水貂中大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌三重熒光PCR方法的建立

，，，

（1. 山東大學生命科學學院，山東濟南 250100；2. 山東省動物疫病預防與控制中心，山東濟南 250022；3. 威海市動物疫病預防控制中心，山東威海 264200）

水貂中大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌三重熒光PCR方法的建立

王貴升1，2，尹斐斐3，田夫林2，王金寶1

（1. 山東大學生命科學學院，山東濟南 250100；2. 山東省動物疫病預防與控制中心，山東濟南 250022；3. 威海市動物疫病預防控制中心，山東威海 264200）

依據(jù) GenBank 中大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌的部分已知序列，選取大腸桿菌的uidA基因、肺炎克雷伯氏菌的khe基因和不動桿菌的secE基因，利用Primer Premier 5設計引物，選出擴增序列的3對引物及相應的Taqman探針，uidA、khe、secE探針5'端分別標記FAM、HEX、CY5熒光發(fā)射基因，3'端標記BHQ1淬滅熒光基因。通過優(yōu)化反應條件，建立一種同時檢測大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌的診斷方法。特異性和敏感性試驗顯示，該方法能特異地檢測大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌，其最低檢測限分別為2×10-1CFU/μL、9.2×10-1CFU/μL和4.3×10-1CFU /μL。整個檢測擴增在2小時內(nèi)完成。該結(jié)果表明本試驗所建立的三重熒光定量PCR方法的靈敏度、重復性及特異性均較好，可用于同時快速檢測三種病原菌。

大腸桿菌；肺炎克雷伯氏菌；不動桿菌；熒光定量PCR

近年來，隨著毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展與資源約束的矛盾日趨嚴重，隨之也帶來了多種動物共患病的易發(fā)、高發(fā)和頻發(fā)，抗生素濫用，以及飼料源耐藥基因擴散等問題，而細菌性疫病已經(jīng)成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題之一。尤其是大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、不動桿菌能夠穿過毛皮動物的血腦屏障，致死率很高，給養(yǎng)殖戶帶來嚴重的經(jīng)濟損失[1-4]。因此，為了提高診斷檢測的準確性和及時性，建立快速檢測和鑒定大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌這三種細菌的方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1菌株來源

文中所涉及的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）、大腸桿菌（Escherichia coli）、不動桿菌（Acinetobacter）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、 弗式檸檬酸桿菌（Freundii Citrobacter）、沙門氏菌（Salmonella）均為2012年1月至2014年7月從發(fā)病水貂的肝、肺、腦中分離鑒定的。以上菌株除了肺炎克雷伯氏菌陽性對照保存于中國微生物菌種保藏普通微生物中心（登記入冊編號11222）外，其余均保存在山東省動物疫病預防與控制中心。

1.2主要試劑與儀器

TSA瓊脂、TSB肉湯培養(yǎng)基，10×PCR 反應液、Taq酶、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（25 mmol/L），均購自寶生物工程（大連）有限公司；細菌DNA柱式提取試劑盒，購自北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

細胞計數(shù)板；顯微鏡；生化培養(yǎng)箱；熒光定量PCR儀（羅氏公司生產(chǎn)）；Centrifuge 5417R臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司生產(chǎn)）；生物安全柜（海爾公司生產(chǎn)）。

1.3引物及探針設計

分別選取大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌的基因保守區(qū)，設計出相應引物及探針（表1）。引物和探針均由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，使用前用滅菌超純水配成10 μmol/L的濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物及探針信息

1.4核酸提取

參照北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)的細菌DNA柱式提取試劑盒說明書提取核酸。

1.5熒光PCR體系建立

反應條件的優(yōu)化，建立25 μL檢測體系，10 μmol/L引物及探針的加入量分別為0.6 μL、0.8 μL、1 μL、1.2 μL 、1.5 μL；25 mmol/L MgCl2的加入量分別為1 μL、1.2 μL、1.4 μL、1.6 μL、1.8 μL、2 μL；25 mmol/L dNTP的加入量分別為0.5 μL、1 μL、1.5 μL 、2 μL、2.5 μL；Taq酶的加入量分別為0.1 μL、0.2 μL、0.3 μL、0.4 μL、0.5 μL。反應程序的優(yōu)化中分別試驗退火步驟為50 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、65 ℃ 1 min。

1.6菌液濃度的調(diào)整

選取經(jīng)鑒定純化的水貂源大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌各1株，分別挑單個菌落于10 mL無菌試管中過夜搖菌，得原菌液，做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8十進位倍比稀釋。取稀釋好的10-6、10-7、10-8倍三種細菌的菌液各200 μL，接種于TSA瓊脂上，用無菌的涂布器均勻涂布后，每個稀釋度、每種細菌做3個重復，待平板干燥后放于37 ℃烘箱中培養(yǎng)12 h，然后進行菌落計數(shù)。取3組細菌計數(shù)的平均數(shù)為最終活菌計數(shù)的結(jié)果，乘以稀釋倍數(shù)，再除以0.2。

1.7熒光PCR特異性試驗

選取經(jīng)鑒定純化的水貂源大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌各1株，分別挑單個菌落于10 mL無菌試管中過夜搖菌，得原菌液，各取200 μL于1.5 mL離心管中，共3份菌液。同時將實驗室保存的3株綠膿桿菌、3株弗式檸檬酸桿菌、3株沙門氏菌，共9株細菌，復蘇于TSA瓊脂上，培養(yǎng)出單個菌落后，挑取單個菌落于裝有TSB肉湯的10 mL離心管中，過夜搖菌。將3株綠膿桿菌、3株弗式檸檬酸桿菌、3株沙門氏菌的核酸及大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌菌液，采用北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司的柱式提取試劑盒提取核酸，運用建立好的熒光PCR方法進行檢測。

1.8熒光PCR靈敏性試驗

各取1.7中復蘇并稀釋到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的大腸桿菌菌液、肺炎克雷伯氏菌菌液、不動桿菌的菌液200 μL各1份，放入1.5 mL離心管中，共21份200 μL菌液。采用北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司的柱式提取的試劑盒，參照說明書提取21份菌液的核酸。將稀釋濃度相同的3種細菌的核酸各取10 μL后充分混合，最后形成7份不同稀釋度的3種細菌混合核酸。把不同稀釋度的3種細菌混合核酸作為熒光定量PCR反應的模板，熒光定量PCR反應采用15 μL反應液，10 μL模板，共25 μL的體系。

1.9熒光PCR重復性試驗

取1.7中復蘇的3種菌液（原菌液）各200 μL，即取10株大腸桿菌菌液各200 μL于10個不同的1.5 mL離心管中，10株肺炎克雷伯氏菌菌液各200 μL于10個不同的1.5 mL離心管中，10株不動桿菌菌液各200 μL于10個不同的1.5 mL離心管中。采用北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司的柱式提取的試劑盒，參照說明書提取30份菌液的核酸。在10株大腸桿菌的核酸、10株肺炎克雷伯氏菌的核酸、10株不動桿菌的核酸中，各隨機挑選其中的1株，將3種細菌的核酸混合，最后形成10份3種細菌混合核酸。把3種細菌混合核酸作為熒光定量PCR反應的模板，熒光定量PCR反應采用15 μL反應液，10 μL模板，共25 μL的體系。

2 結(jié)果

2.1反應條件的優(yōu)化

摸索反應條件，建立了25 μL的反應體系：10 μmol/L的K1-F 1 μL；10 μmol/L的K1-R 1 μL；10 μmol/L的 T1 1 μL；10 μmol/L的 K2-F 1 μL；10 μmol/L的K2-R 1 μL；10 μmol/L的T2 1 μL；10 μmol/L的K3-F 1.1 μL；10 μmol/L的K3-R 1.1 μL；10 μmol/L的T3 1.1 μL；10×PCR 2.2 μL；25 mmol/ L的MgCl21.8 μL；25 mmol/L的dNTP 2 μL；Taq酶 0.3 μL；核酸10 μL。

優(yōu)化后的程序為：第一階段，預變性50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min；第二階段，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 60 sec，共40個循環(huán)，最后40 ℃ 10 sec。在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時收集熒光。

2.2菌液濃度的測定

大腸桿菌菌液稀釋到10-6、10-7、10-8這3個稀釋度的細菌平均數(shù)分別為392 CFU、40 CFU、5 CFU，乘以稀釋倍數(shù)，再除以0.2，菌液濃度分 別 為1.96×109CFU/mL、2.00×109CFU/mL、2.50×109CFU/mL，最終得出原菌液濃度為2.15×109CFU/mL。肺炎克雷伯氏菌菌液稀釋到10-6、10-7、10-8這3個稀釋度的細菌平均數(shù)分別為184 CFU、21 CFU、3 CFU，菌液濃度分別為9.20×108CFU/mL、1.05×109CFU/mL、1.50×109CFU/mL，最終得出原菌液濃度為1.16 CFU/mL。不動桿菌菌液稀釋到10-6、10-7、10-8這3個稀釋度的細菌平均數(shù)分別為397 CFU、43 CFU、5 CFU，菌液濃度分別為1.99×109CFU/mL、2.15×109CFU/mL、2.50×109CFU/mL，最終得出原菌液濃度為2.21 CFU/mL。

2.3熒光PCR特異性試驗

分別用大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌做陽性對照，去離子水做陰性對照，同時選取綠膿桿菌、弗式檸檬酸桿菌和沙門氏菌各3株做試驗樣品。結(jié)果顯示：該方法能夠特異地檢測出大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌（圖中顯示為S型曲線），3株綠膿桿菌、3株弗式檸檬酸桿菌、3株沙門氏菌均未檢測出擴增曲線（圖1～3），說明該檢測方法具有良好的特異性。

圖1 大腸桿菌的特異性

圖2 肺炎克雷伯氏菌的特異性

2.4熒光PCR陽性結(jié)果重復性試驗

重復檢測大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、不動桿菌各10株，均出現(xiàn)特異性S型擴增曲線，且CT值均未超過28，表明檢測結(jié)果均為陽性。陽性結(jié)果變異系數(shù)=標準差/平均值，變異系數(shù)為7.4%，可見三重熒光PCR對大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、不動桿菌陽性結(jié)果的重復性試驗比較穩(wěn)定（圖4～6）。

2.5熒光PCR靈敏度試驗

試驗結(jié)果顯示：此方法對大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌檢測到的最小菌落個數(shù)分別為40 CFU、184 CFU和86 CFU（圖7～9）。

圖4 大腸桿菌的重復性

圖5 肺炎克雷伯氏菌的重復性

圖6 不動桿菌的重復性

圖7 大腸桿菌的靈敏度

圖8 肺炎克雷伯氏菌的靈敏度

圖9 不動桿菌的靈敏度

3 討論

實時熒光定量PCR在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測，具有高度特異性、靈敏性等特點[5]，被廣泛應用于醫(yī)療、藥物研究、病原菌的檢測[6-7]。此方法避免了電泳及成像拍照等步驟，減少了交叉污染[8-9]。

在常規(guī)的細菌培養(yǎng)中，大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動桿菌在普通培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)相似，眼觀不易分辨；采用經(jīng)典細菌形態(tài)觀察方法，發(fā)現(xiàn)涂片鏡檢下的菌體特點相似，很難區(qū)分；采用細菌的生化鑒定和16sRNA鑒定，約需3～4天時間。同時，16sRNA鑒定還需要測序，成本也較高。普通的PCR鑒定，靈敏度差，有時不能直接從樣品中檢測出細菌。本研究所建立的檢測方法具有很好的擴增曲線，結(jié)果判定直觀醒目，能為臨床快速檢測診斷奠定基礎。但本方法由于靈敏度較高，所以操作過程中仍需要小心操作，避免污染，一旦發(fā)生氣溶膠污染，則需開窗通風，排出污染性氣溶膠。

[1]陳思，呂文雪，許皓，等. 引起毛皮動物肺炎的主要病原微生物及特征[J]. 中國毛皮動物科學研究進展，2014（2）：164-169.

[2]鐘世勛，遲珊珊，王振，等. 山東規(guī)?；B(yǎng)殖場毛皮動物多重感染病原學分析[J]. 中國獸醫(yī)學報，2014，34（11）：1770-1777.

[3]張振興. 我國毛皮動物養(yǎng)殖概況及存在的問題[J].經(jīng)濟動物學報，2005，9（4）：187-190.

[4]鐘世勛，朱瑞良，崔國林，等. 山東部分地區(qū)毛皮動物肺炎雷伯氏菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2013，35（4）：285-289.

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[7]韓熹，朱莉莎，姚建垣. 實時熒光定量PCR分析技術(shù)的應用[J].生命科學儀器， 2005（2）：51-52.

[8]陳旭，齊鳳坤，康立功，等. 實時熒光定量PCR技術(shù)研究進展及其應用[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2010（8）：148-155.

[9]徐楠楠，胡桂學. 實時熒光定量PCR技術(shù)的研究進展及應用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（21）：24-27.

（責任編輯：朱迪國）

Establishment of Triple Fluorescent Quantitative PCR for Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter in Minks

Wang Guisheng1，2，Yin Feifei3，Tian Fulin2，Wang Jinbao1
（1. College of Life Science，Shandong University，Jinan，Shandong 250100；2. Shandong Animal Disease Prevention and Control Center ，Jinan，Shandong 250022；3. Weihai Animal Disease Prevention and Control Center，Weihai，Shandong 264200）

According to the partially known sequences of Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter in GenBank，the uidA gene of Escherichia coli，khe gene of Klebsiella pneumoniae and secE gene of Acinetobacter were selected. Then 3 pairs of primers and Taqman probes of which 5' end were labeled with fl uorophores（FAM，HEX，CY5）respectively ，and 3' end marked with BHQ1 quenchers were designed by Primer Premier 5. By optimizing the reaction conditions，a diagnostic method which could detect Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter simultaneously was established. Experiments of speci fi city and sensitivity showed that this method could speci fi cally detect the above three genes，while the lowest detection limits were 2×10-1CFU/μL，9.2×10-1CFU/μL and 4.3×10-1CFU /μL，respectively. The whole ampli fi cation was completed within two hours. In conclusion，a triple quantitative PCR with good sensitivity，reproducibility and speci fi city was established ，it could be used for rapid and simultaneous detection of the three pathogens.

Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Acinetobacter； fl uorescent quantitative PCR

S851.3

：A

：1005-944X（2017）02-0096-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.02.028

山東省毛皮動物產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-18-011-05）

王金寶