（1.河南森隆獸藥有限公司，河南 鄭州 450000；2.河南省獸藥監(jiān)察所）

豫西地區(qū)雞源大腸桿菌的耐藥性研究

王清玲1，王麗2，劉淑鶴1

（1.河南森隆獸藥有限公司，河南 鄭州 450000；2.河南省獸藥監(jiān)察所）

從洛陽(yáng)地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)采集病料，經(jīng)大腸桿菌顯色培養(yǎng)基鑒定分離得耐藥性大腸桿菌菌株。對(duì)21個(gè)抗菌藥物進(jìn)行抗菌活性測(cè)定，采用與膜通透促進(jìn)劑乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑舒巴坦鈉聯(lián)用測(cè)定抗菌藥物的抗菌活性是否受影響。

大腸桿菌；耐藥；96孔板；聯(lián)合用藥；MIC（50）；MIC（90）

大腸桿菌是埃希氏菌屬中最重要的一種細(xì)菌，屬于革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌。隨著時(shí)間的推移，大腸桿菌的耐藥率大幅度上升，多重耐藥菌株劇增，耐藥譜增寬，大腸桿菌的耐藥問(wèn)題已成為影響人類健康和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。近年來(lái)，集約化養(yǎng)禽場(chǎng)的其他疾病得到基本控制，但大腸桿菌病有明顯的上升趨勢(shì)，主要表現(xiàn)為大腸桿菌的耐藥能力不斷增強(qiáng)，使大腸桿菌病的動(dòng)物臨床用藥選擇空間不斷縮小，治療效果也很難保障。因此，對(duì)雞源大腸桿菌的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)與分析，對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥及控制該病的流行非常重要。近年來(lái)，埃希氏大腸桿菌的耐藥性呈上升趨勢(shì)，關(guān)于大腸桿菌對(duì)抗生素的耐藥性問(wèn)題，已在世界范圍內(nèi)引起重視［1］。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)菌株

無(wú)菌采集病死雞的心、肝、脾、氣囊、十二指腸等，蘸取臟器的橫切面組織液。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1.2 g、酵母粉0.6 g、氯化鈉1.2 g、用蒸餾水補(bǔ)充至120 ml。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：稱取麥康凱瓊脂粉末54 g，加入1 000 ml蒸餾水中，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15 min備用。

1.3 器材與試劑

超凈工作臺(tái)，無(wú)菌96孔板，恒溫振蕩器，酶標(biāo)儀，微量可調(diào)移液器，隔水式恒溫培養(yǎng)箱，蛋白胨，酵母提取物，TTC粉劑，NaCl，麥康凱瓊脂。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 大腸桿菌的篩選與培養(yǎng) 從采取的病料中鉤菌劃線于麥康凱瓊脂平板上進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)與分離，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)20～22 h觀察生長(zhǎng)情況，選定具有大腸桿菌菌落特征的可疑菌落繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)保存。直至呈現(xiàn)單一的中間深紅外周桃紅色、圓形、邊緣整齊、光滑、濕潤(rùn)、中等大小的菌落。

1.4.2 藥敏性測(cè)定 采用96孔板微量稀釋法將抗菌藥物稀釋成最終濃度分別為1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml、128 μg/ml 8個(gè)梯度濃度，加入菌懸液后將96孔板搖勻，然后放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，再將96孔板各個(gè)附孔（邊緣附空除外）各加20 μl TTC染色，搖勻，37℃靜置4 h后吸出各附孔中的上清液，加200 μl二甲基亞砜（DMSO）溶解剩余的不溶絡(luò)合物，用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度。

1.4.3 聯(lián)合用藥 選藥敏性差的抗菌藥物分別與舒巴坦鈉和乙二胺四醋酸（EDTA）聯(lián)合用藥，再測(cè)抗菌藥物與舒巴坦鈉和EDTA同時(shí)聯(lián)合用藥，使加入的舒巴坦鈉與抗菌藥的濃度比為2∶1，EDTA的最終濃度為512 μg/ml，測(cè)定EDTA和舒巴坦鈉單獨(dú)與抗菌藥物聯(lián)用時(shí)對(duì)抗菌藥物抗菌活性的影響，及同時(shí)與抗菌藥物聯(lián)用時(shí)對(duì)活性的影響。

1.5 結(jié)果判定

抗菌藥物對(duì)大腸桿菌的抗菌活性用最終算出的最低抑菌濃度來(lái)判定。用聯(lián)合用藥的抗菌活性與單一用藥時(shí)抗菌藥物的抗菌活性對(duì)比，抑菌效果高于4倍或4倍以上的說(shuō)明EDTA或（和）舒巴坦鈉對(duì)抗菌藥的活性有影響。

2 試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)藥敏性在藥物最高濃度（128 μg/ml）未達(dá)到MIC（50）的及在128 μg/ml時(shí)對(duì)應(yīng)的最大抑菌率由小到大的順序見(jiàn)表1：

根據(jù)MIC（50）值對(duì)抗菌藥物進(jìn)行藥敏性由高到低進(jìn)行排序，結(jié)果見(jiàn)表2：

根據(jù)MIC（90）值對(duì)抗菌藥物進(jìn)行藥敏性由高到低進(jìn)行排序，結(jié)果見(jiàn)表3：

表1 未達(dá)到最低抑菌濃度MIC（50）值的藥物排序表

表2 按最低抑菌濃度MIC（50）值大小的藥物排序表

表3 按最低抑菌濃度MIC（90）值大小的藥物排序表

3 結(jié)果分析

3.1 單一用藥試驗(yàn)結(jié)果分析

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示在21個(gè)抗菌藥物中有5個(gè)藥物的抑菌效果已經(jīng)很不明顯，對(duì)此大腸桿菌基本喪失了抑制作用。剩下的16個(gè)抗菌藥的抑菌率都可以達(dá)到MIC（50）值，保持一定的抗菌作用，占總藥物數(shù)量的76.2%；只有6個(gè)藥物抗菌能力可以達(dá)到MIC（90）值，具有很高的抗菌活性，占總藥物的28.6%?？梢?jiàn)此株大腸桿菌對(duì)卡那霉素、鹽酸恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、頭孢拉定和慶大霉素等藥物同時(shí)產(chǎn)生了很高的耐藥性；對(duì)鹽酸黃連素、痢菌凈、曲松鈉、磺胺六甲嘧啶鈉、鹽酸頭孢噻呋、磷酸素鈉、鹽酸土霉素、阿莫西林、乳酸諾氟沙星等藥物有較高的敏感性，對(duì)這些藥物的耐藥能力還不是很明顯；而對(duì)利福平、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟鈉、乳酸左氧氟沙星和痢菌凈等藥物有很高的敏感性，尚未對(duì)這些藥物長(zhǎng)生耐藥性。

3.2 聯(lián)合用藥試驗(yàn)結(jié)果分析

卡那霉素的聯(lián)合用藥數(shù)據(jù)顯示：卡那霉素與EDTA（512 μg/ml）聯(lián)用其抗菌效果整體有明顯的提高，隨著卡那霉素濃度的增加，抗菌活性呈穩(wěn)步提高趨勢(shì)，但是提高的幅度并不大，卡那霉素的濃度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分別是69.05%和80.60%；卡那霉素與舒巴坦鈉聯(lián)合用藥的抑菌效果隨卡那霉素和舒巴坦鈉的濃度提高（抗菌藥物∶舒巴坦鈉=1∶2）有大幅度的提高，卡那霉素濃度在16 μg/ml時(shí)的抑菌率達(dá)到52.72%，卡那霉素濃度為128 μg/ml時(shí)抑菌率達(dá)到99.20%，卡那霉素與EDTA和舒巴坦鈉同時(shí)聯(lián)合用藥的抑菌率提高的更加明顯，卡那霉素濃度在1μg/ml的抑菌率可達(dá)74.03%，在16 μg/ml濃度時(shí)的抑菌率可達(dá)到91.85%，而在卡那霉素單一用藥濃度為128 μg/ml時(shí)的抑菌率只有30.85%，所以，與卡那霉素單一用藥相比，EDTA和舒巴坦鈉分別或同時(shí)與卡那霉素聯(lián)合用藥時(shí)，對(duì)卡那霉素的抗菌活性均有很大的影響。

表4 聯(lián)合用藥對(duì)應(yīng)的抗菌活性

鹽酸恩諾沙星聯(lián)合用藥數(shù)據(jù)顯示：鹽酸恩諾沙星與EDTA聯(lián)合用藥的抑菌效果整體提高很多，抑菌率隨鹽酸恩諾沙星的濃度提高而穩(wěn)步提高，鹽酸恩諾沙星濃度在1μg/ml時(shí)候的抑菌率已經(jīng)達(dá)到61.34%，在64 μg/ml時(shí)的抑菌率達(dá)到97.37%；鹽酸恩諾沙星與舒巴坦鈉聯(lián)用的抑菌效果隨藥物濃度的提高有大幅度的提高，鹽酸恩諾沙星的濃度在8 μg/ml時(shí)，抑菌率達(dá)到55.63%，濃度在32 μg/ml時(shí)的抑菌率達(dá)到93.67%；鹽酸恩諾沙星與EDTA和舒巴坦鈉同時(shí)聯(lián)用的抑菌效果提高更加明顯，在鹽酸恩諾沙星的濃度為1μg/ml時(shí)候的抑菌率可高達(dá)74.97%，32 μg/ml的藥物濃度抑菌率可達(dá)99.24%，而在鹽酸恩諾沙星單一用藥濃度為128 μg/ml時(shí)的抑菌率為32.96%，所以與鹽酸恩諾沙星單一用藥相比，EDTA和舒巴坦鈉分別或同時(shí)與鹽酸恩諾沙星聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)鹽酸恩諾沙星的抗菌活性均有很大的影響。

鹽酸環(huán)丙沙星的聯(lián)合用藥數(shù)據(jù)顯示：鹽酸環(huán)丙沙星與EDTA聯(lián)合用藥的抑菌率整體有明顯的提高，但隨著鹽酸環(huán)丙沙星的濃度增加其抑菌率的提高并不是很明顯，鹽酸環(huán)丙沙星的濃度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分別是73.54%和86.25%；鹽酸環(huán)丙沙星與舒巴坦鈉聯(lián)合用藥的抑菌效果隨鹽酸環(huán)丙沙星的藥物濃度的提高有大幅度的提高，鹽酸環(huán)丙沙星的濃度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分別是7.02%和99.80%，可見(jiàn)藥物濃度對(duì)抑菌效果有很大影響，但是在藥物濃度低于16μg/ml時(shí)鹽酸環(huán)丙沙星與舒巴坦鈉聯(lián)合用藥的抑菌率卻比單一用鹽酸環(huán)丙沙星的抑菌率低，而在濃度大于16 μg/ml時(shí)的抑菌率提升非常大，鹽酸環(huán)丙沙星的濃度在32 μg/ml時(shí)抑菌率達(dá)到98.98%，可見(jiàn)鹽酸環(huán)丙沙星與舒巴坦鈉聯(lián)合用藥在藥物濃度超過(guò)16 μg/ml時(shí)才有提高抗菌活性的作用，并且作用很明顯。鹽酸環(huán)丙沙星與EDTA和舒巴坦鈉聯(lián)合用藥的抑菌效果不但對(duì)整體作用有提高，而且隨藥物濃度提高呈尾部提高的趨勢(shì)，藥物濃度在1 μg/ml時(shí)的抑菌率為74.22%，在16 μg/ml時(shí)的抑菌率達(dá)到92.34%，而鹽酸環(huán)丙沙星單獨(dú)用藥時(shí)在濃度為128 μg/ml時(shí)的抑菌率為43.89%，所以與單一用藥相比，EDTA和舒巴坦鈉分別或同時(shí)與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合用藥對(duì)鹽酸環(huán)丙沙星的抗菌活性均有很大的影響。

頭孢拉定聯(lián)合用藥數(shù)據(jù)顯示：頭孢拉定與EDTA聯(lián)合用藥的抑菌效果整體有很大提高，但是隨頭孢拉定的藥物濃度的增加對(duì)應(yīng)的抑菌率提高幅度卻很小，頭孢拉定的濃度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分別是60.42%和85.93%；頭孢拉定與舒巴坦鈉聯(lián)合用藥的抑菌率隨藥物濃度呈大幅度的提高趨勢(shì)，但是在頭孢拉定的濃度為128 μg/ml時(shí)的抑菌率只達(dá)到65.46%，較單一使用頭孢拉定時(shí)128 μg/ml的抑菌率為45.74%比，抑菌率的提升并不是很明顯，由于聯(lián)合用藥時(shí)藥物濃度在32 μg/ml時(shí)的抑菌率為57.56%，比單一用藥時(shí)128 μg/ml抑菌率為45.74%的抑菌率要高，舒巴坦鈉使頭孢拉定的抑菌活性提高超過(guò)4倍，所以舒巴坦鈉對(duì)頭孢拉定的抗菌活性有影響。頭孢拉定與EDTA和舒巴坦鈉聯(lián)合用藥的抑菌率整體上有很大的提高，隨藥物濃度的提高抑菌率提高范圍不大，頭孢拉定濃度在1 μg/ml時(shí)候抑菌率為73.20%，在16 μg/ml時(shí)抑菌率達(dá)到93.65%，頭孢拉定單一用藥時(shí)濃度在128 μg/ml時(shí)的抑菌率為45.74%，所以，EDTA和舒巴坦鈉同時(shí)與頭孢拉定聯(lián)合用藥對(duì)頭孢拉定的抗菌活性的影響非常大，而舒巴坦鈉與頭孢拉定聯(lián)合用藥對(duì)頭孢拉定的抗菌活性影響較小。

綜上所述，EDTA可以使抗菌藥物的活性有很大的提高，抗菌藥物濃度在1 μg/ml時(shí)的抑菌率可到達(dá)60%以上，對(duì)大腸桿菌病具有較強(qiáng)的治療效果，并且EDTA的市場(chǎng)價(jià)格很低，適合于工業(yè)生產(chǎn)和養(yǎng)殖戶的大規(guī)模使用；舒巴坦鈉的抑菌效果隨濃度的增加而增加，一般在藥物濃度為16 μg/ml時(shí)候抑菌率才可以達(dá)到50%以上，但是不同藥物對(duì)舒巴坦鈉的影響效果不同，并且舒巴坦鈉的市場(chǎng)價(jià)格較貴，不適合大規(guī)模使用。

4 討論

該試驗(yàn)的藥敏數(shù)據(jù)一方面為該地區(qū)的用藥提供了一定的參考價(jià)值，另一方面也顯示了該地區(qū)動(dòng)物源性大腸桿菌的耐藥性極其嚴(yán)重，有必要對(duì)本地區(qū)動(dòng)物源性細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)［2］。由于各地區(qū)的養(yǎng)殖模式和用藥習(xí)慣不同，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性也存在一定的差異，所以各地區(qū)要根據(jù)實(shí)際情況對(duì)本地區(qū)細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)和抗菌藥的用藥管理。另外，通過(guò)對(duì)耐藥菌的耐藥機(jī)理研究，合理搭配藥物使失去抗菌活性的藥物重新恢復(fù)抗菌能力，從而有效控制細(xì)菌耐藥譜的擴(kuò)增。

［1］汪洋，王育娜，易力，等.洛陽(yáng)地區(qū)雞源大腸桿菌的耐藥性研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，（2）：124-125.

［2］茍清碧.鴨源致病性大腸桿菌耐藥性研究.西南大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008：5.

S852.61＋2

：B

：1004-5090（2017）01-0003-03

2016-10-13）