蔡寶寧，陸相楊，仇 睿，喬志雄，甘向峰

·論 著·

小干擾RNA下調(diào)GPX1基因?qū)κ彻荀[癌EC9706細(xì)胞增殖及順鉑敏感性的影響

蔡寶寧，陸相楊，仇 睿，喬志雄，甘向峰

目的 探討靶向下調(diào)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(GPX1)對(duì)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(EC9706)增殖和順鉑敏感性的影響。方法 合成針對(duì)GPX1的siRNA，分別用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706。Western Blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后GPX1蛋白表達(dá)，用MTS檢測(cè)法測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖活力和順鉑敏感性。結(jié)果 siRNA干擾EC9706細(xì)胞后在36、48、60及72 h對(duì)細(xì)胞增殖活性較對(duì)照組明顯抑制(P<0.05)。經(jīng)siRNA干擾GPX1表達(dá)下調(diào)，在由不同濃度的順鉑作用后同對(duì)照組相比，細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性明顯上升(P<0.05)，[IC50(siGPX1)=3.8 μmol/L，IC50(陰性對(duì)照)=6.1 μmol/L，IC50(空白對(duì)照)=6.9 μmol/L]。結(jié)論 siRNA下調(diào)GPX1表達(dá)可以抑制人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706的增殖能力，以及上調(diào)其對(duì)順鉑的敏感性。

食管鱗狀細(xì)胞癌；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1；小干擾RNA；順鉑

食管癌是最常見(jiàn)的胸部惡性腫瘤之一,目前對(duì)食管癌的發(fā)病原因和機(jī)制仍不十分明確[1-2]。研究結(jié)果提示，乳腺癌、肺癌、肝癌等腫瘤中均存在不同程度的氧自由基(ROS)活性異常[3-5]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(GPX1)是一種抗氧化酶，是抗氧化酶家族的重要成員[6-8]，在體細(xì)胞惡變時(shí)會(huì)出現(xiàn)表達(dá)異常，并引起細(xì)胞內(nèi)ROS活性失調(diào)[9-10]。本研究旨在利用RNA干擾技術(shù)使食管鱗狀癌細(xì)胞內(nèi)GPX1表達(dá)下降，研究其生物學(xué)行為的變化及作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料：食管癌細(xì)胞株EC9706購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；胰蛋白酶、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自以色列Biological Industries公司；羊抗兔IgG二抗、兔抗人GAPDH抗體、兔抗人GPX1抗體購(gòu)自Cell Signaling公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；RIPA組織細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天公司。小干擾RNA(siRNA)由上海吉瑪制藥公司合成，siGPX1：5’-GGUACUACUUAUCGAGAAUTT-3’；5’-AUUCUCGAUAAGUAGUACCTT-3’。陰性對(duì)照Scramble：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT T-3’； 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA的轉(zhuǎn)染：細(xì)胞置于含10%胎牛血清無(wú)抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80%常規(guī)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。siRNA轉(zhuǎn)染前待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要收集細(xì)胞。

1.3 Western Blot：siRNA干擾48 h后，用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞2遍。收集細(xì)胞，用RIPA裂解細(xì)胞，置于冰上30 min，后離心提取蛋白質(zhì)，BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。10 % SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，25 mL封閉緩沖液中室溫封閉1 h，加入GPX1及GAPDH單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖：轉(zhuǎn)染后36 h，取各組EC9706細(xì)胞用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按照每孔500個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)1～3 d后，采用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算平均值，繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)率情況折線圖。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性：轉(zhuǎn)染后36 h，將各組細(xì)胞按照每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上，培養(yǎng)過(guò)夜后按照0、2.5、5、10、20、40 μmol/L濃度梯度培養(yǎng)各組細(xì)胞，每組細(xì)胞每個(gè)濃度梯度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后采用CCK-8法檢測(cè)96孔板OD值，繪制順鉑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況折線圖。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 siGPX1抑制EC9706細(xì)胞GPX1蛋白表達(dá)：利用Western Blot法檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞中GPX蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，siGPX1干擾組GPX1蛋白表達(dá)水平明顯減低，說(shuō)明siRNA特異性抑制GPX1蛋白表達(dá)。

2.2 siGPX1抑制EC9706細(xì)胞增殖：利用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染1～3 d 后各組EC9706細(xì)胞的活性，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siGPX1后EC9706細(xì)胞增殖受到明顯抑制，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 siGPX1增加EC9706細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性：不同濃度順鉑作用72 h后，利用CCK-8法檢測(cè)EC9706細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，相同順鉑濃度時(shí)，轉(zhuǎn)染siGPX1后EC9706細(xì)胞對(duì)其敏感性高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組，其中，當(dāng)順鉑濃度為2.5 μmol/L及5 μmol/L時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他濃度時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

近些年食管癌的診斷和手術(shù)技術(shù)不斷發(fā)展，但是其5年生存率依舊不能令人滿意，雖然近些年分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域研究發(fā)展迅速，但食管癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍不十分明確[1-2,11]。在人體細(xì)胞新陳代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生的ROS可以破壞細(xì)胞各種膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器、DNA等，影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的完整性[12]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPXs)是一個(gè)抗氧化酶家族，共有8個(gè)家族成員[13]，它們的編碼基因分別位于不同的染色體上，編碼一類(lèi)能夠高效消除體內(nèi)ROS的抗氧化酶，避免細(xì)胞膜的氧化損傷和高氧條件下DNA的破壞，維系機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)平衡[6，8]。

研究提示，在惡性腫瘤病理過(guò)程中，當(dāng)GPX1的表達(dá)出現(xiàn)明顯異常時(shí)，由ROS介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用會(huì)發(fā)生一系列變化，從而引起惡性腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變[12，14]。這一點(diǎn)與本研究結(jié)果基本一致，轉(zhuǎn)染siGPX1后EC9706細(xì)胞內(nèi)GPX1表達(dá)明顯降低，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。除此之外，現(xiàn)有研究表明，當(dāng)順鉑等鉑類(lèi)化療藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后與細(xì)胞DNA形成復(fù)合物[5，15-16]，在破壞DNA和線粒體結(jié)構(gòu)的過(guò)程中產(chǎn)生大量ROS，并通過(guò)MAPK-p38通路，使Bad激活，促使Caspase 3和Caspase 9從線粒體中釋放，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[6，14]。我們?cè)O(shè)想，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GPX1表達(dá)發(fā)生改變后，食管鱗癌EC9706細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性可能也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)由siGPX1轉(zhuǎn)染使細(xì)胞內(nèi)GPX1表達(dá)下降后，原本相對(duì)耐藥的EC9706細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性有所提高[IC50(siGPX1)=3.8 μmol/L，IC50(陰性對(duì)照)=6.1 μmol/L，IC50(空白對(duì)照)=6.9 μmol/L]，尤其在順鉑濃度為2.5 μmol/L及5 μmol/L時(shí)最為明顯，這一發(fā)現(xiàn)目前在食管癌研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果表明，通過(guò)siRNA下調(diào)GPX1基因表達(dá)，可使食管鱗癌EC9706細(xì)胞增殖受到明顯抑制，并且可上調(diào)食管鱗癌EC9706細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。但對(duì)于直接引起GPX1活性改變的上游調(diào)控元件，以及GPX1表達(dá)改變之后直接引起細(xì)胞生物學(xué)行為變化的下游作用分子并不十分清楚，仍需要進(jìn)一步探索。

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Effect of small interfering RNA gene down-regulated GPX1 gene on the proliferation and the cisplatin sensitivity of esophageal squamous cell carcinoma EC9706

CAI Baoning,LU Xiangyang,QIU Rui,QIAO Zhixioing,GAN Xiangfeng.

Department of Thoracic Surgery,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China

GAN Xiangfeng,Email:foryours.gan@msn.com

Objective To explore the effect of down-regulated GPX1 gene on the proliferation and the cisplatin sensitivity of esophageal squamous cell carcinoma EC9706.Methods Lipofectamine 2000 liposomes were used to transfect human squamous cell carcinoma cell line EC9706 transiently for GPX1 synthetized siRNA. GPX1 protein expression was measured by Western Blot,proliferation of cell and sensitivity of cisplatin were measured by MTS.Results The proliferation were inhibited than that in control group when EC9706 were interfered with siRNA at 36 h,48 h,60 h and 72 h (P<0.05).Down-regulated by siRNA interference GPX1 after different concentrations of cisplatin as compared with that in control group,cell sensitivity to cisplatin significantly increased (P<0.05),(IC50(siGPX1)=3.8,IC50(Scramble)=6.1 umol/L,IC50(Blank)=6.9 umol/L).Conclusion siRNA down-regulated GPX1 gene can inhibit the proliferation of human esophageal squamous cell carcinoma cell line EC9706 and increase its sensitivity to cisplatin.

Esophagealsquamouscellcarcinoma;Glutathioneperoxidase-1;SmallinterferingRNA;Cisplatin

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0596

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院胸外科，寧夏 銀川 750004

蔡寶寧(1981-)，男，寧夏籍，大學(xué)本科，主治醫(yī)師，主要從事胸心外科研究。

甘向峰，Email:foryours.gan@msn.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0845.016.html

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2017-01-03 [責(zé)任編輯]李 潔