趙景宏

·述評(píng)·

蛋白結(jié)合毒素與慢性腎臟病及其心血管并發(fā)癥

趙景宏

近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患病率高達(dá)10.8%，且有逐年增高的趨勢(shì)[1]。CKD并發(fā)癥主要包括心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)、礦物質(zhì)骨質(zhì)代謝紊亂、貧血等，其中CVD是CKD患者最主要的并發(fā)癥和首位死亡原因，但截止目前CKD及其心血管并發(fā)癥的機(jī)制仍未完全闡明。近年來(lái)，蛋白結(jié)合毒素對(duì)CKD及CVD的影響日益受到關(guān)注，此類毒素與血漿白蛋白結(jié)合，因相對(duì)分子質(zhì)量大，極難被普通透析清除，可以長(zhǎng)時(shí)間存在于血液循環(huán)，對(duì)機(jī)體造成不良影響。因此，我們對(duì)蛋白結(jié)合毒素加重CKD及誘發(fā)CVD的機(jī)制和臨床清除治療方式進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。

一、蛋白結(jié)合毒素及其生成

2003年，歐洲尿毒癥毒素研究組將已知的毒素進(jìn)行了一次全面的總結(jié)和歸類，國(guó)內(nèi)學(xué)者以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步將毒素分為3類：①水溶性、不與蛋白結(jié)合的小分子溶質(zhì)(相對(duì)分子質(zhì)量大多<500)，如尿素和肌酐；②中分子物質(zhì)(相對(duì)分子質(zhì)量大多>500)，主要是肽類(如甲狀旁腺素等)；③蛋白結(jié)合物質(zhì)，該類毒素與蛋白結(jié)合，形成大分子復(fù)合物，不易通過(guò)傳統(tǒng)透析清除，我們通稱為蛋白結(jié)合毒素，比較有代表性的是硫酸吲哚酚(indosyl sulfate，IS)和硫酸對(duì)甲酚(p-cresyl sulfate，PCS)。蛋白結(jié)合毒素多由硫酸鹽、糖苷、甘油或谷氨酰胺的前體組成，其組成原則與藥物類似，就是保證其有足夠好的水溶性和蛋白結(jié)合性。這些前體物質(zhì)中絕大多數(shù)是腸道細(xì)菌發(fā)酵的產(chǎn)物(如對(duì)甲酚和吲哚)；對(duì)甲酚來(lái)自食物中的酪氨酸和苯丙氨酸，吲哚則來(lái)自食物中的色氨酸。大腸細(xì)菌在蛋白結(jié)合毒素生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。對(duì)甲酚是苯丙氨酸和酪氨酸經(jīng)腸道厭氧菌作用的代謝產(chǎn)物，腸道菌群產(chǎn)生的對(duì)甲酚經(jīng)門靜脈入肝，再經(jīng)硫酸化形成PCS和葡萄糖醛酸酐對(duì)甲酚。吲哚是色氨酸經(jīng)腸道細(xì)菌作用的代謝產(chǎn)物，在肝臟內(nèi)經(jīng)羥化生成3-羥基吲哚，再經(jīng)硫酸化作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為硫酸吲哚酚[2]。這兩種毒素正常情況下可經(jīng)腎近曲小管分泌自尿液排出，當(dāng)腎功能下降時(shí)，腎小管排泌功能也隨之下降，導(dǎo)致其不斷積累，引起一系列病理性損傷[3]。

二、蛋白結(jié)合毒素的危害及機(jī)制

Niwa[4]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白結(jié)合毒素的血清水平與CKD患者死亡風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，是CKD患者重要的非傳統(tǒng)危險(xiǎn)因子，這可能與其腎臟毒性作用有關(guān)。另一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，血清IS水平與CKD患者的高CVD發(fā)病率有關(guān)[5]。Lin等[6]和Krishnasamy等[7]的研究也顯示維持性血液透析患者的血清IS及PCS水平與CVD病死率密切相關(guān)，而血清IS水平偏低的患者其左室功能紊亂的發(fā)病率較低。這就表明，蛋白結(jié)合毒素在CKD進(jìn)展和CVD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

1.蛋白結(jié)合毒素的腎臟損害作用 研究證實(shí)，蛋白結(jié)合毒素的蓄積會(huì)加速CKD進(jìn)展，其中IS的作用尤為突出[8]。另外，臨床研究表明，血清IS和PCS水平可以預(yù)測(cè)各期CKD患者腎功能下降的風(fēng)險(xiǎn)，而AST-120，一種口服吸附劑，可以通過(guò)下調(diào)上述毒素水平延緩CKD進(jìn)展[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，IS及PCS可以通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激、激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等多種途徑加重腎臟損傷[3]。

(1)IS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，系膜細(xì)胞增殖：腎功能下降時(shí)蓄積的IS可以誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species，ROS)過(guò)量生成、抑制抗氧化物的活性、打破氧化-抗氧化平衡，促進(jìn)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷。受損的腎小管上皮細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子[如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、單核細(xì)胞趨化蛋白1及細(xì)胞間黏附分子1]，并發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化。上述細(xì)胞因子又促使巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)并分泌大量的TGF-β1、組織金屬蛋白酶抑制劑1及I型膠原，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[3]。IS和PCS均可以通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)炎癥因子生成引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎纖維化[9]。與此同時(shí)，IS還可以通過(guò)誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞的ROS生成促進(jìn)氧化應(yīng)激、激活MAPKs信號(hào)，導(dǎo)致系膜細(xì)胞增殖，引起腎小球硬化[10]。

(2)IS加速腎臟衰老：IS可以加速腎臟衰老。我們及多個(gè)研究小組均發(fā)現(xiàn)，IS可以下調(diào)抗衰老蛋白Klotho在腎臟的表達(dá)，而Klotho蛋白是腎臟纖維化的主要抑制因子[11-12]。此外，IS還可以促進(jìn)受損內(nèi)皮細(xì)胞衰老標(biāo)志蛋白SA-β-gal表達(dá)[13]，這些結(jié)果均提示IS可以加速腎臟衰老，但是到目前為止，IS加速腎臟衰老的具體機(jī)制尚未深入闡明，有待進(jìn)一步研究。

(3)IS導(dǎo)致腎臟氧代謝異常：研究顯示，IS可以通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激增加腎小管上皮細(xì)胞的氧耗量[3]。IS可以抑制進(jìn)展期CKD患者缺氧誘導(dǎo)基因表達(dá)，這可能是CKD患者缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)功能性抑制的原因之一。此外，IS還可以使促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)生成細(xì)胞即腎皮質(zhì)近曲小管管周細(xì)胞的氧傳感器敏感性下降，導(dǎo)致EPO生成減少，加重CKD患者貧血[3，14]。

(4)IS和PCS激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)：IS和PCS均可以通過(guò)增加腎素、血管緊張素及血管緊張素Ⅰ受體表達(dá)，減少血管緊張素Ⅱ受體表達(dá)激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)。最近有研究在人近端小管上皮細(xì)胞中也進(jìn)一步證實(shí)了IS促進(jìn)血管緊張素表達(dá)的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)核因子κB和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NADPH oxidase，Nox4)有關(guān)[15]。

2.蛋白結(jié)合毒素的心血管損害作用 血清IS和PCS水平均與CKD患者的CVD發(fā)病有關(guān)，但有關(guān)IS的研究更為多見(jiàn)，IS的心血管損害作用可以分為直接損害和間接損害兩個(gè)方面。一方面，IS可以通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、Akt信號(hào)通路等方式誘導(dǎo)心肌重塑，最終引發(fā)心力衰竭、心律失常等不良后果；IS也可以通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激、抑制一氧化氮生成，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)等多種機(jī)制促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、大動(dòng)脈異常鈣化、內(nèi)皮功能紊亂及細(xì)胞衰老，加速血管損傷。另一方面，IS還可以促使細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡失調(diào)、下調(diào)細(xì)胞保護(hù)性蛋白Klotho及EPO等方式發(fā)揮間接性心血管損害作用。

(1)IS對(duì)心臟的直接損害作用及其機(jī)制：①IS通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激激活下游信號(hào)誘導(dǎo)心肌重塑。早在2009年就有研究發(fā)現(xiàn)，血清IS濃度與氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平呈正相關(guān)[16]。隨后研究證實(shí)，IS可以通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激導(dǎo)致多種心臟損害，包括心肌纖維化、心肌肥大、心肌細(xì)胞凋亡等[17]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，IS不僅可以促進(jìn)Nox來(lái)源的ROS生成，還可以通過(guò)抑制AMPK/UCP2信號(hào)通路增加線粒體來(lái)源的ROS生成。此外，我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IS可以通過(guò)激活Nox/ROS/MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)心肌肥大，而抗衰老蛋白Klotho可以逆轉(zhuǎn)IS的上述作用[18-19]。②IS通過(guò)激活A(yù)ngⅡ/TGF-β信號(hào)促進(jìn)心肌纖維化。血管緊張素Ⅱ可以通過(guò)上調(diào)TGF-β表達(dá)導(dǎo)致心肌纖維化[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，IS可以激活腎素血管緊張素系統(tǒng)調(diào)節(jié)microRNA表達(dá)、誘導(dǎo)心肌纖維化[21]。有報(bào)道則發(fā)現(xiàn)IS可以通過(guò)促進(jìn)ROS生成誘導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)進(jìn)而激活血管緊張素Ⅱ信號(hào)通路[22]。這就提示IS可能通過(guò)血管緊張素Ⅱ信號(hào)上調(diào)TGF-β表達(dá)誘導(dǎo)心肌纖維化。③IS通過(guò)激活A(yù)kt/GSK3β信號(hào)通路誘導(dǎo)心臟重塑。在過(guò)去的20年中，研究發(fā)現(xiàn)Akt/GSK3β信號(hào)通路在心肌重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PI3K與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后激活A(yù)kt及其下游的GSK3β信號(hào)，進(jìn)而促進(jìn)心肌肥大[23]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)IS可以通過(guò)促進(jìn)Akt磷酸化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化標(biāo)志物的表達(dá)[24]。因此，PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)也可能參與IS誘導(dǎo)的心肌重塑[24]。

(2)IS對(duì)血管的直接損害作用：①IS誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖。動(dòng)脈粥樣硬化是CKD患者的主要血管病變，血管平滑肌細(xì)胞增殖是其發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Yamamoto等[25]研究發(fā)現(xiàn)IS不僅可以誘導(dǎo)內(nèi)皮功能紊亂，還可以通過(guò)激活MAPKs信號(hào)促使血管平滑肌細(xì)胞增殖。還有研究表明，IS可以通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激促進(jìn)人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。其可能機(jī)制是IS通過(guò)活化Akt/TSC/mTOR/S6K信號(hào)途徑誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖[26]。②IS誘導(dǎo)血管炎癥。炎癥也是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。血清IS水平與維持性血液透析患者的高炎癥狀態(tài)密切相關(guān)。既往IS促進(jìn)炎癥的研究?jī)H局限于近端腎小管上皮細(xì)胞。最近，越來(lái)越多的研究提示IS也可以促進(jìn)血管炎癥，而其清除劑AST-120可以改善血管炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化病變程度[27-31]。關(guān)于IS促進(jìn)血管炎癥的具體機(jī)制目前報(bào)道較多，提示這可能是多靶點(diǎn)作用的結(jié)果。一項(xiàng)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的研究顯示，IS誘導(dǎo)血管炎癥與芳香烴受體激活有關(guān)[27]。Ito等[28]研究發(fā)現(xiàn)IS可以通過(guò)上調(diào)Nox并激活p38 MAPK依賴的信號(hào)通路導(dǎo)致單核細(xì)胞趨化，進(jìn)而誘導(dǎo)血管炎癥。也有研究指出，IS可以通過(guò)活化OAT3/AhR/核因子κB信號(hào)通路導(dǎo)致白細(xì)胞介素6表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)血管炎癥[29]。此外，IS還可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附及E-選擇素表達(dá)，增強(qiáng)血管壁炎癥反應(yīng)[30-31]。③IS誘導(dǎo)動(dòng)脈鈣化[32]。動(dòng)脈鈣化與CKD患者CVD的發(fā)生率及病死率密切相關(guān)。臨床及動(dòng)物研究均提示，IS可以誘導(dǎo)動(dòng)脈鈣化，而AST-120則可以改善CKD動(dòng)脈鈣化[32]。但是，IS誘導(dǎo)動(dòng)脈鈣化的相關(guān)機(jī)制研究報(bào)道較少。最近，有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)IS可以促進(jìn)人血管平滑肌細(xì)胞鈣化，其機(jī)制可能與血管平滑肌細(xì)胞Klotho蛋白分泌受抑，細(xì)胞磷的攝入增加有關(guān)[33]。因此，IS誘導(dǎo)動(dòng)脈鈣化的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。④IS誘導(dǎo)血管衰老。血管衰老可以導(dǎo)致心腎綜合征進(jìn)展。有學(xué)者在高血壓模型鼠的研究中發(fā)現(xiàn)IS可以促進(jìn)血管衰老，但其機(jī)制不明[34]。Adelibieke等[35]研究發(fā)現(xiàn)IS通過(guò)促進(jìn)ROS過(guò)量生成、激活p53誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老。Muteliefu等[36]研究也提示IS促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞衰老與增強(qiáng)的氧化應(yīng)激有關(guān)。另外，IS還可能通過(guò)激活A(yù)hR導(dǎo)致iNampt-NAD(+)-Sirt1系統(tǒng)受損，誘導(dǎo)內(nèi)皮衰老[37]。

3.IS對(duì)心血管的間接損害作用

(1)IS導(dǎo)致氧化-抗氧化失衡：多項(xiàng)研究表明，IS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激與其打破氧化-抗氧化平衡有關(guān)。一方面，IS可以通過(guò)上調(diào)Nox誘導(dǎo)ROS過(guò)量生成[18]。另一方面，IS又可以抑制抗氧化酶一氧化氮合酶活性，下調(diào)UCP2、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、Nrf2等抗氧化蛋白表達(dá)[19，38]。IS的這一作用導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng)，進(jìn)而誘導(dǎo)心、腎纖維化及血管炎癥等病變。

(2)IS下調(diào)Klotho表達(dá)：Klotho是一種主要在腎臟表達(dá)和分泌的抗衰老蛋白。近年來(lái)的研究顯示，Klotho還具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡等多種細(xì)胞保護(hù)作用[39]。我們的既往研究發(fā)現(xiàn)Klotho可以抑制炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白1表達(dá)，改善心肌重塑，而IS可以抑制Klotho表達(dá)[11，18-19，39]。國(guó)外研究者也發(fā)現(xiàn)IS可以通過(guò)誘導(dǎo)DNA啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致Klotho表達(dá)下調(diào)，而IS清除劑AST-120可以逆轉(zhuǎn)IS誘導(dǎo)的Klotho下調(diào)和細(xì)胞衰老[12]。Shimizu等[40]的研究顯示，IS下調(diào)Klotho表達(dá)還與其增加ROS生成和激活核因子κB有關(guān)。

(3)IS減少EPO生成：EPO由腎臟皮質(zhì)近曲小管管周細(xì)胞分泌產(chǎn)生，是紅細(xì)胞生成過(guò)程中必不可少的內(nèi)生激素，CKD患者隨著病情進(jìn)展，EPO生成也逐漸減少。研究顯示，EPO的生理作用不僅限于促進(jìn)紅細(xì)胞生成，還可以作用于內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，起到內(nèi)皮及神經(jīng)保護(hù)作用[41]。Chiang 等[14]發(fā)現(xiàn)，IS以一種HIF依賴的方式下調(diào)EPO mRNA表達(dá)。隨后，Adelibieke等[42]發(fā)現(xiàn)IS通過(guò)抑制Akt磷酸化下調(diào)EPO表達(dá)。另外，IS下調(diào)EPO表達(dá)還可能與其促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活轉(zhuǎn)錄因子4有關(guān)[43]。EPO生成減少一方面會(huì)加重腎性貧血，導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血缺氧，引起心臟損害；另一方面，其內(nèi)皮保護(hù)作用也會(huì)被削弱。

三、蛋白結(jié)合毒素的清除

1.血液凈化治療 蛋白結(jié)合毒素由于其蛋白結(jié)合特性，很難通過(guò)普通透析方式清除。目前，高通量透析被報(bào)道在清除該類毒素中起一定作用，尤其對(duì)IS的清除效果較好，但療效并不確切。在多種透析方式中，對(duì)流被認(rèn)為可以更有效的清除蛋白結(jié)合毒素。當(dāng)然，該類毒素的清除也有賴于彌散模式。相比單純的血液濾過(guò)，血液透析濾過(guò)對(duì)蛋白結(jié)合毒素的清除效果更佳。另外，有研究顯示增加透析膜面積和透析液流速也可以促進(jìn)蛋白結(jié)合毒素清除，當(dāng)使用兩個(gè)透析器并保證每個(gè)透析器的透析液流速≥800 ml/min時(shí)，其毒素清除效果甚至優(yōu)于對(duì)流模式，每周行3次夜間透析或增加每次的透析時(shí)長(zhǎng)也有助于IS及PCS的清除[44]。此外，血漿分離聯(lián)合吸附、白蛋白透析也有助于蛋白結(jié)合類尿毒素的清除，但治療費(fèi)用比較昂貴，推廣應(yīng)用較少[45]。

2.口服吸附劑治療 1991年，日本學(xué)者在全世界首次介紹了AST-120。AST-120是一種珠狀、多孔、高純度、可口服的活性碳，可強(qiáng)力吸附飲食來(lái)源的糖基終產(chǎn)物和尿毒素，并促進(jìn)這些毒素從消化道排出體外，同時(shí)也可以通過(guò)吸附腸道中的吲哚減少血清IS水平。該藥物在日本及韓國(guó)已經(jīng)開(kāi)始用于CKD患者的臨床治療。臨床研究顯示，CKD患者用藥24周后，血清IS水平呈劑量依賴性下降，氧化應(yīng)激標(biāo)志物減少，血管舒張功能明顯改善，腎功能下降速度減慢，同時(shí)服用該藥物可以延遲CKD患者開(kāi)始透析的時(shí)間，增加透析患者及非透析患者的生存率，減少CKD患者的住院天數(shù)及住院率，但針對(duì)該藥物尚無(wú)長(zhǎng)期療效的觀察結(jié)果，其長(zhǎng)期療效仍待明確[45]。

3.其他 包括口服益生菌、低蛋白飲食、保護(hù)殘腎功能等。研究顯示，口服益生菌可以通過(guò)保護(hù)腸道菌群減少IS生成[46]。另一項(xiàng)研究指出，飲食結(jié)構(gòu)對(duì)IS的生成也有影響，他們發(fā)現(xiàn)素食者與正常人群相比有更低的IS水平[47]。此外，也有研究者發(fā)現(xiàn)腹膜透析患者血清蛋白結(jié)合毒素水平較維持性血液透析患者低，導(dǎo)致這種差異的原因可能與飲食習(xí)慣、殘余腎功能及腸道功能有關(guān)[48]。

四、展望

綜上所述，隨著CKD進(jìn)展，蛋白結(jié)合尿毒素在血液中不斷蓄積，對(duì)腎臟本身及心血管等其他器官均會(huì)產(chǎn)生不利影響，并與CKD患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)及心血管事件發(fā)生獨(dú)立相關(guān)。然而，迄今為止蛋白結(jié)合毒素的病理?yè)p傷機(jī)制仍未完全闡明，亦沒(méi)有一種明確的方式可以高效的清除此類毒素。目前，血漿分離聯(lián)合吸附、白蛋白透析有助于該類毒素清除，但費(fèi)用較為昂貴，保護(hù)殘腎功能、低蛋白質(zhì)飲食也是可以考慮的方式，但一般為輔助治療，AST-120雖已投入臨床應(yīng)用，但長(zhǎng)期療效未知。因此，不論是蛋白結(jié)合毒素的病理?yè)p傷機(jī)制還是其清除策略，未來(lái)還需要更為廣泛深入的研究和探索，并在此基礎(chǔ)上使CKD及其心血管并發(fā)癥獲得更好的防治效果。

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10.3969/j.issn.1671-2390.2017.05.001

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腎內(nèi)科

2017-04-19)