張花治，金智生，劉瑩，頡瑞萍，趙建梅，高妍

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020

論著·實(shí)驗(yàn)研究

紅芪多糖對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血小板反應(yīng)蛋白-1和血小板源性生長因子-B表達(dá)的影響

張花治1，金智生1，劉瑩1，頡瑞萍2，趙建梅1，高妍2

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020

目的觀察紅芪多糖（HPS）對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP-1）和血小板源性生長因子-B（PDGF-B）表達(dá)的影響，探討其對糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法采用鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病模型。雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為模型組、多貝斯組和HPS高、中、低劑量組，另設(shè)正常組，每組10只。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，模型組和正常組給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)8周。qRT-PCR和免疫組化檢測TSP-1和PDGF-B mRNA和蛋白表達(dá)；HE染色鏡下觀察視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)。結(jié)果模型組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰、完整，但外核層疏松變薄、排列紊亂，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量稍減少；各給藥組較模型組明顯好轉(zhuǎn)。與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜TSP-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），PDGF-B mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TSP-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），PDGF-B mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；HPS高劑量組與其余給藥組比較，TSP-1和PDGF-B mRNA和蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論HPS可能通過升高糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織TSP-1的表達(dá)和降低PDGF-B的表達(dá)來阻遏糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)程中新生血管生成及增殖，從而起到保護(hù)視網(wǎng)膜的作用。

糖尿病；視網(wǎng)膜；紅芪多糖；血小板反應(yīng)蛋白-1；血小板源性生長因子-B；大鼠

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，以視網(wǎng)膜微血管的閉塞及滲出為主要特征，是目前成人首要的致盲原因之一[1]，也是全球中老年人視力下降的主要原因[2]。病理性血管新生是其發(fā)生的重要病理改變。相關(guān)研究表明，血小板反應(yīng)蛋白-1（thrombospondin-l，TSP-1）與血小板源性生長因子-B（platelet-derived growth factor-B，PDGF-B）與新生血管的形成密切相關(guān)[3-4]，TSP-1被公認(rèn)為是一種有效的內(nèi)源性血管生成抑制因子，是第一個被證實(shí)可發(fā)揮關(guān)鍵作用的天然血管生成抑制劑[5]。PDGF-B廣泛存在于發(fā)育中的血管，能夠促進(jìn)微血管周細(xì)胞生長，保持微血管的正常功能和穩(wěn)定性[6]，可作為DR早期診斷及病程進(jìn)展的檢測指標(biāo)[7]。前期研究表明，紅芪多糖（Hedysari Polysaccharide，HPS）可通過降低糖尿病大鼠和db/db小鼠視網(wǎng)膜上新生血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，降低血管通透性，起到保護(hù)視網(wǎng)膜的作用[8-9]。

本研究采用qRT-PCR和免疫組化方法觀察HPS對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜TSP-1、PDGF-B表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討HPS對DR進(jìn)程中新生血管的生成與增殖的影響及可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠60只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號SCXK（甘）2011-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫23～25 ℃，濕度50%～70%，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物

鏈脲佐菌素（STZ），Sigma公司；HPS，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院邵晶副教授進(jìn)行藥物鑒定并提取，純度為87.44%；羥苯磺酸鈣膠囊（多貝斯），西安利君制藥有限責(zé)任公司，批號14050056。

1.3 主要試劑與儀器

TSP-1鼠抗人多克隆抗體（批號bS-2715R）、兔抗人PDGF-B多克隆抗體（批號bS-0185R），北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒（批號K155615B）、兔SP檢測試劑盒（批號15155A11），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒Ⅱ（批號R6934-01），OMEGA公司；TranScriptor cDNA第一鏈合成試劑盒（批號10842320），Roche公司；2×GreenStar PCR MasterMix（批號1418J），BIONEER公司；TSP-1上游引物5'-CTCTGATG GTGATGGCCGAG-3'，下游引物5'- ATGGCGGACAA CCCAGTTAG-3'，產(chǎn)物長度184 bp；PDGF-B上游引物5'-ATGACCCGAGCACATTCTGG-3’，下游引物5'-ACACCTCTGTACGCGTCTTG-3’，產(chǎn)物長度121 bp；以 β-actin作為內(nèi)參照，上游引物5'-GAGGGAAA TCCTGCGTGAC-3'，下游引物5'-GGAGCCAGGC CAGTAATC-3'，產(chǎn)物長度246 bp；One Touch血糖測定儀（美國強(qiáng)生Lifescan公司，型號穩(wěn)豪倍優(yōu)），臺式高速冷凍離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備，型號CT14RD），掌上離心機(jī)（美國SCILOGEX 公司，型號D1008），微量電動組織勻漿器（Tiangen公司，型號OSE-Y10），超微量紫外分析儀（美國Quawell公司，型號Q5000），RT-PCR熱循環(huán)儀（美國ABI公司，型號7500），冰箱（青島海爾股份有限公司，型號BCD-29W），光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號U-LH100HG）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

造模前對大鼠進(jìn)行全身及眼部檢查以排除原發(fā)性疾病。隨機(jī)選取50只大鼠，禁食12 h，30 mg/kg STZ腹腔注射，連續(xù)3 d，72 h后尾靜脈取血檢測血糖，空腹血糖＞16.7 mmol/L者即為糖尿病大鼠模型。造模后1周，復(fù)測空腹血糖，空腹血糖＞16.7 mmol/L即為造模成功。另外10只腹腔注入等量檸檬酸鈉緩沖液，72 h后測量空腹血糖均＜5.6 mmol/L，設(shè)為正常組。

2.2 分組和給藥

除正常組10只大鼠外，將造模成功的50只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、多貝斯組和HPS低、中、高劑量組，每組10只。多貝斯組每日給予多貝斯90 mg/kg灌胃，HPS低、中、高劑量組每日給予HPS 50、100、200 mg/kg灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。給藥體積均為10 mg/mL，每日1次，連續(xù)8周。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 標(biāo)本取材 灌胃8周后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，斷頸處死，摘取眼球。左眼球去除眼前節(jié)，剝離視網(wǎng)膜組織，液氮速凍，置于EP管中，-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆茫糜趒RT-PCR檢測；右眼置于4%多聚甲醛（4 ℃，24 h）固定，再固定48 h后切除眼前節(jié)，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋，視網(wǎng)膜連續(xù)切片。

2.3.2 組織病理學(xué)觀察 切片脫蠟，乙醇浸泡，蘇木精染色，體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇分化，體積分?jǐn)?shù)1%稀氨水反藍(lán)，伊紅染色，乙醇梯度脫水，透明，中性樹膠封片，鏡下觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化。

2.3.3 免疫組織化學(xué)檢測血小板反應(yīng)蛋白-1和血小板源性生長因子-B蛋白表達(dá) 按照兔抗人TSP-1、鼠抗人PDGF-B多克隆抗體免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒操作說明對切片進(jìn)行染色，每個組織塊取3 μm厚進(jìn)行脫蠟，梯度乙醇水化，3%H2O2去離子水孵育，微波（95 ℃，3 min）抗原修復(fù)。正常山羊血清封閉，依次加入一抗、生物素化二抗、SP復(fù)合物，DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色或深棕色顆粒沉積者為染色陽性反應(yīng)。各組大鼠隨機(jī)選取5張切片，每張切片在400倍鏡下隨機(jī)采集陽性染色最強(qiáng)的5個視野，應(yīng)用Image-Pro-Plus6.0圖像分析軟件對視網(wǎng)膜TSP-1和PDGF-B的積分光密度（IOD）值進(jìn)行分析。

2.3.4 qRT-PCR檢測血小板反應(yīng)蛋白-1和血小板源性生長因子-B mRNA表達(dá) 按試劑盒說明書提取總RNA，用微量核酸蛋白分析儀計算所得RNA的含量和純度。取總RNA 3 μg，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上游引物（20 pmol/μL）0.5 μL，下游引物（20 pmol/μL）0.5 μL，2×SYBR Green 1 μL，2×mix 12.5 μL。加無菌水至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（β-actin 54 ℃、TSP-1 60 ℃，PDGF-B 50 ℃），72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，得到每份樣品中TSP-1和PDGF-B進(jìn)行PCR擴(kuò)增時達(dá)到閾值的Ct值。計算基因的相對表達(dá)量：獲得實(shí)驗(yàn)樣品和對照樣品的Ct值，將目的基因Ct值用β-actin歸一化后，按目的基因/內(nèi)參基因計算組間目的基因表達(dá)量。每個標(biāo)本重復(fù)3孔，取平均值為Ct值，共進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 紅芪多糖對模型大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)的影響

正常組視網(wǎng)膜組織各層結(jié)構(gòu)清晰、完整，排列整齊；模型組視網(wǎng)膜外核層疏松變薄、排列紊亂，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少；各給藥組較模型組明顯好轉(zhuǎn)。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)形態(tài)（HE染色，×400）

4.2 紅芪多糖對模型大鼠視網(wǎng)膜組織血小板反應(yīng)蛋白-1和血小板源性生長因子-B蛋白表達(dá)的影響

TSP-1和PDGF-B免疫陽性反應(yīng)呈棕色，位于胞質(zhì)內(nèi)。正常組大鼠視網(wǎng)膜TSP-1蛋白陽性表達(dá)除外叢狀層，其余各層表達(dá)均比較豐富，PDGF-B蛋白陽性表達(dá)主要見于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層細(xì)胞，內(nèi)核層有少量表達(dá)；模型組大鼠視網(wǎng)膜TSP-1蛋白陽性反應(yīng)明顯減弱，主要見于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層及視錐、視桿細(xì)胞層，內(nèi)核層少量表達(dá)，PDGF-B蛋白陽性反應(yīng)明顯增強(qiáng)，陽性反應(yīng)主要見于內(nèi)界膜層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層及外核層，外叢狀層少量表達(dá)；各給藥組TSP-1陽性表達(dá)較模型組增強(qiáng)，PDGF-B陽性表達(dá)較模型組減弱，見圖2、圖3。與正常組比較，模型組TSP-1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），PDGF-B蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TSP-1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），PDGF-B蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與HPS高劑量組比較，其余給藥組TSP-1和PDGF-B蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表1。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織TSP-1蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織PDGF-B蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×400）

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織TSP-1和PDGF-B蛋白表達(dá)比較（±s，IOD值）

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織TSP-1和PDGF-B蛋白表達(dá)比較（±s，IOD值）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與HPS高劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/（g/kg） TSP-1 PDGF-B正常組 10 25.28±2.60 15.84±3.21模型組 10 14.15±3.20△△26.61±2.24△△多貝斯組 100.09 20.26±2.64**##18.89±2.25**#HPS低劑量組100.05 17.16±3.54*##22.34±3.65**##HPS中劑量組100.10 20.39±2.65**##18.92±2.56**#HPS高劑量組100.20 24.37±3.63**16.12±3.14**

4.3 紅芪多糖對模型大鼠視網(wǎng)膜組織血小板反應(yīng)蛋白-1和血小板源性生長因子-B mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組TSP-1 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.01），PDGF-B mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TSP-1 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01），PDGF-B mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與HPS高劑量組比較，其余各給藥組TSP-1和PDGF-B mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織TSP-1和PDGF-B mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織TSP-1和PDGF-B mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與HPS高劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/（g/kg） TSP-1/β-actin PDGF-B/β-actin正常組 5 1.45±0.11 0.92±0.10模型組 5 0.75±0.14△△1.66±0.16△△多貝斯組 5 0.09 1.23±0.13**##1.19±0.09**#HPS低劑量組5 0.05 0.93±0.12**##1.32±0.14**##HPS中劑量組5 0.10 1.15±0.13**##1.23±0.13**##HPS高劑量組5 0.20 1.38±0.12**1.06±0.15**

5 討論

血-視網(wǎng)膜屏障破壞、新生血管形成是DR主要的病理特征，目前對于新生血管形成機(jī)制雖然已有很多實(shí)驗(yàn)及臨床研究，但至今仍未完全闡明，考慮可能與周細(xì)胞、血小板及其他血液成分等因素有關(guān)。TSP-l和PDGF-B均由血小板釋放，TSP-l是一種非常重要的多肽類內(nèi)源性血管新生抑制物，能夠影響及調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、運(yùn)動、增殖，可以使正常內(nèi)皮細(xì)胞對大部分的促血管生成因子不產(chǎn)生血管生成作用，還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，所以，TSP-l被公認(rèn)為一種有效的內(nèi)源性血管生成抑制因子。其在眼部的研究報道相對較少，有可能是視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管的一種重要抑制因子。PDGF-B由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，與VEGF相似，在視網(wǎng)膜缺氧以及血管功能出現(xiàn)障礙時表達(dá)顯著增加。有研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-B可以誘導(dǎo)兔視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，促使新生血管的形成[10]。

DR屬中醫(yī)學(xué)“消渴內(nèi)障”“視瞻昏渺”“云霧移睛”等范疇?，F(xiàn)代中醫(yī)機(jī)大多認(rèn)為DR為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證，本虛為氣陰兩虛、陰陽俱虛，標(biāo)實(shí)為瘀血阻絡(luò)。紅芪為甘肅地道藥材，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》黃芪項下，列為上品，與黃芪同科異屬，具有益氣活血、養(yǎng)陰散瘀功效。HPS為紅芪的提取物，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等多種生物學(xué)作用。前期研究表明，HPS能夠調(diào)節(jié)db/db小鼠腎組織中多種細(xì)胞因子的表達(dá)、改善腎間質(zhì)纖維化和保護(hù)腎臟組織[11-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPS能升高糖尿病大鼠視網(wǎng)膜上TSP-l表達(dá)，降低PDGF-B表達(dá)，推測HPS可能是通過升高視網(wǎng)膜TSP-l的含量、降低PDGF-B的含量來抑制DR進(jìn)程中新生血管生成及增殖，從而延緩DR的發(fā)展進(jìn)程，因此，其在預(yù)防和治療DR方面有一定的應(yīng)用前景。今后將進(jìn)一步研究TSP-l和PDGF-B信號通路及上下游細(xì)胞因子的表達(dá)，來系統(tǒng)闡述HPS對糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變方面的發(fā)病機(jī)制。

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Effects of Hedysari Polysaccharide on Expressions of TSP-1 and PDGF-B in Retina of Diabetic Rats

ZHANG Hua-zhi1, JIN Zhi-sheng1, LIU Ying1, JIE Rui-ping2, ZHAO Jian-mei1, GAO Yan2
(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730020, China)

ObjectiveTo observe the effects of Hedysari Polysaccharide (HPS) on the expressions of TSP-1 and PDGF-B in the retina of diabetic rats; To discuss the protective effect and possible mechanism on diabetic retinopathy.MethodsThe diabetic model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin. 50 male SPF Wistar rats were randomly divided into 5 groups: model group, calcium dobesilate group, and HPS high-, medium-, and low-dose group, extra 10 rats were set as the normal group, 10 rats in each group. Each administration group was given relevant medicine for gavage, while model group and normal control group were given same amount NS for gavage, once a day for 8 weeks. The mRNA and protein expression of TSP-1 and PDGF-B were detected by qRT-PCR and immunohistochemistry. The retinal structure was observed by HE staining.ResultsHE staining showed that each layer of the retina of the model group was clear and complete, but the outer nucleus layer became looser, thinner and more disorderly, and the number of ganglion cells decreased slightly; the administration groups were improved markedly compared with the model group. Compared with the normal control group, the mRNA level and protein expression of retina TSP-1 on the model group dramatically dropped (P＜0.01), and those of PDGF-B strikingly increased (P＜0.01); Compared with the model group, the mRNA level and protein expression of retina TSP-1 on alladministration groups rose (P＜0.05, P＜0.01), and those of PDGF-B went down (P＜0.01); Compared with all other administration groups, there was statistical significance in the mRNA level and protein expression of retina TSP-1 and PDGF-B on HPS high-dose group (P＜0.05, P＜0.01).ConclusionHPS may prevent the angiogenesis and proliferation in diabetic retinopathy process through adjusting the content of TSP-1 and PDGF-B in retina of diabetic rats so as to protect the retina.

diabetes mellitus; retina; Hedysari Polysaccharide; TSP-1; PDGF-B; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.010

R285.5

A

1005-5304(2017)03-0038-05

2016-05-08）

（

2016-05-22；編輯：華強(qiáng)）

國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金(81360538)；甘肅省青年科技基金計劃（145RJYA297）