分子生物學(xué)方法在微生物多樣性研究中的應(yīng)用

張晨曦(上海師范大學(xué)，上海 200235)

分子生物學(xué)方法在微生物多樣性研究中的應(yīng)用

張晨曦(上海師范大學(xué)，上海 200235)

微生物多樣性研究是生物多樣性研究中的重要內(nèi)容，由于微生物與動(dòng)植物相比，存著這許多不同之處，因此其多樣性研究也存在著許多不同之處，尤其是研究方法仍有待提升。近些年來，越來越多的研究通過分子生物學(xué)方法觀察微生物并取得了一定的成效。因此，文章主要針對(duì)分子生物學(xué)方法在微生物多樣性研究中的應(yīng)用價(jià)值展開分析。

分子生物學(xué)方法；微生物多樣性；遺傳多樣性

微生物主要包括細(xì)菌、放線菌、原生動(dòng)物、真菌、部分藻類和病毒，是構(gòu)成自然界的重要組成部分，其具有代謝多樣性和遺傳多樣性，使得微生物在許多極端環(huán)境中都能夠生存、繁衍。微生物是生物鏈中的重要成員，對(duì)于動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生態(tài)循環(huán)以及污染物的自然降解具有重要作用[1]。微生物種類數(shù)量?jī)H次于昆蟲，但目前已知微生物種類占其總估計(jì)量的比重仍較低，目前生物界中已知的細(xì)菌、真菌以及病毒占其總種類的比重僅有6%、11%和5%，微生物多樣性的研究滯后于其他生物群。

1 微生物多樣性研究的重要性

微生物在維持生態(tài)平衡中具有重要作用，但是我們對(duì)于維持生態(tài)平衡的微生物系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)以及有關(guān)參數(shù)知之甚少，究其原因是由于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法是通過獲得培養(yǎng)菌株才能了解其特征，但是在自然界中能夠培養(yǎng)的微生物數(shù)量還不到微生物總量的百分之一。傳統(tǒng)微生物研究主要是通過觀察菌株的表性特征以及細(xì)胞的性質(zhì)（包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)以及細(xì)胞組成成分等方面）[2]。由于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)是觀察這些微生物特征的重要前提，因此這使得許多無法培養(yǎng)的微生物都不能被具體描述。此外，這種研究方式對(duì)于微生物的進(jìn)化關(guān)系沒有有效的作用，因此微生物進(jìn)化研究受到影響，從而無法對(duì)微生物進(jìn)行準(zhǔn)確的分類以及系統(tǒng)關(guān)系圖的創(chuàng)建。DNA技術(shù)以及微生物分子學(xué)的出現(xiàn)為微生物研究提供了新的道路，有助于現(xiàn)代微生物多樣性研究的良好開展。

從理論層面上分析，微生物進(jìn)化之間的關(guān)系主要是由于基因組的結(jié)構(gòu)決定的，通過比較微生物基因序列之間的不同能夠有助于分析微生物之間的進(jìn)化關(guān)系，比較簡(jiǎn)單的方法就是比較不同微生物類似基因之間的堿基序列，堿基序列之間的差距越大，說明微生物之間的進(jìn)化關(guān)系也就越小。該方法可以用于分析不同微生物之間的進(jìn)化距離，從而用于構(gòu)建進(jìn)化關(guān)系樹或微生物圖譜[3]。在微生物多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，16S rRNA以及18S rRNA的變化速率較低慢，常用于微生物進(jìn)化關(guān)系分析的檢驗(yàn)中。近些年來，隨著微生物DNA技術(shù)的不斷發(fā)展，以核酸基因序列為依據(jù)的微生物進(jìn)化研究獲得了有效的進(jìn)步。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)突破了傳統(tǒng)研究技術(shù)的限制，從遺傳角度上能夠分析出微生物的種類以及遺傳多樣性。

2 分子生物學(xué)方法在微生物多樣性研究中的理論基礎(chǔ)

2.1 “三界”理論的提出

生物學(xué)界在對(duì)古化石標(biāo)本研究中發(fā)現(xiàn)，早在30億年前地球上就有自養(yǎng)細(xì)菌的存在，20多億年前地球上出現(xiàn)了藍(lán)細(xì)菌，15億年前真核生物首次出現(xiàn)在地球上，也就是說原核生物比真核生物出現(xiàn)的要更早，真核細(xì)胞是由原核細(xì)胞進(jìn)化而來也是一種比較科學(xué)的結(jié)論，這也是生物學(xué)界早期生命進(jìn)化的主流理論[4]。這一學(xué)說認(rèn)為所有的生命都可以劃分為這兩種類型，且如今的真核生物就是由原核生物進(jìn)化發(fā)展而來。

分子生物學(xué)方法的應(yīng)用對(duì)于改正現(xiàn)代微生物種類劃分以及進(jìn)化關(guān)系等方面具有較好的效果。進(jìn)三十年來，大量的細(xì)胞生物學(xué)研究和分子生物學(xué)的研究證實(shí)，原核生物早在數(shù)億年前就已經(jīng)分化為真細(xì)菌和古細(xì)菌這兩大類。過去在建立微生物進(jìn)化樹時(shí)，主要是根據(jù)微生物細(xì)胞色素C中氨基酸組成變化的特點(diǎn)，這主要是由于真核生物與大部分原核生物都有細(xì)胞色素C。但是在研究中發(fā)現(xiàn)，有些古細(xì)菌沒有細(xì)胞色素C，而有些細(xì)菌雖然有細(xì)胞色素C，但是其氨基酸組成之間的差異過大，無法確定其是否有著進(jìn)化關(guān)系[5]。通過rRNA的序列結(jié)構(gòu)確定微生物之間的進(jìn)化關(guān)系為微生物多樣性的研究提供了更廣闊的空間。

“三界”理論是由學(xué)者沃瑟提出的，其認(rèn)為原核生物應(yīng)分為古細(xì)菌與真細(xì)菌兩界，但兩界彼此之間有著很大的差異，也就是說古細(xì)菌、真細(xì)菌與真核生物三者是相互平行的，三者都起源于共同的原始細(xì)胞。三界學(xué)說隨著研究的進(jìn)步而不斷發(fā)展，大量古標(biāo)本生物分子研究證實(shí)了古核生物遺傳基因與真核生物有相似之處，古細(xì)菌與真核生物從進(jìn)化學(xué)角度來看比原核生物更加密切，因此近些年來有越來越多的學(xué)者支持真核生物起源于古細(xì)菌的學(xué)說，認(rèn)為真細(xì)菌是最先從古細(xì)菌與真核生物的生物干線中分離出來的?！叭纭崩碚摰奶岢鰹闉樯锒鄻有缘难芯刻峁┝巳碌囊暯牵⑻崾疚⑸镞z傳多樣性具有普遍性。

2.2 16S rRNA基因序列在分子生物學(xué)中的應(yīng)用

佩斯等人首次通過rRNA基因鑒定樣本中微生物的類別，利用5S rRNA基因序列分析微生物的演變與進(jìn)化。該方法取得了一定的成效并且很快被用于研究微生物多樣性。但是由于5S rRNA的基因序列相對(duì)較小，僅有120個(gè)核苷酸，攜帶信息不多，在微生物多樣性研究領(lǐng)域起到的作用有限，而16S rRNA基因序列與5S rRNA基因序列相比，其攜帶信息更多，有1500個(gè)核苷酸，在分析微生物多樣性方面的作用與效率更高。16S rRNA是原核生物中的一種RNA，具有種類少且范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，約有80%細(xì)菌RNA中含有16S rRNA，適用于所有的生物中，從結(jié)構(gòu)和功能上來看具有較強(qiáng)的保守型，被稱為細(xì)菌化石。16S rRNA既能夠表現(xiàn)出不同菌屬之間的差異，同時(shí)又能夠被分子生物技術(shù)所測(cè)量，因此得到了生物學(xué)家的廣泛支持。細(xì)菌16S rRNA中的可變區(qū)序列都是根據(jù)細(xì)菌的菌屬來確定的，恒定區(qū)序列相對(duì)比較穩(wěn)定，因此可以利用恒定區(qū)序列將16S rRNA片段進(jìn)行擴(kuò)增處理，利用不同細(xì)菌的可變區(qū)序列進(jìn)行菌屬和菌種的鑒定。通過對(duì)16S rRNA基因序列的分析，從而判斷不同菌屬、菌種之間進(jìn)化關(guān)系的密切程度。16S rRNA序列同源性分析是推斷細(xì)菌進(jìn)化和發(fā)展的重要方法。

3 分子生物學(xué)技術(shù)在微生物多樣性研究中的應(yīng)用

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA技術(shù)成為遺傳學(xué)研究中的重要方法。近些年來，從樣本中采集和提取DNA的方法不斷改進(jìn)，從而對(duì)樣本中的微生物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)展，推動(dòng)了微生物多樣性研究的發(fā)展。因此，文章針對(duì)分子生物學(xué)技術(shù)在微生物多樣性研究中的應(yīng)用展開闡述。

3.1 分子雜交技術(shù)

分子雜交技術(shù)是出現(xiàn)于1970年的分子生物學(xué)技術(shù)，其主要利用DNA分子堿基相互配對(duì)的原理，利用特異性C DNA探針與樣本中的DNA或RNA形成雜交分子，其具有較高的特異性和敏感度，在微生物多樣性研究中得到了廣泛的應(yīng)用。目前實(shí)驗(yàn)中主要使用的探針有雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA、寡核苷酸探針這三種，能夠?qū)ξ⑸锬芊翊嬖谟谔囟ōh(huán)境、分布特點(diǎn)以及元素豐度等方面進(jìn)行確定。

對(duì)采集到的微生物進(jìn)行印跡雜交，能夠獲得特定DNA序列的信息，主要原理是利用16S rRNA基因探針與采集的為神武進(jìn)行雜交，16S rRNA相對(duì)豐度能夠通過兩者之間的雜交信號(hào)確定，從而間接反應(yīng)微生物細(xì)胞的數(shù)量和生理特征。對(duì)采集樣本直接進(jìn)行原位雜交，然后利用具有熒光標(biāo)記的核酸片段作為探針，與樣本染色體和細(xì)胞核進(jìn)行DNA雜交，就能夠?qū)ふ业酵碊NA片段所在位置，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞DNA序列的定位。該技術(shù)能夠從未知菌種獲得大量的信息，包括微生物形態(tài)以及生物結(jié)構(gòu)等方面的信息。但是由于是對(duì)環(huán)境樣本的檢測(cè)，所獲得的理論更加能夠凸顯自然環(huán)境中微生物的特點(diǎn)。這種方法應(yīng)用的關(guān)鍵是前期探究工作的不斷累積，尤其是對(duì)已知微生物。全細(xì)胞雜交比印跡雜交更加直觀，其主要是通過放射性標(biāo)記rRNA探針來檢查單個(gè)微生物細(xì)胞。

3.2 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)也就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，其主要利用雙鏈DNA變性與復(fù)性及分子雜交技術(shù)。PCR技術(shù)是一種快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，能夠?qū)⑸倭緿NA特異性擴(kuò)增，通過多次解鏈以及反復(fù)循環(huán)，能夠?qū)⒒蚧駾NA序列擴(kuò)增十幾倍，從而對(duì)采集DNA樣本進(jìn)行分析，包括基因分析、序列分析以及進(jìn)化分析等。目前學(xué)界采用最廣的是以16S rRNA基因?yàn)榛A(chǔ)的PCR擴(kuò)增，對(duì)微生物基因序列的擴(kuò)增有助于分析微生物進(jìn)化的多樣性。

PCR技術(shù)僅需要少量DNA即可進(jìn)行檢測(cè)。所選取的擴(kuò)增模版DNA片段要符合規(guī)范，若擴(kuò)增不科學(xué)，可導(dǎo)致推斷錯(cuò)誤，一般來說，引物應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)于分析基因序列的高度保守區(qū)，多在15～30bp區(qū)間。采用雙鏈產(chǎn)物作為PCR擴(kuò)增模版，通過控制兩種引物的含量，能夠擴(kuò)增出特定的DNA序列。單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)主要是根據(jù)不同構(gòu)象的DNA單鏈在中性物質(zhì)中的變遷率來觀察DNA基因的多樣性。若單鏈DNA出現(xiàn)單堿基缺失時(shí)，遷移率會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從而在譜帶中出現(xiàn)多樣性變化。該技術(shù)所采用的方法主要分為PCR擴(kuò)增和凝膠分離這兩方面，典型的單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)需要在PCR擴(kuò)增中加入典型ATP標(biāo)記引物或CTP標(biāo)記引物才能進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢之后通過放射觀察單鏈構(gòu)象的多態(tài)變化。但是這種方法花費(fèi)的時(shí)間與經(jīng)費(fèi)較大，且操作復(fù)雜，隨著近些年的技術(shù)改進(jìn)，采用印染顯色以及溴化乙錠染色能夠直接在中性凝膠中顯示單鏈構(gòu)象多態(tài)性，并且能夠采用同為標(biāo)記引物進(jìn)行測(cè)驗(yàn)，使得該技術(shù)更加快捷和有效。單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：①能夠檢測(cè)到單堿基的基因突變；②方便快捷，適用于多樣本篩查中。但是該技術(shù)也有一定的缺陷，即其對(duì)小片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物較為敏感，對(duì)于大片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢驗(yàn)需要采用雙向凝膠電泳進(jìn)行分析。

4 結(jié)語

微生物多樣性的傳統(tǒng)研究方法是提取為環(huán)境樣本中的微生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和鑒定，但是自然界中的微生物種類非常多，能夠采集到的微生物有限，且能夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微生物更是少之又少，僅為微生物的1%。近些年來隨著DNA技術(shù)的不斷發(fā)展，通過DNA技術(shù)來觀察微生物菌屬和種類的研究得到了較大的發(fā)展，這為微生物多樣性的研究提供了新的方向。

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[5]李慧,陳冠雄,張穎等.分子生物學(xué)方法在污染土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用[J].土壤學(xué)報(bào),2014,41(4):612-617.

張晨曦男漢族籍貫：河南省周口市 在讀上海師范大學(xué)研究生三年級(jí)、微生物學(xué)專業(yè)、研究方向：分子生物學(xué)、郵編：200235