氧化應(yīng)激相關(guān)基因Nme5在小鼠隱睪中參與生精細(xì)胞凋亡*

賈苗苗，楊夢(mèng)月，尹絲璐，劉 剛

中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生殖與干細(xì)胞工程研究所，長(zhǎng)沙 410013

氧化應(yīng)激相關(guān)基因Nme5在小鼠隱睪中參與生精細(xì)胞凋亡*

賈苗苗，楊夢(mèng)月，尹絲璐，劉 剛△

中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生殖與干細(xì)胞工程研究所，長(zhǎng)沙 410013

目的 觀(guān)察氧化應(yīng)激相關(guān)基因Nme5在隱睪中的表達(dá)變化，探討其在生精細(xì)胞凋亡中的作用。方法 建立單側(cè)隱睪小鼠模型，采用TUNEL結(jié)合形態(tài)學(xué)觀(guān)察確認(rèn)小鼠隱睪模型是否建立成功并分析生精細(xì)胞凋亡情況。采用Real-time PCR、Western blot以及免疫組化分析隱睪手術(shù)后第1、2、3、4、5、6、9和15天與正常側(cè)相比隱睪側(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)基因Nme5 mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示正常睪丸組織中，Nme5在生精上皮周期的Ⅱ～Ⅻ階段均表達(dá)于粗線(xiàn)期初級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子以及長(zhǎng)形精子中；TUNEL結(jié)合形態(tài)學(xué)觀(guān)察表明小鼠隱睪模型構(gòu)建成功；Real-time PCR結(jié)果顯示術(shù)后第4天Nme5 mRNA表達(dá)量輕微上升，第6天顯著下降；Western blot結(jié)果顯示術(shù)后第4天Nme5蛋白開(kāi)始下降，至第9天急劇降低；免疫組化結(jié)果顯示術(shù)后第4～6天隱睪側(cè)Nme5在多核巨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。結(jié)論 正常睪丸組織中Nme5在粗線(xiàn)期初級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子以及長(zhǎng)形精子中都有表達(dá)，參與了從減數(shù)分裂到精子變形的全部過(guò)程，在精子發(fā)生中起重要作用。隱睪狀態(tài)下Nme5在新生圓形精子和由退行性圓形精子細(xì)胞組成的多核巨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激相關(guān)基因Gpx5來(lái)調(diào)控圓形精子細(xì)胞凋亡。

隱睪； Nme5； 凋亡

在哺乳動(dòng)物中精子發(fā)生需要適宜的溫度，隱睪和其他高溫作用可引發(fā)氧化應(yīng)激損傷從而導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡[1]。Nme5(NME/NM23 family member 5)作為一種氧化應(yīng)激相關(guān)基因特異性表達(dá)于小鼠睪丸組織中，參與精子發(fā)生[2]。在生理狀態(tài)下Nme5通過(guò)調(diào)節(jié)包括Gpx5在內(nèi)的抗氧化物酶水平保護(hù)長(zhǎng)形以及圓形精子細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)手術(shù)建立小鼠隱睪模型，觀(guān)察在術(shù)后不同天數(shù)中Nme5的表達(dá)變化，探討其參與隱睪生精細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Nme5兔抗鼠多克隆抗體(Sigma公司)，β-actin鼠抗人單克隆抗體(Sigma公司)，PBS，SP Kit-0017 DAB染色液(鏈霉菌-生物素法，福州邁新生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動(dòng)物及處理

8周齡雄性BALB/C小鼠48只，行單側(cè)隱睪手術(shù)。具體方法為：4%水合氯醛麻醉，將右側(cè)睪丸推入腹腔后縫扎右側(cè)腹股溝管，左側(cè)不做任何處理，作為對(duì)照。所有小鼠均購(gòu)自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(長(zhǎng)沙，中國(guó))，室內(nèi)溫度(23±2)℃；光照周期12 h∶12 h(7：00～19：00光照)。

1.3 TUNEL法檢測(cè)

采用TUNEL法檢測(cè)生精細(xì)胞凋亡。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后PBS清洗3次，其余操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陰性對(duì)照未加末端轉(zhuǎn)移酶。光鏡下胞核著棕黃色者為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，每個(gè)睪丸組織切片選取12個(gè)曲細(xì)精管斷面(每個(gè)小鼠生精上皮階段隨機(jī)選取1個(gè)曲細(xì)精管斷面)，計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞百分率即為凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)Nme5 mRNA相對(duì)表達(dá)量

按Trizol試劑盒(Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)提取睪丸總RNA，取1.5 μg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟(Roche公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。內(nèi)參基因?yàn)楦视腿?3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。引物由上海生工公司合成，Nme5上游引物：5′-CAGTTTAGTAGCCAAGGAG-3′，下游引物：5′-ATGGGTTCAATAATCACG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為150 bp；GAPDH上游引物：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCAACAGC-3′，下游引物：5′-CGAGTTGGGATAGGGCCTCTCTTGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為231 bp。按SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(Roche公司)說(shuō)明書(shū)設(shè)定反應(yīng)程序：95℃、15 s預(yù)變性，59℃、15 s，72℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)。mRNA相對(duì)表達(dá)水平分析采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法；每組樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果按照2-ΔΔCt取均值，計(jì)算與內(nèi)參GAPDH比較的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 免疫印跡檢測(cè)Nme5蛋白相對(duì)表達(dá)量

加RIPA裂解液，電動(dòng)勻漿機(jī)提取睪丸總蛋白。BSA法分光光度計(jì)測(cè)定總蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，100 ℃煮沸變性10 min，儲(chǔ)存于-20℃。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的丙烯酰胺分離膠，恒壓100 V、90 min分離蛋白，總蛋白上樣量為40 μg檢測(cè)Nme5蛋白相對(duì)表達(dá)水平，內(nèi)參為β-actin蛋白。采用半干電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜，恒流轉(zhuǎn)膜26 min。5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，一抗(Nme5和β-actin稀釋體積比分別為1∶100與1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜。TBST洗脫一抗，二抗(稀釋體積比為1∶4 000)室溫孵育1 h。TBST洗脫二抗后，化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)顯影。用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6 免疫組化染色

將睪丸組織常規(guī)石蠟包埋，制成厚3～4 μm的連續(xù)切片，切片經(jīng)脫蠟、水化以及微波爐內(nèi)抗原修復(fù)后，運(yùn)用抗生素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法(SP法)進(jìn)行酶組織化學(xué)染色(一抗：兔抗鼠多克隆抗體Nme5，按1∶100稀釋)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，0.1%鹽酸乙醇分化，自來(lái)水返藍(lán)。經(jīng)梯度乙醇脫水干燥后用中性樹(shù)脂封片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Nme5在成年小鼠睪丸組織中的表達(dá)模式

精子發(fā)生是一個(gè)循環(huán)過(guò)程，包含了生精細(xì)胞從精原干細(xì)胞到成熟精子的一系列發(fā)育階段。在小鼠睪丸中精子發(fā)生的一個(gè)循環(huán)被叫做一個(gè)生精上皮周期。生精上皮周期根據(jù)生精細(xì)胞的發(fā)育階段被分為12個(gè)階段(StageⅠ-Ⅻ，圖1A)，每個(gè)階段都含有特定種類(lèi)和發(fā)育階段的生精細(xì)胞，如圖1B所示。我們通過(guò)免疫組化結(jié)合形態(tài)學(xué)觀(guān)察Nme5在8周齡成年小鼠生精上皮周期中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示Nme5在生精周期第Ⅱ～Ⅻ階段的粗線(xiàn)期(P)初級(jí)精母細(xì)胞，Ⅺ階段的雙線(xiàn)期(D)初級(jí)精母細(xì)胞，Ⅻ階段的減數(shù)分裂細(xì)胞(M)，Ⅰ～Ⅷ階段的圓形精子細(xì)胞(S1-8)，以及Ⅰ～Ⅻ階段的長(zhǎng)形精子(S9-16)中表達(dá)。因此Nme5在生精周期中的表達(dá)模式為從減數(shù)分裂間期的粗線(xiàn)期初級(jí)精母細(xì)胞開(kāi)始到成熟精子結(jié)束(圖1B)。

2.2 TUNEL檢測(cè)隱睪細(xì)胞凋亡水平

TUNEL為晚期細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法，全稱(chēng)為末端脫氧核苷酸介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定。檢測(cè)原理為標(biāo)記凋亡細(xì)胞斷裂DNA的3’-OH末端，利用DAB顯色系統(tǒng)顯色。我們利用TUNEL凋亡檢測(cè)隱睪手術(shù)后1、2、3、4、5、6、9以及15 d睪丸組織的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如下。

2.2.1 凋亡指數(shù)的分析 TUNEL結(jié)果顯示隱睪小鼠正常側(cè)與隱睪側(cè)都出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，但隱睪側(cè)凋亡細(xì)胞比例高于正常側(cè)，并且隨著隱睪天數(shù)增加隱睪側(cè)生精細(xì)胞凋亡率顯著增加。凋亡指數(shù)結(jié)果顯示術(shù)后1 d正常側(cè)凋亡指數(shù)為(0.10±0.06)%，隱睪側(cè)凋亡指數(shù)為(2.80±0.28)%,高于正常側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后1～3 d隱睪側(cè)凋亡指數(shù)沒(méi)有明顯變化，穩(wěn)定在2.8%～3.9%之間，第4天顯著上升為(15.6±1.91)%(P<0.05)，第9天達(dá)到(44.0±1.08)%(P<0.05)。

A:IHC檢測(cè)不同生精階段Nme5表達(dá)(×100)；B：Nme5生精上皮周期表達(dá)模式圖；支持細(xì)胞(St)；精原細(xì)胞(Sg)；細(xì)線(xiàn)前期精母細(xì)胞(PI)；細(xì)線(xiàn)期初級(jí)精母細(xì)胞(L)；粗線(xiàn)期初級(jí)精母細(xì)胞(P)；偶線(xiàn)期初級(jí)精母細(xì)胞(Z)；終變期初級(jí)精母細(xì)胞(D)；減數(shù)分裂中的細(xì)胞(M)；次級(jí)精母細(xì)胞(sSc)；精子細(xì)胞的不同發(fā)生階段(S1～16)；中間型精原細(xì)胞(In)；B型精原細(xì)胞(B)；不同階段精子細(xì)胞(1～16)；Bar=10 μm圖1 Nme5在成年小鼠生精上皮周期中的表達(dá)模式Fig.1 Expression pattern of Nme5 in seminiferous epithelium of adult mice at different stages of spermatogenesis

2.2.2 睪丸中凋亡細(xì)胞類(lèi)型的分析 隱睪手術(shù)后處于不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞逐步發(fā)生凋亡，術(shù)后1～3 d隱睪側(cè)只有少量生精上皮Ⅰ階段的圓形精子和Ⅻ階段的分裂期初級(jí)精母細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖2a～d)。術(shù)后4～6 d凋亡的生精細(xì)胞數(shù)目以及種類(lèi)都明顯增加，生精上皮Ⅰ～Ⅻ階段都有大量圓形精子、長(zhǎng)形精子以及初級(jí)精母細(xì)胞發(fā)生凋亡。術(shù)后第4天生精上皮Ⅵ～Ⅷ階段的圓形精子出現(xiàn)退行性病變,相互融合形成多核巨細(xì)胞，但這些多核巨細(xì)胞并未出現(xiàn)凋亡陽(yáng)性信號(hào)。術(shù)后第6天多核巨細(xì)胞數(shù)目增加并且出現(xiàn)凋亡陽(yáng)性信號(hào)(圖2e～f)。術(shù)后9～15 d生精細(xì)胞大量凋亡，生精小管管腔內(nèi)未見(jiàn)圓形精子、長(zhǎng)形精子和多核巨細(xì)胞，只剩余少量初級(jí)精母細(xì)胞、精原干細(xì)胞以及支持細(xì)胞(圖2g～h)。

a:正常對(duì)照；b～h:隱睪手術(shù)后的不同時(shí)期，分別為術(shù)后1 、2 、3、4、6、9、15 d，箭頭所示為多核巨細(xì)胞；Bar=10 μm圖2 TUNEL凋亡檢測(cè)隱睪小鼠睪丸組織Fig.2 Expression of NME5 in testes of mice with cryptorchidism by TUNEL

2.3 Nme5 mRNA在隱睪側(cè)睪丸組織中的表達(dá)

選取隱睪手術(shù)后1、3、4、5、6、9和15 d小鼠每組5只，抽提正常側(cè)與隱睪側(cè)睪丸組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用Real-time PCR檢測(cè)相對(duì)正常側(cè)，隱睪側(cè)Nme5隨著隱睪天數(shù)增加表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示術(shù)后第1天隱睪側(cè)Nme5的mRNA表達(dá)量輕微上升，在第4天的時(shí)候達(dá)到最高值約為正常側(cè)的1.6倍(P<0.05)。術(shù)后第5天Nme5的mRNA表達(dá)量開(kāi)始下降約為正常側(cè)的0.7倍，在第9天的時(shí)候急劇下降變?yōu)檎?cè)的0.04倍(P<0.01)(圖3)。

與正常側(cè)比較，*P<0.05；n=5圖3 Real-time PCR檢測(cè)單側(cè)隱睪手術(shù)后隱睪側(cè)Nme5的mRNA相對(duì)正常側(cè)表達(dá)量的變化Fig.3 Expression of Nme5 mRNA in testes of mice with unilateral cryptorchid by quantitative real-time PCR

2.4 Nme5蛋白在隱睪側(cè)睪丸組織中的表達(dá)

為了研究Nme5在隱睪中的蛋白表達(dá)，取隱睪手術(shù)后1、3、4、5、6、9以及15 d小鼠每組3只，抽提蛋白利用Western blot技術(shù)檢測(cè)隱睪側(cè)Nme5的蛋白表達(dá)量隨著隱睪天數(shù)的變化。結(jié)果顯示隱睪手術(shù)后1～3 d與正常側(cè)相比隱睪側(cè)Nme5的蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，一直到術(shù)后第4天顯著下降為正常側(cè)的0.4倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第15天隱睪側(cè)Nme5的蛋白表達(dá)量急劇下降，為正常側(cè)的0.07倍(圖4)。

與正常側(cè)比較，*P<0.05；n=3圖4 Western blot檢測(cè)單側(cè)隱睪手術(shù)后Nme5蛋白表達(dá)量的變化Fig.4 Expression of Nme5 protein in testes of mice with unilateral cryptorchid by Western blotting

2.5 Nme5蛋白在隱睪手術(shù)后不同生精細(xì)胞中的表達(dá)

為了明確隱睪手術(shù)后生精細(xì)胞中Nme5蛋白的表達(dá)量以及分布是否發(fā)生變化，我們利用IHC技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)了隱睪手術(shù)后1、2、3、4、6、9和15 d Nme5蛋白在睪丸中的表達(dá)模式。

術(shù)后1～3 d隱睪側(cè)生精細(xì)胞凋亡并不明顯，只有部分Ⅰ階段的圓形精子和Ⅻ階段的分裂期初級(jí)精母細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，凋亡指數(shù)維持在2.8%～3.9%。這一時(shí)期的免疫組化結(jié)果顯示：與正常側(cè)相比隱睪側(cè)Nme5的分布發(fā)生顯著變化，隱睪側(cè)Nme5則在Ⅰ階段的圓形精子和Ⅻ階段的分裂期初級(jí)精母細(xì)胞中均表達(dá)增強(qiáng)(圖5a～d)。

術(shù)后4～6 d隨著隱睪天數(shù)增加，生精小管管腔內(nèi)凋亡的生精細(xì)胞逐漸增加，凋亡指數(shù)從3.9%上升到15.6%，生精上皮Ⅵ～Ⅷ階段的生精小管管腔內(nèi)出現(xiàn)多核巨細(xì)胞。術(shù)后4 d Nme5蛋白在還未發(fā)生凋亡的多核巨細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)(圖5e～f)，并持續(xù)強(qiáng)表達(dá)于術(shù)后第6天的凋亡的多核巨細(xì)胞中。

術(shù)后9～15 d生精細(xì)胞大量凋亡，Nme5在初級(jí)精母細(xì)胞中有微弱表達(dá)(圖5g～h)。

a：正常對(duì)照；b～h：隱睪手術(shù)后的不同時(shí)期，分別為1、2、3、4、6、9、15 d，箭頭所示為多核巨細(xì)胞；Bar=10 μm圖5 IHC檢測(cè)不同時(shí)期隱睪小鼠睪丸組織Nme5的表達(dá)Fig.5 Immunolocalization of Nme5 in testes after cryptorchidism at different stages

3 討論

3.1 Nme5在小鼠生精細(xì)胞中的定位

精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，主要包括3個(gè)階段：有絲分裂，即精原干細(xì)胞的自我增殖；減數(shù)分裂，即初級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)線(xiàn)期、偶線(xiàn)期、粗線(xiàn)期、雙線(xiàn)期、次級(jí)精母細(xì)胞最終形成圓形精子；精子形成，即圓形精子變形為長(zhǎng)形精子并逐漸釋放入生精小管管腔最終排出體外[4]。有文獻(xiàn)[1]報(bào)道，Nme5在生精細(xì)胞中的表達(dá)具有階段和生精細(xì)胞特異性。他們觀(guān)察到在生精上皮Ⅻ階段的晚期精子細(xì)胞里Nme5蛋白的量要高于其在其他類(lèi)型的生精細(xì)胞中的表達(dá)量。但在本實(shí)驗(yàn)中Nme5在小鼠睪丸中的表達(dá)沒(méi)有明顯的階段或生精細(xì)胞特異性。Nme5從減數(shù)分裂間期開(kāi)始表達(dá)，到精子變形結(jié)束，最后定位于成熟精子尾部。這種表達(dá)模式表明Nme5可能參與生精細(xì)胞減數(shù)分裂以及精子變形這兩個(gè)重要的精子發(fā)生過(guò)程，并與成熟精子的運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)。

3.2 Nme5參與熱應(yīng)激狀態(tài)下的生精細(xì)胞凋亡

氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞DNA損傷被認(rèn)為是隱睪中引起生精細(xì)胞凋亡的主要原因[1]。超氧化物歧化酶1(superoxided ismutasel，SOD1)是生物體內(nèi)最主要的抗氧化酶之一，敲除SOD1基因后，小鼠生精細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，對(duì)熱損傷的抵抗能力下降，在對(duì)睪丸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性高溫作用后，凋亡的生精細(xì)胞數(shù)目明顯增加[5]。Ahotupa與Peltola等[6-7]認(rèn)為隱睪后生精細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化物明顯增加，抗氧化物酶活力則有所降低，注射氧化酶抑制劑黃嘌呤可以減輕隱睪中生精細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果提示氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了高溫引發(fā)的生精細(xì)胞凋亡。

為了探究氧化應(yīng)激相關(guān)基因Nme5是否參與隱睪狀態(tài)下的生精細(xì)胞凋亡，以及參與了哪些發(fā)育階段的生精細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)手術(shù)獲得小鼠單側(cè)隱睪模型，觀(guān)察Nme5的mRNA以及蛋白在隱睪組織中的表達(dá)模式。

3.2.1 熱休克狀態(tài)凋亡指數(shù)和細(xì)胞類(lèi)型 手術(shù)誘導(dǎo)隱睪后隨著隱睪天數(shù)增加不同類(lèi)型的生精細(xì)胞逐次發(fā)生凋亡。之前的相關(guān)研究結(jié)果顯示在小鼠的隱睪中首先發(fā)生凋亡的生精細(xì)胞是初級(jí)精母細(xì)胞和圓形精子[8-10]。本實(shí)驗(yàn)中隱睪側(cè)生精細(xì)胞凋亡指數(shù)從術(shù)后第1天起就明顯增加，發(fā)生凋亡的細(xì)胞類(lèi)型主要是生精上皮階段Ⅰ的新生圓形精子和階段Ⅻ的初級(jí)精母細(xì)胞，在術(shù)后1～3 d內(nèi)生精細(xì)胞凋亡指數(shù)維持在2.8%～3.9%之間沒(méi)有顯著增加，凋亡的細(xì)胞類(lèi)型也沒(méi)有明顯變化。但術(shù)后第4天生精細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著上升達(dá)到15.6%，發(fā)生凋亡的生精細(xì)胞類(lèi)型也有所增加，包括生精上皮Ⅰ～Ⅻ階段的圓形精子、長(zhǎng)形精子以及初級(jí)精母細(xì)胞。這些結(jié)果顯示不同類(lèi)型的生精細(xì)胞對(duì)熱刺激的耐受性并不完全相同，新生圓形精子和處于分裂期的初級(jí)精母細(xì)胞對(duì)熱刺激最為敏感，其他類(lèi)型的生精細(xì)胞對(duì)高溫的耐受性要好于這2種細(xì)胞。但劉防等[11]發(fā)現(xiàn)在大鼠隱睪中最先發(fā)生凋亡的生精細(xì)胞是變形期的精子細(xì)胞，然后才是圓形精子和初級(jí)精母細(xì)胞。這表明不同類(lèi)型的生精細(xì)胞對(duì)高溫的耐受性在不同哺乳動(dòng)物中有所不同。

3.2.2 Nme5 mRNA和蛋白的表達(dá)量變化 與正常側(cè)相比隱睪側(cè)Nme5的mRNA和蛋白的表達(dá)量在隱睪手術(shù)后1～3 d內(nèi)沒(méi)有明顯變化，6 d時(shí)顯著下降。這可能與隱睪側(cè)的生精細(xì)胞在1～3 d內(nèi)沒(méi)有發(fā)生明顯凋亡，而在第6天大量凋亡相關(guān)。1～3 d內(nèi)生精細(xì)胞凋亡指數(shù)維持在2.8%～3.9%，凋亡細(xì)胞所占總細(xì)胞比例較少，所以盡管免疫組化結(jié)果顯示Nme5蛋白分布發(fā)生變化，在凋亡細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，但是由于凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞比例較少，隱睪側(cè)Nme5的蛋白總量相對(duì)正常側(cè)并沒(méi)有發(fā)生明顯改變。術(shù)后第6天生精細(xì)胞凋亡指數(shù)上升到24%，圓形精子和初級(jí)精母細(xì)胞大量凋亡，這些凋亡的生精細(xì)胞從生精小管管腔內(nèi)脫落后被排出睪丸，最終導(dǎo)致隱睪側(cè)與正常側(cè)相比，表達(dá)Nme5基因的細(xì)胞比例顯著下降。所以盡管部分生精細(xì)胞中Nme5呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，但與正常側(cè)相比Nme5的總蛋白量呈下降趨勢(shì)。

3.3 Nme5蛋白在不同類(lèi)型生精細(xì)胞的表達(dá)變化

在不同的隱睪天數(shù)中Nme5的蛋白在圓形精子中的分布變化與圓形精子凋亡的情況相一致。隱睪初期1～3 d生精上皮Ⅰ階段的新生圓形精子和Ⅻ階段的初級(jí)精母細(xì)胞發(fā)生凋亡，Nme5在這2種細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)。隱睪中期即隱睪手術(shù)后第4～6天生精上皮Ⅵ～Ⅷ階段的退行性圓形精子相互融合形成多核巨細(xì)胞，Nme5在其中強(qiáng)表達(dá)。這些結(jié)果表明，Nme5可能與隱睪中高溫引發(fā)的圓形精子凋亡相關(guān)，其機(jī)制可能與Nme5的抗氧化作用有關(guān)。

隱睪手術(shù)后高溫導(dǎo)致生精細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，為了保護(hù)生精細(xì)胞免受氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷，大量的GPX、抗壞血酸以及維生素E等抗氧化物質(zhì)聚集在凋亡的生精細(xì)胞中清除氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的大量活性氧[12]。Gpx5作為其中的一種重要的抗氧化物質(zhì)參與抑制活性氧誘導(dǎo)的生精細(xì)胞凋亡，而氧化應(yīng)激相關(guān)基因Nme5則被認(rèn)為通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化物質(zhì)Gpx5來(lái)抑制Bax介導(dǎo)的生精細(xì)胞凋亡[13]。所以Nme5在隱睪圓形精子中的高表達(dá)很有可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Gpx5在內(nèi)的抗氧化物質(zhì)水平來(lái)保護(hù)圓形精子免受氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷，從而抑制隱睪狀態(tài)下的圓形精子的凋亡。

綜上所述，Nme5與正常的小鼠精子發(fā)生密切相關(guān)，參與了減數(shù)分裂以及精子變形這2個(gè)重要的精子發(fā)生過(guò)程。并且在高溫引發(fā)的圓形精子凋亡過(guò)程中，Nme5可能通過(guò)調(diào)節(jié)Gpx5在內(nèi)的圓形精子細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)水平來(lái)參與調(diào)控圓形精子細(xì)胞凋亡。同時(shí)以上結(jié)果也提示我們?cè)陔[睪中不同類(lèi)型的生精細(xì)胞所參與的凋亡通路可能并不完全相同，進(jìn)一步研究生精細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，將會(huì)對(duì)我們治療由隱睪等因素導(dǎo)致的男性不育有重要意義。

[1] Hwang K C，Ok D W，Hong J C，et al.Cloning，sequencing，and characterization of the murine nm23-M5 gene during mouse spermatogenesis and spermiogenesis[J].Biochem Biophys Res Commun，2003，306(1)：198-207.

[2] Jung K Y，Yon J M，Lin C，et al.Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase is involved in the maintenance of male fertility under cryptorchidism in mice[J].Reprod Toxicol，2015，57(5)：73-80.

[3] Lacombe M L，Milon L，Munier A，et al.The human Nm23/nucleoside diphosphate kinases[J].J Bioenerg Biomembr，2000，32(3)：247-258.

[4] Bellve A R，Cavicchia J C，Millette C F.Spermatogenic cells of the prepuberal mouse：Isolation and morphologicalcharacterization[J].J Cell Biol，1977，74(1)：68-85.

[5] Paul C，Murray A A，Spears N，et al.Asingle，mild，transient serotal heat stress causes DNA damage，subfertility and impairs formation of blastoeysts in mice[J].Reproduction，2008，136(1)：73-84.

[6] Ahotupa M，Huhtaniemi I.Impaired detoxification of reactive oxygen and con-sequent oxidative stress in experimentally cryptorchid rat testis[J].Biol Reprod，1992，46(6)：1114-1118.

[7] Peltola V，Huhtaniemi I，Ahotupa M.Abdominal position of the rat testis is associated with high level of lipid peroxidation[J].Biol Reprod，1995，53(5)：1146-1150.

[8] Hou W，Hu J，Li Y，et al.Altered expression of NDRG2 in the testes of experimental rat model of cryptorchidism[J].Urology，2010，75(4)：985-991.

[9] Ogi S，Tanji N，Yokoyama M，et al.Involvement of Fas in the apoptosis of mouse germ cells induced by experimental cryptorchidism[J].Urol Res，1998，26(1)：17-21.

[10] Shikone T，Billig H，Hsueh A J.Experimentally induced cryptorchidism increases apoptosis in rat testis[J].Biol Reprod，1994，51(5)：865-872.

[11] 劉防.大鼠實(shí)驗(yàn)性隱睪形態(tài)學(xué)觀(guān)察及Hsfl、Hsf2和Tdag51對(duì)精母細(xì)胞凋亡的影響[D].北京：協(xié)和醫(yī)學(xué)部.2011.

[12] Chaki S P，Misro M M，Ghosh D，et al.Apoptosis and cell removal in the cryptorchid rat testis[J].Apoptosis，2005，10(2)：395-405.

[13] Choi Y J，Cho S K，Hwang K C，et al.Nm23 mediates round and elongated spermatid survival by regulating GPX-5 levels[J].FEBS Lett，2009，583(8)：1292-1298.

(2016-09-21 收稿)

NME/NM23 Family Member 5 is Involved in Apoptosis of Germ Cells in Testis of Mice with Cryptorchidism

Jia Miaomiao，Yang Mengyue，Ying Siluetal

InstituteofReproductionandStemCellEngineering，SchoolofBasicMedicalScience，CentralSouthUniversity，Changsha410013，China

Objective We aimed to assess the functional significance of Nme5 in testis of mice with cryptorchidism.MethodsExperimental unilateral cryptorchidism mouse model was established.Whether the model was established successfully was confirmed by DNA end labeling(TUNEL)and morphological observation，and apoptotic characteristics of spermatogenic cells were analyzed.The expression levels of Nme5 mRNA and protein were spatiotemporally analyzed in testes 1，2，3，4，5，6，9 and 15 day(s)after modeling in mice by quantitative real-time PCR and Western blotting.Immunohistochemical analysis was used to detect changes of Nme5 in response to heat-stress from cryptorchidism.Results Morphological studies have shown that at the normal side of testes Nme5 are localized in primary spermatocytes and spermatids at stage Ⅱ～Ⅻ of eminiferous tubules.Under cryptorchidism，Nme5 mRNA was slightly increased at the 4th day and significantly decreased at the 6th day while its protein was slightly reduced in testes at the 4th day and greatly reduced at the 9th day.However，immunohistochemical staining showed that Nme5 protein was up-regulated in multinucleated giant cells and degenerative spermatids in testes at the 4-6th day.Conclusion Nme5 is expressed in first spermatocyte，round spermatid and long sperm at pachytene stage，is involved in all the process from meiosis to sperm deformation，and plays an important role in spermatogenesis.In mice with cryptorchidism，Nme5 is up-regulated in multinuclear giant cells(neonatal round sperm and degenerative round sperm cells)；apoptosis of round sperm cells is regulated probably through regulating oxidative stress related gene Gpx5.

cryptorchidism； Nme5； apoptosis

*湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.13JJ2007)

賈苗苗，女，1991年生，碩士研究生，E-mail：826639890@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：616778747@qq.com

R697

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.008