王丹依陳京徐攀李冉夏嬌麗趙偉春

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江省中醫(yī)藥研究院

ITS2序列作為DNA條形碼鑒定紫堇屬植物的有效性研究

王丹依1陳京1徐攀2李冉1夏嬌麗1趙偉春1

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江省中醫(yī)藥研究院

[目的]利用DNA條形碼技術(shù)對6種紫堇屬植物進(jìn)行分子鑒定，評價(jià)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer 2,ITS2）序列對紫堇屬植物的鑒別能力。[方法]從江蘇南京、安徽合肥、浙江磐安、浙江縉云等地采集紫堇（Corydalis edulis）、黃堇（C.pallida）、小花黃堇（C.racemosa）、延胡索（C. yanhusuo）、東北延胡索（C.ambigua）和刻葉紫堇（C.incisa）6種紫堇屬植物共29份樣品。提取其DNA后用ITS2序列的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，運(yùn)用CodonCode Aligner軟件拼接和校對序列，MEGA5.1軟件分析序列并構(gòu)建K2P模型的鄰接樹。[結(jié)果]ITS2序列對所研究的29個(gè)樣品的擴(kuò)增和測序成功率均為100%。ITS2序列長度在225bp~248bp間，保守位點(diǎn)190個(gè)，變異位點(diǎn)71個(gè)，變異比例為27.2%。首次擴(kuò)增獲得小花黃堇和紫堇的ITS2序列并上傳至GenBank。6個(gè)物種的種內(nèi)遺傳距離為0~0.0206，種間遺傳距離為0.0403~0.1678，小花黃堇和黃堇的遺傳距離最??；黃堇與刻葉紫堇的遺傳距離最大。不同物種在鄰接樹中各自進(jìn)化為單系。6種紫堇屬植物的ITS2二級結(jié)構(gòu)均有不同程度的差異。[結(jié)論]ITS2序列能夠準(zhǔn)確鑒定紫堇、黃堇、小花黃堇、延胡索、東北延胡索和刻葉紫堇這6種紫堇屬植物，對中藥鑒定具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

紫堇屬；DNA條形碼；ITS2；遺傳距離；分子鑒定

紫堇屬（Corydalis DC.）隸屬于罌粟科，為1年生、2年生或多年生草本，約428種。我國有298種，歸入38組，南北各地均有分布，但以西南部最集中，產(chǎn)于青藏高原的約有120種，其中西藏就約有94種。浙江有15種，1變種，1變型，其中具有藥用價(jià)值的有12種[1]。比較常見的中藥有延胡索（C.yanhusuo）、夏天無（C.decumbens）和苦地?。–.bungeana）等，具有清熱解毒、止血鎮(zhèn)痛、活血散瘀、祛風(fēng)利氣等功效。

紫堇屬植物在形態(tài)上較為相似，無花時(shí)很難區(qū)別，極易混淆[2]。目前，關(guān)于紫堇屬物種的鑒定方法主要有性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別[3-5]等。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)以其對生物物種鑒別具有高效、簡便、客觀等特點(diǎn)，為藥用植物的鑒定提供了新的視野。DNA條形碼概念由加拿大分類學(xué)家 Paul Hebert于2003年首次提出[6]，是一種用基因組中的一段標(biāo)準(zhǔn)的、相對較短的DNA片段作為物種標(biāo)記來鑒定物種的新方法，在不同物種間具有通用性。該技術(shù)在動物中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，在植物中的研究也正在快速發(fā)展，選擇和評價(jià)可能的條形碼片段是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。大量的樣本研究表明內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer 2,ITS2）作為候選條形碼能較好的鑒定藥用植物[7-9]。

本研究選取ITS2序列對江浙一帶野外采集的6種紫堇屬植物進(jìn)行物種鑒別，考察該序列對該屬植物的鑒定能力，以期建立快速準(zhǔn)確鑒定該屬植物的分子方法，確保臨床用藥的安全性。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 29份紫堇屬樣品采自江蘇南京、安徽合肥、浙江磐安、浙江縉云等地，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)姚振生教授和浙江省中醫(yī)藥研究院浦錦寶副研究員依據(jù)形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)鑒定為紫堇、黃堇、小花黃堇、刻葉紫堇、延胡索和東北延胡索。樣品編號、名稱、采集地，見表1。樣品經(jīng)鑒定后用硅膠干燥保存。GEN BIOTECH CO.,LTD，批號：DP130227；2×Taq Master Mix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號：1312L；ITS2序列擴(kuò)增引物：F-Primer：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，R-Primer：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’由上海生物工程公司合成；2000DNA Marker購自上海萊楓生物科技有限公司，批號：G0417；瓊脂糖購自基因有限公司，批號：111860；硅膠購自蘇州盛達(dá)干燥劑廠，批號：201173021。

表1 紫堇屬植物樣品信息Tab.1 Information of Corydalis samples

1.3 儀器 混合球磨儀（MM400型，Retech-德國）；電泳儀（DYY-6C型，北京市六一儀器廠）；凝膠成像儀（Tanon-2500型，天能科技（上海）有限公司）。

2 方法

2.1 DNA提取 取經(jīng)硅膠干燥的植物莖葉20mg～30 mg，置于1.5mL離心管中，加入2個(gè)直徑2mm的鋼珠，使用混合球磨儀研磨（30次/s，2min），植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5μL，F(xiàn)-Primer 1μL，R-Primer 1μL，DNA模板（20ng·μL-1）2 μL，ddH2O 8.5μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 10min，變性94℃ 30s，退火56℃30s，延伸72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)，再延伸72℃ 10min。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳 分別取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000 DNA Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，凝膠成像儀觀察DNA片段并拍照。

2.4 PCR產(chǎn)物測序及分析 PCR產(chǎn)物由上海美吉生物公司進(jìn)行雙向測序。測序引物同于PCR擴(kuò)增引物，測序結(jié)果采用Codoncode Aligner軟件進(jìn)行校對拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)；利用MEGA5.1軟件進(jìn)行序列對比、變異位點(diǎn)分析，再計(jì)算遺傳距離及構(gòu)建鄰接樹[10]。用1000次重復(fù)bootstrap檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹各分支的支持率，以支持率≥50%為閾值作為成功鑒別物種的界限[11]。根據(jù)ITS2數(shù)據(jù)庫（http://its2.

1.2 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒購自TIAN－bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）預(yù)測ITS2二級結(jié)構(gòu)，并分析結(jié)構(gòu)上的差異。

3 結(jié)果

3.1 ITS2序列通用引物對樣品的PCR擴(kuò)增29份紫堇屬植物樣品均能用ITS2序列通用引物進(jìn)行有效地PCR擴(kuò)增，各樣品均得到單一的高亮度條帶，PCR擴(kuò)增片段大小為450bp～470bp，符合PCR產(chǎn)物測序要求。

3.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序、拼接及圖譜解析 29個(gè)樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序成功率為100%。采用Codoncode Aligner軟件對同一樣品雙向測序結(jié)果進(jìn)行拼接、組裝，并與ITS2序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，解析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的組成（部分結(jié)果見圖1、2），再去除擴(kuò)增產(chǎn)物兩端的序列，得到各樣品的ITS2序列并上傳至GenBank。1~3號樣品（紫堇）的ITS2序列完全相同，與4號樣品（紫堇）存在1個(gè)堿基差異，長度均為243bp；5、6、8號樣品（黃堇）的ITS2序列完全相同，與7號樣品（黃堇）存在1個(gè)堿基差異，序列最長，均為248bp；9~11號樣品（小花黃堇）的ITS2序列完全相同，序列長度為236bp；12~14號樣品（刻葉紫堇）的ITS2序列相同，與15、16樣品（刻葉紫堇）存在1個(gè)堿基差異，長度均為228bp；樣品17~23（延胡索）的ITS2序列完全相同，長度為238bp，樣品24（延胡索）的ITS2長度為242bp，樣品25（延胡索）的ITS2長度為244bp；樣品27、28（東北延胡索）的ITS2序列相同，與樣品26（東北延胡索）存在1個(gè)堿基差異，長度均為226bp，樣品29（東北延胡索）的ITS2序列最短，長度為225bp。

圖1 樣品1、2、3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解析圖譜Fig.1 PCR amplification sequence of sample 1,2 and 3

圖2 樣品9、10、11 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解析圖譜Fig.2 PCR amplification sequence of sample 9,10 and 11

3.3 ITS2序列的多序列比對分析 如圖3所示，29個(gè)樣品ITS2序列的保守位點(diǎn)190個(gè)，變異位點(diǎn)71個(gè)，變異比例27.2%。江蘇南京采集的紫堇樣品（編號1~4）與川鄂黃菫（C.wilsonii，登錄號：LN610772）和地柏枝（C.cheilanthifolia，登錄號：HE603320）的同源性均為99%。浙江縉云和浙江磐安采集的黃堇樣品（編號5~8，248bp）與GenBank中黃菫ITS2序列（登錄號：X85446，147bp）相似性為59%。兩者在+106、+124、+ 187、+197、+220、+223、+225、+226、+227、+237、+241堿基處有差異。浙江縉云采集的小花黃菫樣品（編號9~11）與地柏枝相應(yīng)序列（登錄號：HE603320）同源性為99%，與紫堇樣品（編號1~4）在+19、+27、+28、+ 30、+36、+38、+42、+43、+44、+46、+48、+55、+57、+59、+ 77、+99、+127、+185、+205堿基處有差異。安徽合肥的刻葉紫堇樣品（編號12~16）與GenBank中刻葉紫堇相應(yīng)序列（登錄號：FJ469599，DQ912889）的同源性為100%。浙江磐安和安徽合肥采集的延胡索（編號17~ 25）與 GenBank中延胡索 ITS2序列（登錄號：KT898276）的同源性為100%。浙江磐安采集的東北延胡索樣品（編號26~29）與GenBank中東北延胡索ITS2序列（登錄號：FJ469597）的同源性為100%。

3.4 遺傳距離分析 如表2所示，6種紫堇屬植物的種內(nèi)遺傳距離為0~0.0206，種間遺傳距離為0.0403~0.1678，小花黃堇和黃堇的種間遺傳距離最小，黃堇與刻葉紫堇的種間距離最大。6種植物ITS2序列的最小種間遺傳距離明顯大于最大種內(nèi)遺傳距離。

圖3 紫堇屬植物ITS2序列比對圖Fig.3 Comparison of ITS2 sequence among Corydalis

表2 紫堇屬植物ITS2序列種內(nèi)與種間相對遺傳距離Tab.2 Inter-specific and intra-specific genetic distance of ITS2 in Corydalis

3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 如圖4所示，各物種的不同樣品均先聚為一支。在此基礎(chǔ)上，紫堇與黃堇聚為一支，后又與小花黃堇聚為一支，表明三者親緣關(guān)系較近，并與東北延胡索聚為一大支。其他不同來源的延胡索先聚為一支，后又與刻葉紫堇聚為一支。從系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹可以看出不同物種的樣本可以明確區(qū)分，形成層次分明，互不重疊的鄰接樹。

圖4 基于ITS2序列構(gòu)建的紫堇屬植物的鄰接樹Fig.4 NJ-tree of Corydalis based on ITS2 sequence

3.6 二級結(jié)構(gòu)的初步分析 結(jié)果見圖5。延胡索、東北延胡索和刻葉紫堇3種植物的二級結(jié)構(gòu)相似，均為中心一個(gè)主環(huán)連接4個(gè)側(cè)鏈，但4個(gè)側(cè)鏈又存在細(xì)微差異，可以相互區(qū)分。黃堇和小花黃堇的結(jié)構(gòu)較為相似，但側(cè)鏈結(jié)構(gòu)存在差異。因此，該6種紫堇屬植物可通過ITS2二級結(jié)構(gòu)區(qū)分出來。

4 討論

紫堇屬植物具有較高的藥用價(jià)值，但其形態(tài)又較相似。因此，準(zhǔn)確鑒定各物種具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用ITS2作為DNA條形碼對紫堇屬植物進(jìn)行分子鑒定，獲得了6種紫堇屬植物的ITS2序列，其中包括小花黃堇和紫堇。在GenBank中有小花黃堇和紫堇的葉綠體基因組psbA-trnH序列，但未檢索到兩者的ITS2序列。本實(shí)驗(yàn)首次獲得小花黃堇和紫堇的ITS2序列。進(jìn)一步與GenBank中的ITS2序列進(jìn)行比對分析表明，上述兩個(gè)物種的ITS2序列與其他近緣種ITS2序列均具有良好的區(qū)分度，這為小花黃堇和紫堇的分類鑒定提供了新的、可靠的方法和手段，研究工作具有重要的科學(xué)意義。

紫堇花為粉紅色、紫紅色、紫色，黃菫的花為黃色，但二者均為具主根，地下無塊莖，葉多為羽狀分裂，苞片膜質(zhì)，花距短，柱頭常橫向兩臂，因此紫堇與黃菫同列為黃菫亞屬[12]。本文ITS2序列聚類分析表明，紫堇與黃堇聚為一支，這與上述形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果一致。在BLAST比對中，小花黃菫與地柏枝的同源性較高，這與形態(tài)學(xué)鑒定中將兩者均列于小花黃堇組,親緣關(guān)系較近相一致。東北延胡索聚為一支，不同來源的延胡索先聚為一支，后又與刻葉紫堇聚為一支，這一結(jié)果亦與這三個(gè)物種形態(tài)分析、文獻(xiàn)考證等結(jié)果一致[13]。

圖5 紫堇屬植物ITS2二級結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Second structure of ITS2 of Corydalis

根據(jù)本文ITS2序列的多序列比對分析和系統(tǒng)鄰接樹的結(jié)果（圖3和圖4）可知，采自安徽合肥的2個(gè)延胡索樣品（編號24、25）及采自浙江縉云的7個(gè)延胡索樣品（編號17~23）分別聚為一支后再聚在一起；采自浙江縉云的3個(gè)黃堇樣品（編號6~8）先聚為一支后再與采自浙江磐安的1個(gè)黃堇樣品（編號5）聚在一起，而本實(shí)驗(yàn)中所有的樣品均為非栽培種，表明同一物種在不同地域的遺傳變異大于該物種在同一地域內(nèi)的遺傳變異，這可能反映不同地域的土壤、氣溫等外部環(huán)境條件對物種進(jìn)化的影響。

在本實(shí)驗(yàn)中，黃菫的ITS2序列與GenBank中黃菫ITS2序列（登錄號：X85446）相似性僅為59%，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)GenBank中黃菫ITS2序列較本實(shí)驗(yàn)的4個(gè)黃菫樣品缺失+1～+100堿基，該序列檢測時(shí)間較早（1995年），序列可能并不完整。此外，GenBank中也未見該樣品ITS2序列擴(kuò)增的引物序列、樣品的采集地等相關(guān)信息，這有待于進(jìn)一步考證。

本文構(gòu)建的鄰接樹中，6種植物均能很好的各自形成單系，樣品間變異度適中，且其種間、種內(nèi)遺傳距離差異較大，結(jié)果表明ITS2序列的通用性較好。此外，ITS2序列可以進(jìn)行RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，解決高級分類階元的多重序列對比困難的問題，其二級結(jié)構(gòu)也有一定的鑒定應(yīng)用價(jià)值。因此，ITS2序列適合作為鑒定該6種紫堇屬植物的DNA條形碼。但要確定ITS2序列是否對所有紫堇屬植物都有鑒定效果，則需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本采集量來進(jìn)行驗(yàn)證。

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Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying the Genus Corydalis

WANG Danyi1,CHEN Jing1,XU Pan2,et al 1.College of LifeSciences,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2.Science Technology Department of Zhejiang Province

[Objective]Using DNA barcoding technology to identify 6 species of the genus Corydalis,and evaluate the identification ability of the ITS2 sequence.[Methods]Twenty-nine samples of Corydalis edulis,C.pallida,C.racemosa,C.yanhusuo,C.ambigua and C.incise were collected from Nanjing Jiangsu,Hefei Anhui,Pan'an Zhejiang,and Jinyun Zhejiang,respectively.The genomic DNA extracted from the plants was PCR amplified with the universal primers of ITS2.Sequences were assembled and proofread using the CodonCode Aligner and analyzed by MEGA 5.1.The neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree was constructed based on the Kimura-2-parameter model.[Results]ITS2 regions of all samples were successfully PCR amplified and sequenced.The lengths of them were 225bp~248bp.The conserved sites of them were 190.The variable sites were 71.The variation ratio was 27.2%.ITS2 sequences of C. edulis and C.racemosa were amplified for the first time and uploaded to GenBank.The intra-specific genetic distance of all samples was 0~0.0206.The inter-specific genetic distance of them was 0.0403~0.1678.The inter-specific genetic distance between C.racemosa and C.pallida was the smallest.The inter-specific genetic distance between C.pallida and C.incisa was the largest.Each species showed monophyletic on NJ-tree.The ITS2 secondary structure of each species was different.[Conclusion]ITS2 region as a barcode can accurately identify the genus Corydalis,and has a potential value of application for identification of traditional Chinese medicine.

Corydalis;DNA barcodes;ITS2;genetic distance;molecular identification

R331

：A

：1005-5509（2017）02-0097-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.02.001

2016-09-21）

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目 （2015C32076）；國家中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目 （201407002）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014PCZX004）

Fund projects:Science and Technology Plan ofZhejiang Province(2015C32076);State Administration ofTraditional Chinese MedicineofChina(201407002);TraditionalChinese Medicine Science and Technology Plan ofZhejiang Province (2014PCZX004)

趙偉春，E-mail：weichunzhao@hotmail.com