何飛 汝觸會 沈曉強 徐儉樸

1.浙江中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院 杭州 310003

芍藥甘草湯對哮喘大鼠輔助性T細胞17及其細胞因子白細胞介素-17的影響

何飛 汝觸會 沈曉強 徐儉樸

1.浙江中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院 杭州 310003

[目的]觀察芍藥甘草湯對支氣管哮喘SD大鼠輔助性T細胞（T helper cells,Th）17及白細胞介素-17（interleukin17,IL-17）的干預情況，探討芍藥甘草湯防治哮喘的作用機制。[方法]雄性SD大鼠40只，隨機均分為正常對照組、模型組、芍藥甘草湯組、地塞米松組、中西醫(yī)結合組，每組8只。除正常對照組外其余各組大鼠以卵白蛋白致敏并誘發(fā)哮喘以制作模型。正常對照組和模型組生理鹽水灌胃，其余各組給予對應藥物。實驗結束后對大鼠左肺行肺泡灌洗術，肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細胞計數(shù)后離心取細胞進行瑞氏染色細胞分類計數(shù)。用酶聯(lián)免疫法測定肺勻漿中IL-17的水平，用流式細胞儀檢測脾臟單個核細胞液中Th17細胞含量。[結果]與模型組比較，芍藥甘草湯組、地塞米松組及中西醫(yī)結合組均可顯著降低BALF細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞（P<0.01），同時能顯著降低Th17和IL-17水平（P<0.01）,地塞米松組大鼠IL-17表達較芍藥甘草湯組及中西醫(yī)結合組降低（P=0.049和0.006），地塞米松組大鼠Th17表達與芍藥甘草湯組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。[結論]芍藥甘草湯防治哮喘的作用機制可能與其調節(jié)哮喘大鼠Th17細胞及其IL-17的作用有關。

芍藥甘草湯；BALF；哮喘；Th17細胞；IL-17；實驗研究

目前，全球哮喘患者至少有3億，中國哮喘患者大約3000萬[1]，全球范圍內哮喘病人經濟負擔巨大。哮喘是一種異質性疾病，雖然有哮喘管理和預防的全球策略標準化治療方案，但臨床效果不盡相同。中醫(yī)藥在防治支氣管哮喘方面具有較大優(yōu)勢[2]，芍藥甘草湯系張仲景《傷寒論》中的著名方劑，現(xiàn)代藥理研究證實芍藥甘草湯具有明顯的解痙、鎮(zhèn)痛、抑制氣道重構等多種作用而被廣泛用于臨床[3-4]。本實驗研究主要觀察芍藥甘草湯對哮喘大鼠輔助性T細胞（T helper cells,Th）17和白細胞介素-17（interleukin17,IL-17）的干預情況，以探討芍藥甘草湯防治哮喘的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠40只，體質量（200± 20）g，由浙江省實驗動物中心提供 [使用許可證號：SCKX(浙)2014-0001,合格證號：0010439]。飼養(yǎng)條件為：溫度18～22℃，相對濕度40%～60%，自由飲水，標準普通飼料喂食。

1.2 實驗藥物及試劑 芍藥甘草湯由浙江中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥制劑室制成流浸膏（芍藥和甘草的比例為1:1）,生藥含量1g·mL-1；醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：140653）；卵白蛋白（Sigma公司，批號：A5253）；氫氧化鋁（上海凌峰化學試劑有限公司，批號：Lot.NO. 20130818）；大鼠IL-17酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：Lot#R 20150115）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 取40只雄性SD大鼠，按隨機數(shù)字表法分為5組:正常對照組、模型組、芍藥甘草湯組、地塞米松組和中西醫(yī)結合組，每組8只。哮喘模型參照文獻[5]介紹的方法進行，除正常對照組外，其余各組大鼠在第1、7d腹腔注射造模液1mL（含卵白蛋白120mg、氫氧化鋁100mg）致敏，正常對照組用1mL生理鹽水腹腔注射代替。從第15d開始，除正常組外，其余各組大鼠分組放進自制容器（30L），用配制好的2%卵白蛋白激發(fā)液，使用壓縮霧化機霧化激發(fā)，每組激發(fā)時間30min/d，正常對照組用生理鹽水代替霧化刺激，時間為30min/d，連續(xù)4周。給藥方法：各組大鼠均從造模第15d起霧化激發(fā)后半小時灌胃給藥至末次激發(fā)。正常對照組和模型組用蒸餾水代替給藥，芍藥甘草湯組給予芍藥甘草流浸膏5g· kg-1，地塞米松組給予地塞米松溶液1mg·kg-1；中西醫(yī)結合組給予芍藥甘草流浸膏5g·kg-1及地塞米松溶液0.5mg·kg-1。藥物用量按體型系數(shù)的折算公式，將人體臨床用藥劑量估算為實驗動物用藥劑量。

2.2 標本采集和處理 各組大鼠在最后1次激發(fā)18～24h之間用烏拉坦（濃度為20%）麻醉，行左肺肺泡灌洗收集灌洗液，無菌取出右上肺用10%甲醛固定觀察病理形態(tài)學變化，留取右下肺冷凍保存制備肺組織勻漿。留取脾臟，放入EP管中，并于-20℃冷凍保存。

2.3 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）收集及細胞計數(shù) 暴露氣管，在氣管正中剪一楔形小切口，插入灌胃針至左肺并結扎，用4℃生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，每次3mL，反復灌洗3次，回收率均大于50%，BALF細胞計數(shù)后離心取細胞進行瑞氏染色細胞分類計數(shù)。

2.4 大鼠肺組織病理形態(tài)學觀察 將右上肺組織置于10%甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，樹脂封片，光鏡下觀察肺病理形態(tài)學表現(xiàn)。

2.5 大鼠肺勻漿 IL-17測定 將冷凍保存的肺組織室溫解凍，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重；然后用移液管量取生理鹽水，生理鹽水體積總量應該為組織重量的9倍，冰浴情況下在培養(yǎng)皿中用眼科剪剪碎組織塊，用組織勻漿機10000～15000r/min研磨制成10%組織勻漿。將制備好的10%肺組織勻漿用離心機2000r/min離心10min，留上清液進行IL-17的檢測，具體實驗步驟同操作說明書。

2.6 大鼠脾臟Th17細胞流式分析 將脾臟取出后，立即浸入裝有冷PBS的培養(yǎng)皿中，剪去白色結締組織，換入另1個裝有冷PBS的培養(yǎng)皿中清洗脾臟；再次換個裝有冷PBS的培養(yǎng)皿，用眼科剪剪切脾臟成3mm×3mm左右的小塊，用5mL一次性注射器的尾部輕輕研磨脾臟小塊；然后200目篩網(wǎng)過濾獲得單細胞懸液，用冷PBS洗滌2次，每次1000r/min離心10min；最后將細胞重懸于RPMI1640（含滅活FBS）中，用臺酚藍染色計數(shù)活細胞數(shù)（應在95%以上），并使用RPMI 1640調節(jié)細胞濃度為2×106/mL。在調節(jié)好細胞濃度的樣本中加入250×PMA/Ionomycin 2uL 和250×Monensin/BFA 2uL刺激脾細胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)5h，期間相隔1～2h混勻1次。FITC-CD4抗體進行表面標記。固定破膜后，PE-IL17A抗體行胞內染色，每個樣品均設同型對照，24h內采用BD流式細胞儀檢測分析。

2.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±S）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊性兩兩比較采用SNK法檢驗，方差不齊性則兩兩比較采用Tamhane’sT2法，以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 BALF細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞計數(shù) 各組BALF細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞比有統(tǒng)計學差異（F= 63.70，P<0.01和F=65.13,P<0.01）。與正常對照組比較,模型組和各藥物組大鼠BALF細胞總數(shù)均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），模型組和芍藥甘草湯組嗜酸性粒細胞比顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，芍藥甘草湯組、地塞米松組及中西醫(yī)結合組均可顯著降低BALF細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞水平，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；地塞米松組和中西醫(yī)結合組均較芍藥甘草湯組顯著減少BALF細胞數(shù)及嗜酸性粒細胞水平，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），中西醫(yī)結合組和地塞米松組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BALF細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞計數(shù)比較（±s）Tab.1 Comparison of the total number of cells and the number of eosinophils(Eos)in BALF among different groups of rats(±S)

表1 各組大鼠BALF細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞計數(shù)比較（±s）Tab.1 Comparison of the total number of cells and the number of eosinophils(Eos)in BALF among different groups of rats(±S)

注：與正常對照組比較，ΔΔP<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與芍藥甘草湯組比較，##P<0.01。Note：Compared with blank control group,ΔΔP<0.01;Compared with model group,**P<0.01;Compared with Shaoyao Gancao Decoction group,##P<0.01.

組別 n 細胞總數(shù)(107/L) 嗜酸性粒細胞比（%）正常對照組 8 16.38±3.54**1.31±0.23**模型組 8 104.37±13.73△△10.25±2.18△△芍藥甘草湯組 8 69.00±11.82**△△6.25±1.91**△△地塞米松組 8 37.75±11.42**△△##1.50±0.26**##中西醫(yī)結合組 8 52.37±14.95**△△##2.65±0.67**##F值 63.70 65.13 P值 0.000 0.000

3.2 肺組織病理學觀察 正常對照組各支氣管管腔光整通暢，未見閉塞和粘液栓，氣道粘膜未見明顯水腫，氣道和血管周圍未見明顯炎癥細胞浸潤，以巨噬細胞為主。模型組小氣管粘膜水腫較為明顯，支氣管管腔較正常組縮小，有的甚至閉塞，部分可見粘液栓。高倍鏡下觀察氣道粘膜上皮細胞腫脹，多數(shù)細胞核被擠壓至細胞邊緣，杯狀細胞增多，部分上皮細胞呈空泡樣變性、部分壞死、脫落，氣道周圍小血管充血，部分擴張，粘膜基底層較正常組增厚，氣道各層和血管周圍組織有較多的炎癥細胞浸潤，主要以淋巴細胞和嗜酸性粒細胞為主。其余各組氣道和血管周圍可見不同程度的炎癥細胞浸潤，但均較哮喘模型組明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學（HE,200×）Fig.1 Pathomorphology of lung among different groups of rats（HE,200×）

3.3 大鼠肺勻漿IL-17測定結果 各組大鼠肺勻漿IL-17含量差異有統(tǒng)計學意義（F=23.83，P<0.01）。與正常對照組比較,模型組大鼠肺勻漿IL-17表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，芍藥甘草湯組、地塞米松組和中西醫(yī)結合組均可顯著降低IL-17水平，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；地塞米松組IL-17表達比芍藥甘草湯組及中西醫(yī)結合組均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.049和 0.006）。見表2。

表2 各組大鼠肺勻漿IL-17及大鼠脾臟單個核細胞液中Th17細胞百分比比較(±S)Tab.2 Comparison of expression of IL-17 in lung homogenate and numbers of Th17 cells in spleen among different groups of rats(±S)

表2 各組大鼠肺勻漿IL-17及大鼠脾臟單個核細胞液中Th17細胞百分比比較(±S)Tab.2 Comparison of expression of IL-17 in lung homogenate and numbers of Th17 cells in spleen among different groups of rats(±S)

注：與正常對照組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與地塞米松組比較，※※P<0.01。Note：Compared with blank control group,△△P<0.01;Compared with model group,**P<0.01;Compared with dexamethasone group,※※P<0.01.

組別 n IL-17（ng·L-1） Th17百分比（%）正常對照組 8 17.98±1.96 0.29±0.07**模型組 8 43.41±3.99△△0.85±0.08△△芍藥甘草湯組 8 29.63±7.91**△△※※0.58±0.11**△△地塞米松組 8 23.98±4.86**△△0.50±0.11**△△中西醫(yī)結合組 8 32.12±6.82**△△※※0.64±0.10**△△※※F值 23.83 36.09 P值 0.000 0.000

3.4 各組大鼠脾臟Th17細胞含量比較 各組大鼠脾臟Th17細胞含量差異有統(tǒng)計學意義（F=36.09，P< 0.01）。與正常對照組比較，模型組大鼠Th17比例顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，芍藥甘草組、地塞米松組及中西醫(yī)結合組均能顯著降低Th17比例，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；芍藥甘草組與地塞米松組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；地塞米松組較中西醫(yī)結合組能顯著降低Th17比例，差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.008）。見表2、圖2。

圖2 Th17細胞流式細胞儀分析圖Fig.2 Analysis graphics of numbers of Th17 cells in spleen among different groups of rats with flow cytometry

3 討論

免疫學機制在哮喘發(fā)病機制中占有重要地位，既往研究發(fā)現(xiàn)Th1/Th2失衡表達是哮喘發(fā)病的主要免疫學機制[6]，但目前發(fā)現(xiàn)該機制無法完全解釋哮喘發(fā)病的免疫學機制。Th17細胞及其分泌的IL-17在哮喘的發(fā)病過程中起到重要作用。Th17細胞主要分泌IL-6、IL-17A、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎性細胞因子。IL-17作為Th17細胞相關細胞因子，參與了哮喘的免疫學機制[7]。IL-17具有強大的致炎作用[8]，同時參與了哮喘氣道平滑肌細胞遷移、新生血管形成等作用[9]，共同參與了氣道重構。在此過程中嗜酸性粒細胞也起到了一定作用[10]。

芍藥甘草湯系張仲景《傷寒論》中的著名方劑。主要由芍藥和甘草二味中藥等量組成?，F(xiàn)代藥理研究證實芍藥甘草湯具有明顯的解痙、鎮(zhèn)痛、抑制氣道重構等多種作用，并對支氣管哮喘具有一定防治作用[3-4]。本實驗研究表明，哮喘模型組大鼠BALF細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞含量均顯著升高，三種藥物干預后均可顯著下降BALF細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞含量（P<0.01），同時本項目組發(fā)現(xiàn)芍藥甘草組嗜酸性粒細胞水平較地塞米松組顯著升高，說明芍藥甘草湯降低嗜酸性粒細胞作用不及地塞米松明顯，但中西醫(yī)結合組嗜酸性粒細胞水平較芍藥甘草湯組顯著下降，說明中西醫(yī)結合治療可提高療效。另一方面，哮喘模型大鼠肺勻漿中IL-17表達和單個核細胞液中Th17細胞含量均顯著升高，經芍藥甘草湯方干預后，其表達均顯著下降（P<0.01），表明芍藥甘草湯防治支氣管哮喘作用機制可能與通過抑制Th17細胞及其細胞因子IL-17有關。三組藥物組比較，地塞米松組IL-17表達比芍藥甘草湯組及中西醫(yī)結合組均顯著降低，說明地塞米松抗IL-17細胞因子效果較好。地塞米松組Th17比例較中西醫(yī)結合組顯著降低（P=0.008），芍藥甘草湯組較地塞米松組差異無顯著性，說明芍藥甘草湯抗Th17作用與地塞米松相似。需要指出的是中西醫(yī)結合組采用的中藥劑量與芍藥甘草湯組相同，加用一半劑量地塞米松后兩者Th17比例差異仍無統(tǒng)計學意義，但與地塞米松組比較，中西醫(yī)結合組卻顯著升高Th17，而芍藥甘草湯組與地塞米松組差異卻無顯著性，需要考慮實驗的誤差。同時本項目組研究還發(fā)現(xiàn)，雖然地塞米松組Th17比例較中西醫(yī)結合組均顯著降低，但是中西醫(yī)結合組減少了地塞米松使用劑量，大鼠一般狀態(tài)較地塞米松組好，提示中西醫(yī)結合治療哮喘能減少激素用量，減少其相關副作用。本研究只著眼于哮喘大鼠Th17細胞及其相關細胞因子IL-17表達變化，其上游信號通路有待進一步深入研究，同時在今后課題設計上可增加中藥、西藥單獨用一半劑量的實驗組，進一步完善實驗研究，并進一步摸索實驗方法，減少實驗誤差。

References:

[1] 中華醫(yī)學會呼吸病分會哮喘學組．中國支氣管哮喘防治指南（2016年版）[J].中華結核和呼吸雜志，2016,39(9):675-697. Asthma group of the respiratory disease branch of Chinese medical association.The guideline of prevention and treatment of bronchial asthma(2016)[J].Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases,2016,39(9):675-697.

[2] 劉斐,虞堅爾,白莉,等.中藥內服治療支氣管哮喘的Meta分析[J].中華中醫(yī)藥學刊,2016，34(2):299-303. LIU Fei，YU Jian’er，BAILi，etal.Meta-analysison TCM in Treatment of Bronchial Asthma[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,2016,34(2):299-303.

[3] 董雷,蔡宛如.芍藥甘草湯對哮喘大鼠氣道重塑的影響及相關機制研究[J].中藥材,2016,39(4):887-890. DONG Lei,CAI Wanru.Researches of Effect of Shaoyao Gancao Decoction on Airway remodeling of Asthma Rats [J].Journal of Chinese Medicinal Materials,2016,39(4):887-890.

[4] 蔡宛如,錢華,朱淵紅，等.芍藥甘草湯平喘和抗過敏作用的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結合急救雜志,2000,7(6):341-342. CAI Wanru,QIAN Hua,ZHU Yuanhong，et al.Experimental Study on The Anti-allergic and Anti-asthmatic Effects of Shaoyao Gancao Decoction[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine in Intensive and Critical Care,2000,7(6):341-342.

[5] 吳濱，蔡宛如.芍藥甘草湯對哮喘模型大鼠血清白細胞介素-4、白細胞介素-6及IgE影響的實驗研究[J].福建中醫(yī)藥,2008,39(5):47-48. WU Bin,CAI Wanru.Effect of Shaoyao Gancao Decoction on IL-4,Il-8 and IgE of Asthma Rats[J].Fujian Journal of Traditional Chinese Medicine,2008,39(5):47-48.

[6] 李振球,麥志廣,盧鑒財,等.支氣管哮喘緩解期中醫(yī)證型與Th1/Th2失衡的相關性研究[J].中國中醫(yī)急癥,2015,24 (10):1728-1730. LI Zhenqiu,MAI Zhiguang,LU Jiancai,et al.Research on the Correlation of the Types of Syndrome of Traditional Chinese Medicine in the Stable Phase of Asthma and the Unbalanced Rate-Th1/Th2[J].Journal of Emergency in Traditional Chinese Medicine,2015,24(10):1728-1730.

[7] Oboki K,Ohno T,Saito H,et al.Th17 and Allergy[J]. Allergology International Official Journal of the Japanese Society of Allergology,2008,57(2):121-134.

[8] Semik．Orzech A,Bawzyk A，Pierzchala W．The role of intedeukin 17A in inducing neutrophilie inflammation in the pulmonary track[J].Pol Merkur Lekarski，2007（22）：163-168．

[9] Ying C,Laila A A,Paul-André R,et al.Th17-associated cytokines promote human airway smooth muscle cell proliferation[J].Faseb Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 2012,26(12):5152-5160.

[10]張方琪,楊學敏,唐元元,等.嗜酸性粒細胞在哮喘發(fā)病機制中的研究進展[J].中華肺部疾病雜志:電子版,2013,6(2): 55-58. ZHANG Fangqi,YANG Xuemin,TANG Yuanyuan,et al. Research progress of eosinophils in the pathogenesis of asthma[J].Chin J Lung Dis(Electronic Edition),2013,6(2): 55-58.

Effects of Shaoyao Gancao Decoction on the Th17 and Its Cytokine IL-17 in Rats with Asthma

HE Fei,RU Chuhui,SHEN Xiaoqiang,et al 1.Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310003),Zhejiang,China；2.HangZhou Medical College

[Objective]To observe the effects of Shaoyao Gancao Decoction on Th17 and IL-17 in rats with asthma,and to explore its mechanism in treating asthma.[Methods]Male SD rats were randomly divided into normal control group,model group,Shaoyao Gancao Decoction group,dexamethasone group and integrated TCM-WM group(n=8 for each group).Asthma was induced by intraperitoneal injection of ovalbumin(OVA)and forced inhalation of atomized OVA. BALF cells in each group were collected.Expression of IL-17 was detected by Elisa method.Numbers of Th17 cells in spleen were analyzed by flow cytometry.[Results]Compared with model group，the total number of cells and the number of eosinophils(Eos)in BALF were decreased significantly in the treated groups(P<0.01).Compared with model group，expression of IL-17 in lung homogenate was decreased significantly in the treated group(P<0.01). Expression of IL-17 was decreased significantly in the dexamethasone group than other treated groups(P=0.049 and 0.006.Compared with model group，Shaoyao Gancao Decoction group decreased the percentages of Th17 cells(P<0.01).There was no significant difference of expression of Th17 between Shaoyao Gancao Decoction group and the dexamethasone group(P>0.05).[Conclusion]Shaoyao Gancao Decoction can efficiently regulate the numbers of Th17 cells and IL-17,which may be one of its mechanisms in preventing and treating asthma.

Shaoyao Gancao Decoction;bronchoalveolar lavage fluid;asthma;Th17 cells;IL-17;experimental study

R331

：A

1005-5509（2017）02-0112-05

10.16466/j.issn1005-5509.2017.02.004

2016-10-17）

浙江省自然科學基金（LY17H290004）；杭州市科技發(fā)展計劃項目（20120533Q27）

Fund projects:Natural Science Foundation ofZhejiang Province(LY17H290004);Hangzhou science and technology development plans(20120533Q27)

徐儉樸，E-mail:xujianpul@163.com