張?zhí)K玥

(鄭州大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450001)

食品醫(yī)藥領(lǐng)域毛細(xì)管電泳分離技術(shù)現(xiàn)狀及展望

張?zhí)K玥

(鄭州大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450001)

綜述近年來(lái)毛細(xì)管電泳技術(shù)在中藥、食品、生物體樣品領(lǐng)域的分析應(yīng)用，毛細(xì)管電泳法作為分離分析的一項(xiàng)重要技術(shù)，使分析生物分子得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析，乃至單分子分析成為可能。進(jìn)行蛋白質(zhì)的毛細(xì)管電泳分離可以顯著提高分析速度和分離效率，在生物活性分子的分離分析中體現(xiàn)出了顯著的優(yōu)越性。

毛細(xì)管電泳；應(yīng)用；展望

1.毛細(xì)管分離技術(shù)簡(jiǎn)介

毛細(xì)管電泳(CE)又稱(chēng)高效毛細(xì)管電泳(HPCE)，是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間濃度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類(lèi)液相色譜分離技術(shù)。

2.毛細(xì)管分離技術(shù)應(yīng)用

毛細(xì)管電泳技術(shù)具有高效快速、準(zhǔn)確靈敏、操作簡(jiǎn)便、溶劑消耗少、成本低和環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、食品安全以及醫(yī)藥科學(xué)等領(lǐng)域。

2.1 中藥方面

毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)應(yīng)用到生藥學(xué)領(lǐng)域是在八十年代后期出現(xiàn)的。眾所周知，中藥材科屬繁多，各類(lèi)藥物的產(chǎn)地各異，成分復(fù)雜。中藥的一些成分，如生物堿類(lèi)、糖類(lèi)、苷類(lèi)等運(yùn)用傳統(tǒng)的色譜分離，很容易在分離時(shí)吸附在色譜柱上，使得分析物分離困難，有時(shí)甚至?xí)斐缮V柱的損壞。而毛細(xì)管電泳技術(shù)以其經(jīng)濟(jì)和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，在中藥有效成分分離測(cè)定、復(fù)方制劑的指紋圖譜及成分分析、中藥藥代動(dòng)力學(xué)等方面均有廣泛的應(yīng)用。其最高柱效可達(dá)到105個(gè)理論板數(shù)，最高靈敏度可以達(dá)到10-19mol，有區(qū)帶電泳，凝膠電泳等多種模式，CE正逐漸成為藥物鑒定的參考或標(biāo)準(zhǔn)方法，2010版藥典化藥品種中采用了分離效能高的毛細(xì)管電泳法，其中抑膚酶增加的去丙氨酸—去甘氨酸—抑膚酶和去丙氨酸—抑膚酶檢查就是采用毛細(xì)管電泳法，中藥品種繁多、且產(chǎn)地各異、成分復(fù)雜，對(duì)藥物進(jìn)行定量分析是不可少的一項(xiàng)任務(wù)，如應(yīng)用毛細(xì)管電泳法可以同時(shí)測(cè)定中成藥中人參皂苷、紅景天苷、淫羊霍苷等5種苷類(lèi)成分的含量。陳琴華等對(duì)植物藥和中藥中黃酮類(lèi)化合物采用不同的毛細(xì)管電泳分離模式使之從中藥和多種植物中更好的分離。此外，毛細(xì)管電泳技術(shù)在醫(yī)藥方面不僅可以進(jìn)行定量分析，還可以用作建立復(fù)雜樣品的指紋圖譜，對(duì)手性藥物進(jìn)行分離分析和藥物篩選或與其他儀器聯(lián)用進(jìn)行定性分析。孫國(guó)祥等運(yùn)用毛細(xì)管電泳技術(shù)在50mmol/L硼砂—150mmol / L磷酸二氫鈉—50 mmol/L磷酸氫二鈉的緩沖液中，以甘草次酸峰為參照物峰，確定15個(gè)共有指紋峰，建立了補(bǔ)中益氣丸的指紋圖譜，并評(píng)價(jià)出10批次補(bǔ)中益氣丸的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。季一兵等運(yùn)用毛細(xì)管電泳技術(shù)，在pH 9. 5的44mmol/L硼砂—34mmol/L SDS的緩沖液中建立了復(fù)方生脈散的指紋圖譜，確定了20個(gè)主要共有的指紋峰，為復(fù)方生脈散的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了良好的依據(jù)。

毛細(xì)管電泳技術(shù)的研究和應(yīng)用，為多組分中藥的定性定量分析、中藥藥性識(shí)別等領(lǐng)域和中藥材檢驗(yàn)鑒別等工作帶來(lái)了生機(jī)與活力，將對(duì)專(zhuān)業(yè)技術(shù)的發(fā)展與提高起著重要的促進(jìn)作用。

2.2 食品方面

食品安全是目前社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)，食品安全問(wèn)題主要涉及非法添加物、農(nóng)獸藥殘留、重金屬污染、致病微生物及其毒素等方而，這些問(wèn)題的不斷暴發(fā)促進(jìn)了食品安全檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，其中免疫毛細(xì)管電泳(CEIA)因其快速、簡(jiǎn)便、靈敏、經(jīng)濟(jì)、檢測(cè)范圍廣等特點(diǎn)而成為食品安全快速精準(zhǔn)檢測(cè)中，發(fā)展最為迅速的檢測(cè)手段之一。比如脂肪酸檢測(cè)中最廣泛的檢測(cè)方法是氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)，但是GC和HPLC分析方法測(cè)定時(shí)過(guò)程較為復(fù)雜，進(jìn)行脂肪酸檢測(cè)時(shí)毛細(xì)管電泳(CE)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是步驟簡(jiǎn)單、溶劑量少、分離模式多、分析時(shí)間短、環(huán)保。例如張燦等采用競(jìng)爭(zhēng)法CEIA檢測(cè)了魚(yú)肉、雞肉等食品中的氯霉素含量。試驗(yàn)首先在魚(yú)肉、雞肉中進(jìn)行了氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)添加后，同熒光標(biāo)記后的氯霉素半抗原競(jìng)爭(zhēng)氯霉素抗體，而后用CE區(qū)帶電泳模式分離，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果看出，隨著樣品中氯霉素濃度的增高，游離的標(biāo)記氯素濃度也隨之逐漸增高，而標(biāo)記復(fù)合物濃度逐漸下降。以相對(duì)峰面標(biāo)準(zhǔn)曲線為縱坐標(biāo).以氯霉素含量為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線從而實(shí)現(xiàn)定量分析。

如今，CEIA在動(dòng)物源性食品抗生素檢測(cè)、食品藥物殘留檢測(cè)、食品生物毒素檢測(cè)、真菌毒素檢測(cè)中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)安全快速需求。但是毛細(xì)管電泳進(jìn)樣量小、低濃度分析下的準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)重復(fù)性有待提高，一些大分子物質(zhì)特別是蛋白質(zhì)容易在毛細(xì)管壁上吸附造成結(jié)果的不準(zhǔn)確、各種管壁修飾技術(shù)還有待于進(jìn)一步發(fā)展等問(wèn)題也一一暴露在科學(xué)工作者面前，新技術(shù)新方法的發(fā)展將使該技術(shù)不斷完善，毛細(xì)管電泳技術(shù)在食品行業(yè)的應(yīng)用正越來(lái)越受到相關(guān)科研工作者的重視。

2.3 醫(yī)學(xué)、生物學(xué)上

由瑞典Uppsala大學(xué)的Tiselse教授在上世紀(jì)三十年代創(chuàng)立的界面電泳成為早期的毛細(xì)管電泳技術(shù)，他在電場(chǎng)的作用下將蛋白質(zhì)分子分成球蛋白和白蛋白等4個(gè)區(qū)帶，隨后又在1950—1980年間發(fā)明了紙上電泳，這一技術(shù)在醫(yī)學(xué)和生物實(shí)驗(yàn)室得到了廣泛的應(yīng)用， CE在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用上也更為廣闊，包括各種內(nèi)源性分子及離子，根據(jù)所分析的物質(zhì)，可將CE的應(yīng)用分為以下幾個(gè)方面。

(1)核酸

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展日新月異，基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、DNA重組、轉(zhuǎn)基因等基因工程是分子生物學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)，與之密切相關(guān)的核酸分析則是毛細(xì)管電泳最為重要的應(yīng)用領(lǐng)域。目前世界上許多實(shí)驗(yàn)室正在積極開(kāi)展功能基因組和基因多態(tài)性的研究。近年來(lái)，經(jīng)眾多毛細(xì)管電泳與核酸研究者的共同努力，通過(guò)對(duì)樣品純化、毛細(xì)管柱的改性、篩分體系、分離條件及檢測(cè)靈敏度等環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，使毛細(xì)管電泳技術(shù)在核酸分離分析的各方面取得了巨大進(jìn)展。其中比較重要的研究成果主要集中在DNA序列測(cè)定、基因突變、基因長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)等方面。

DNA測(cè)序是毛細(xì)管電泳涉及的一個(gè)重大課題，經(jīng)過(guò)最近幾年的努力，己證明毛細(xì)管電泳是測(cè)序的主要技術(shù)之一。1990年，Locker等第一次報(bào)道用毛細(xì)管凝膠電泳在單個(gè)毛細(xì)管中進(jìn)行了DNA序列測(cè)定的嘗試，并獲得初步成功。此后，許多人投入了這一方面的研究工作，其中包括多根平行毛細(xì)管的使用，提高了分辨率和測(cè)序的速度。現(xiàn)在不僅單管測(cè)序的速度大大提高，在一臺(tái)儀器上進(jìn)行多根毛細(xì)管操作的商品化測(cè)序儀也己推向市場(chǎng)。使用四色熒光毛細(xì)管列陣電泳技術(shù)，即每天可連續(xù)測(cè)1536個(gè)樣品。毛細(xì)管電泳對(duì)加速完成人類(lèi)基因組全序列測(cè)定起到了巨大的推動(dòng)作用。

(2)藥物

藥物是除核酸和蛋白質(zhì)以外毛細(xì)管電泳應(yīng)用最為集中的一類(lèi)對(duì)象，近年來(lái)以美國(guó)食品藥物管理局為代表的各國(guó)管理機(jī)構(gòu)，對(duì)一些藥物研制開(kāi)發(fā)的規(guī)定，對(duì)藥物的手性拆分和發(fā)展手性技術(shù)起了極大的推動(dòng)作用。毛細(xì)管電泳的藥物分析在分辨率、速度、成本和樣品量等方面均有很大的優(yōu)勢(shì)。具體的應(yīng)用已涉及到藥物分析、治療監(jiān)測(cè)，藥理學(xué)、毒理學(xué)研究，毒品的檢測(cè)以及新藥的研制和開(kāi)發(fā)等生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，其中以診斷、治療、研究為目的藥物監(jiān)測(cè)以及違禁藥物和毒品的確定方面的應(yīng)用特別引人注目。目前分析體液中藥物濃度主要用免疫法、色譜(薄層和液相色譜)法、分光光度檢測(cè)法，上述方法不同程度地有價(jià)格昂貴、操作繁瑣、耗費(fèi)試劑等缺點(diǎn)，而且存在藥物與藥物代謝產(chǎn)物、污染物、抗體的交叉反應(yīng)。CE方法可以克服這些不足，常用的CE方法是CZE和MEKC，已有許多應(yīng)用CE進(jìn)行臨床常規(guī)藥物定性定量分析檢測(cè)的報(bào)道。CE所能分析的藥物種類(lèi)多， 分離效率高，如鎮(zhèn)靜藥、興奮劑、巴比妥和苯巴比妥、阿片類(lèi)及大麻類(lèi)等鎮(zhèn)靜催眠類(lèi)藥物臨床應(yīng)用范圍廣，容易產(chǎn)生藥物依賴(lài)性，且中毒劑量與治療劑量接近，因此常需要監(jiān)測(cè)血藥濃度。應(yīng)用CE可以大大節(jié)約人力物力。由于新藥開(kāi)發(fā)策略的發(fā)展，CE技術(shù)還表現(xiàn)出在新藥篩選方面的應(yīng)用前景。新的開(kāi)發(fā)策略是直接測(cè)試合成化合物的組合庫(kù)，即從含上百種化合物的混合物中篩選先導(dǎo)藥物。CE和MS技術(shù)聯(lián)用，可以使化合物的篩選和結(jié)構(gòu)鑒定一步完成。

(3)內(nèi)源性小分子和離子

在把主要的研究工作集中于毛細(xì)管電泳對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、藥物應(yīng)用的同時(shí)，越來(lái)越多的應(yīng)用開(kāi)始向臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的內(nèi)源性小分子和離子方面滲透。離子及某些內(nèi)源性小分子，是維持機(jī)體生存的重要物質(zhì)，反映人體的正常新陳代謝情況，它們的變化與機(jī)體的生、老、病、死密切相關(guān)。對(duì)于臨床樣品中的離子和小的內(nèi)源性代謝分子，通常用離子色譜、原子吸收光譜、酶法及比色法進(jìn)行測(cè)定，這些方法在靈敏性、選擇性及精確性方面存在不足，且耗時(shí)、價(jià)格昂貴，因此發(fā)展高效、快速、精確的方法十分必要。CZE和MECC法，在分離離子和小分子方面具有引人注目的特性，且已有許多相關(guān)的應(yīng)用。如檢測(cè)血清中的游離鈣和總鈣，尿中肌酐、鈣和無(wú)機(jī)陽(yáng)離子，尿中馬尿酸和馬尿酸鹽， CE己開(kāi)始應(yīng)用于疾病的診斷，如通過(guò)檢測(cè)吡咯堿，診斷血脂代謝異常，監(jiān)測(cè)血清及臍血中的膽紅素的含量，以利于新生兒核黃疸的診斷。

(4)蛋白質(zhì)與氨基酸

另外毛細(xì)管電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)與氨基酸檢測(cè)分離中也發(fā)揮著重要角色，在微量氨基酸的測(cè)定中，利用高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳直接紫外檢測(cè)法可以完成對(duì)8種非生化氨基酸的有效分離，將該方法用于由亮氨酸發(fā)酵液中顆氨酸和亮氨酸的含量測(cè)定時(shí)，也能取得相當(dāng)好的效果。

毛細(xì)管電泳儀將樣品中氨基酸分離，常結(jié)合不同的檢測(cè)器對(duì)每種氨基酸進(jìn)行定性和定量分析。常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器(ultraviolet detector，UV)、激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(laser- induced fluorescence，LIF)、質(zhì)譜檢測(cè)器(mass spectrometric detection，MS)和電化學(xué)檢測(cè)器(electrochemical detection，EC)。

3.展望

CE技術(shù)在生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域己經(jīng)顯示了巨大的優(yōu)勢(shì)。它所具有的高效、快速、微量及自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，解決和彌補(bǔ)了許多傳統(tǒng)方法的不足。盡管我國(guó)目前CE技術(shù)還沒(méi)有真正成為生物活性物質(zhì)檢測(cè)的常規(guī)手段，但可以預(yù)見(jiàn)，在未來(lái)的幾年中，以此為基礎(chǔ)而發(fā)展起來(lái)的相關(guān)技術(shù)，有可能取代目前許多種常規(guī)檢測(cè)方法。初具雛型的各種芯片技術(shù)，己經(jīng)為我們描繪出了與現(xiàn)在科學(xué)實(shí)驗(yàn)室迥然不同的未來(lái)前景。它是以CE等技術(shù)為基礎(chǔ)的多通道、集成化、高度自動(dòng)化的微型實(shí)驗(yàn)室。屆時(shí)，人們可以只用極微量的樣品，在很短時(shí)間內(nèi)就能得到各種想要的結(jié)果，對(duì)未知物質(zhì)的預(yù)測(cè)、篩選、濃度監(jiān)測(cè)及生物活性利用度的評(píng)價(jià)等，提供直接或間接的依據(jù)。

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The Present Situation and Prospects of Capillary Electrophoresis Separation Technology in Food and Medicine Fields

ZHANG Su-yue
(School of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China)

In recent years, capillary electrophoresis technology has been applied widely in the fields of traditional Chinese medicine, food and biological sample analysis. Capillary electrophoresis separation analysis is an important technology, which makes biological molecules analysis from the level of edge up into nanoliter level, and makes single cell analysis, even single-molecule analysis possible. The capillary electrophoresis separation of proteins can significantly improve the speed and efficiency, reflecting significant advantages in the separation and analysis of biological active macromolecules.

capillary electrophoresis; application; prospect

2016-11-01

張?zhí)K玥(1996- )，女，鄭州大學(xué)藥學(xué)院本科在讀。

TS207.3

A

1671-3974(2017)01-0048-03