞Ca2＋含量與HcCA的基因表達(dá)、HcCA蛋白表達(dá)量在0～2 mM存在上升趨勢(shì)，但細(xì)胞內(nèi)Ca2＋熒光強(qiáng)度在8×104時(shí)達(dá)到最大值，轉(zhuǎn)而開(kāi)始下降；而HcCA的表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)Ca2＋熒光強(qiáng)度6×104時(shí)已經(jīng)最高，并隨之開(kāi)始下降。

本研究發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶活性在1.25～3 mM鈣離子濃度時(shí)顯著低于0～0.5 mM濃度（P＜0.05），這與任崗［10］發(fā)現(xiàn)Ca2＋-ATPase的酶活性在鈣離子濃度1～2 mM時(shí)顯著低于其它鈣離子濃度處理組的結(jié)論有相似性。碳酸酐酶是一種催化CO2水解可逆反應(yīng)的Zn2＋結(jié)合金屬酶（CO2＋H2O←→HCO－3＋H＋）。研究表明，CA參與了生物機(jī)體中的多種生理過(guò)程，如呼吸、pH平衡、離子運(yùn)輸、光合作用、脂肪酸和氨基酸的合成以及生物礦化等［15］催化CO2水合的碳酸酐酶是兩種離子的中心，因?yàn)樗峁┛张菪蜌潆x子H＋-ATPase，Ca2＋／H＋交換產(chǎn)生的能量是Ca2＋吸收的電壓依賴(lài)性鈣通道，而CO2水合提供HCO－3內(nèi)源。因此，水化內(nèi)源性CO2形成HCO－3鈣化而氫離子被排出體外，從而導(dǎo)致Ca2＋的持續(xù)吸收［6］。三角帆蚌碳酸酐酶與Ca2＋－ATPase的活性一致性恰好證明了EBANKS等［6］發(fā)現(xiàn)的這一條鈣離子吸收通道。而外套膜中碳酸酐酶活性普遍高于內(nèi)臟團(tuán)說(shuō)明外套膜細(xì)胞的鈣離子交換要多于內(nèi)臟團(tuán)細(xì)胞。但我們從HcCA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在0、0.5 mM組中非常低，有可能是較低的細(xì)胞內(nèi)Ca2＋能激發(fā)HcCA的酶活性，從而形成了一種Ca2＋含量較低時(shí)，酶表達(dá)量較低但酶活力較高；而Ca2＋含量較高時(shí)，酶活力低但酶表達(dá)量高的補(bǔ)充機(jī)制。這仍需進(jìn)一步研究。

本研究采用高靈敏的Fluo-4／AM結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三角帆蚌內(nèi)臟團(tuán)和外套膜細(xì)胞的鈣含量在國(guó)內(nèi)尚屬首次，為研究三角帆蚌體內(nèi)細(xì)胞鈣離子貯存提供了新的方法。

［1］ 張根芳，方愛(ài)萍.浙江淡水珍珠產(chǎn)業(yè)化發(fā)展思考［J］.中國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)，2003：7－8.ZHANG G F，F(xiàn)ANG A P.Thoughts on the industrialization of fresh water pearl in Zhejiang［J］.Chinese Fisheries Economics，2003：7－8.

［2］ NIELSEN S A，F(xiàn)RIEDEN E.Carbonic anhydrase activity in molluscs［J］.Comparative Biochemistry＆Physiology B Comparative Biochemistry，1972（41）：461－468.

［3］ MIYAMOTO H，MIYASHITA T，OKUSHIMA M，et al.A carbonic anhydrase from the nacreous layer in oyster pearls［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996（93）：9657－9660.

［4］ VOIGT O，ADAMSKI M，SLUZEK K，et al.Calcareous sponge genomes reveal complex evolution of αcarbonic anhydrases and two key biomineralization enzymes［J］.Bmc Evolutionary Biology，2014（14）：230.

［5］ NORIZUKI M，SAMATA T.Distribution and function of the nacrein-related proteins inferred from structural analysi［J］.Marine Biotechnology，2008（10）：234－241.

［6］ EBANKS S C，O′DONNELL M J，MARTIN G.Characteriza-tion of mechanisms for Ca2＋andacquisition for shell formation in embryos of the freshwater common pond snail Lymnaea stagnalis［J］.Annals of Nuclear Energy，2010（213）：4092－4098.

［7］ ROY NL，MARIE B，GAUME B，et al.Identification of Two Carbonic Anhydrases in the Mantle of the European Abalone Haliotis tuberculata（Gastropoda，Haliotidae）：Phylogenetic Implications［J］.Journal of Experimental Zoology Part B Molecular＆Developmental Evolution，2012（318）：353－367.

［8］ 高 純，吳劍宏，馮永東，等.多種流式細(xì)胞術(shù)分選凋亡細(xì)胞后共聚焦顯微鏡分析［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005（34）：486－489.GAO C，WU J H，F(xiàn)ENG Y D，et al.Analysis of apoptosis cells by using multiple flow cytometry in the confocal microscopy［J］.Acta Medicinae Universitatis Scientiae Et Technologiae Huazhong，2005（34）：486－489.

［9］ GEEK R，BROWNK W，BISHOPS J，et al.Chemical and physiological characterization of fluo－4 Ca2＋－indicator dyes［J］.Acta Crystallographica，2007（63）：586－589.

［10］ 任 崗.環(huán)境鈣離子濃度影響三角帆蚌珍珠質(zhì)形成的生物礦化機(jī)理研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2013.REN G.Study on the mechanism of the effect of environmental calcium concentration on the formation of pearl in the Pearl Mussel［D］.Hangzhou：Zhejiang University，2013.

［11］ 劉士力，李家樂(lè)，張根芳，等.三角帆蚌稚蚌形態(tài)發(fā)育與生長(zhǎng)特性［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2009（33）：604－09.LIU SL，LIJ L，ZHANG G F，et al.The juvenile of Hyriopsis cumingii morphological development and growth characteristics［J］.Journal of Fisheries of China，2009（33）：604－609.

［12］ 李文娟，施志儀，郝瑩瑩，等.應(yīng)用激光共聚焦顯微技術(shù)研究Ca2＋在三角帆蚌組織內(nèi)的積累與分布［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2011（35）：214－220.LIW J，SHI Z Y，HAO Y Y，et al.Study on the accumulation and distribution of Ca2＋in the tissue of the triangular sail by laser scanning confocal microscopy［J］.Journal of Fisheries of China，2011（35）：214－220.

［13］ CHU-YOUNG K，WHITTINGTON D A，CHANG J S，et al.Structural aspects of isozyme selectivity in the binding of inhibitors to carbonic anhydrases II and IV［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2002（45）：888－893.

［14］ SUN M K，ALKON D L.Carbonic anhydrase gating of attention：memory therapy and enhancement［J］.Trends in Pharmacological Sciences，2002（23）：83－89.

［15］ HENRY R P.Multiple roles of carbonic anhydrase in cellular transport and metabolism［J］.Annual Review of Physiology，1996（58）：523－538.

Calcium content of mantle and visceral tissue cells from Hyriopsis cumingii and its effect on carbonic anhydrase in different Ca2＋culture conditions

ZHOU Zi-rui，SHI Zhi-yi，LI Wen-juan，SHANG Chao，SHANG Pan
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources of Ministry of Agriculture，College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocen University，Shanghai 201306）

To investigate visceral mass and mantle cell absorption of Ca2＋in Hyriopsis cumingii cultured in different Ca2＋concentrations，and the effect of intracellular Ca2＋concentrations on carbonic anhydrase，five kinds of Ca2＋concentrations were set for experiments（0 mM，0.5 mM，1.25 mM，2 mM，3 mM）.The paper used flow cytometry for the determination of content of calcium in the visceral mass and mantle tissue cells，expressed by fluorescence quantitative PCR detection of alpha-carbonic anhydrase gene HcCA，and with acetic acid hydrolysis of p-nitrophenyl for indirect determination of carbonic anhydrase activity to clarify the effect，between different calcium content and carbonic anhydrase gene expression and enzyme activity in cells and tissues.Results showed that in the same environment of Ca2＋concentration，calcium content in the cells of visceral mass was significantly higher than that in mantle cells（P＜0.05），and from 0 mM to 2 mM concentrations intracellular calcium content increased significantly（P＜0.05）.In 3 mM concentration，calcium content decreased（P＜0.05）.At the same time，the expression of HcCA was significantly lower in high Ca2＋concentration group（P＜0.05）.When the intracellular Ca2＋fluorescence intensity reached 8× 104，calcium content reached saturation and began to decline.The expression of Ca2＋in the cells with HcCA fluorescence intensity of 6×104reached the highest and began to decrease.With Ca2＋concentration of 0 mM，0.5 mM，carbonic anhydrase activity was significantly higher than that of 1.25 mM，2 mM，3 mM concentration groups（P＜0.05）and there was no significant difference between 1.25 mM，2 mM，3 mM concentrations groups（P＞0.05）.Therefore，we found that carbonic anhydrase in Ca2＋concentration of0.5 mM showed high activity but the expression was relatively low，while the expression in 1.25 mM and 2 mM concentration was in high volume but low activity and carbonic anhydrase mantle cell enzyme activities in each concentration were significantly higher than those of visceral mass cells（P＜0.05）.This study provides an important basis for the optimal cultured concentration of calcium in freshwater mussel.

Hyriopsis cumingii；mantle；visceral mass；calcium ion；carbonic anhydrase

Q 782

：A

1004－2490（2017）01－0076－09

2016－04－05

國(guó)家自然科學(xué)基金（31201991）；教育部博士點(diǎn)基金（20123104120003）；上海市優(yōu)青項(xiàng)目（ssc11004）

周子睿（1991－），男，湖南人，在讀理學(xué)碩士，生物學(xué)方向。Tel：021－61900437，E-mail：zzr＿19910518＠163.com

施志儀，教授。Tel：021－61900437，E-mail：zyshi＠shou.edu.cn