花生幼苗對重復干旱脅迫的生理響應

秦斐斐,慈敦偉

山東省花生研究所,青島 266100

植物不能像動物一樣可以很快地逃避惡劣環(huán)境如強光、高溫、寒冷、干旱、鹽堿、病害等,環(huán)境脅迫嚴重影響植物的生長發(fā)育,造成作物的嚴重減產。自然界各種環(huán)境變化對植物的影響是多變、逐漸積累、重復或交替發(fā)生的,植物在其生命周期中往往會遭受多次不同程度的環(huán)境脅迫。通常情況下,單一的環(huán)境脅迫會給植物造成嚴重的傷害,如細胞脫水、膜系統(tǒng)破壞、酶活性受影響、細胞代謝紊亂,植株生長受到抑制,進而影響產量。植物在長期的進化中具備了自身調節(jié)機制如脅迫感應、信號傳導、基因調節(jié)、生理改變,以適應或記憶過去的脅迫遭遇,并快速地對環(huán)境變化做出反應來抵抗未來的環(huán)境脅迫。因此,研究植物適應重復多變的環(huán)境變化的機制對作物生產具有重要的指導意義。最近幾年國內外研究提出“脅迫記憶”機制解釋植物對多變、積累、重復或交替發(fā)生的環(huán)境脅迫的自身調節(jié)和適應[1- 6]。植物神經生物學認為,植物具有“脅迫記憶智能”,能夠分辨積極和消極的“經歷”并“記憶”這種經歷,對再次面臨的環(huán)境變化或脅迫增強抗性[7],這種對脅迫“記憶”的過程,稱為priming、hardening、conditioning、acclimation等[6,8]。例如,煙草植物經茉莉酮酸甲酯預處理后表現“免疫記憶”,積累尼古丁以應對再次茉莉酮酸甲酯處理[9]。非致死高溫的梯度預處理增加致死高溫下擬南芥的存活率[10],脅迫濃度的ABA重復預處理促使光誘導的氣孔開放[11],強光預處理增強氧化脅迫和強光脅迫的耐性[12-13],高滲刺激或氧化預脅迫改變滲透脅迫下Ca2+信號并伴隨長期的體細胞記憶和表觀基因組的改變[14-15]。脫水預處理增加擬南芥[2,3]、玉米[16]葉片保水能力,SA/BABA預處理增強玉米、黃瓜、水稻幼苗的耐寒性[17],播種前種子鹽水浸泡處理的小麥、西紅柿植株表現明顯的耐鹽性[18-19]。小麥開花前單次或兩次干旱預刺激減輕后期干旱脅迫帶來的危害從而增加小麥的灌漿[20]。大量研究表明,植物可以識別并記憶初始脅迫,再次暴露于生物或非生物脅迫時表現更為迅速和強烈的生理防御以增加其生存的機會。對于生長在干旱和半干旱地區(qū)的作物,干旱頻發(fā)嚴重影響著作物經濟產量和品質?；ㄉ侵匾挠土虾徒洕魑?屬于抗旱耐瘠的作物,然而每年約有20%的減產由于干旱造成,在栽培的不同年份也容易多次在苗期、開花期等遭遇干旱脅迫。大部分關于花生干旱或缺水的研究主要集中在單一的干旱條件下,而實際生產中干旱或缺水環(huán)境是重復發(fā)生的,前一次的干旱脅迫可能是對后一次干旱或其他脅迫的馴化?；ㄉ缙诟珊靛憻捒梢蕴岣弋a量已經得到實踐的證實[21],然而其具體機制并不清楚。本研究集中在花生苗期對其進行預干旱-重復干旱脅迫,研究預干旱脅迫對花生幼苗在后一次干旱脅迫下生理響應的變化和對初始干旱的適應機制,揭示其干旱脅迫“記憶”的生理機制,期望為指導花生的實際生產提供一定的理論依據。

1 試驗材料與設計

供試花生品種為“花育20”。于2015—2016年在山東省花生研究所防雨棚內進行盆栽試驗,采用直徑23 cm、高18 cm的花盆,每盆裝土3 kg,土壤為砂壤土。選取生物量一致的花生種子(平均0.68 g/粒)播種,4穴/盆,出苗后間苗保留3株長勢相近的幼苗。播種時間分別為6月12日(2015年)和6月13日(2016年)。

本試驗共設3個處理：1)對照(Control),正常澆水；2)無預干旱脅迫的幼苗進行干旱脅迫(D)；3)預干旱脅迫的幼苗進行重復干旱脅迫(DD)。試驗為單因素隨機分組設計,每組3個處理,每個處理9盆,重復3組,共81盆。設置土壤含水量控制在田間持水量的75%為對照,花生出苗后1周開始預干旱脅迫,控制土壤含水量為田間持水量的35%,預干旱脅迫時間為5 d,脅迫結束后復水。對預干旱脅迫復水6d后的幼苗進行5 d重復干旱脅迫,控制土壤含水量為田間持水量的35%,同時對未經預干旱脅迫的幼苗進行5 d干旱脅迫,脅迫結束后復水恢復正常生長。根據干旱處理時間,試驗劃分為3個時期,stage I預干旱脅迫時期,stage II重復干旱脅迫時期,stage III重復干旱后復水時期。試驗處理見表1。采用稱重法控制各處理不同時期土壤含水量。

表1 試驗處理

2 測定項目與方法

2.1 葉片相對含水量測定

分別在Stage I和Stage II脅迫處理第5天取混合葉片測定葉片相對含水量,每個處理樣本重復數(n)為6,葉片相對含水量(LRWC)計算公式如下：LRWC (%)=(鮮重-干重)×100/(吸水飽和后鮮重-干重)。

2.2 光合曲線和光合滯后的測定

分別在Stage I和Stage II脅迫第5天,Stage III復水后1天測定光合。參考Xu等[22]的方法,采用CIRAS- 3便攜式光合作用測定系統(tǒng)(PP System, U.S.A.)對主莖倒1葉分別在0,200,500,800,1200,1600,2000 μmol m-2s-1光強下測定光合速率。對3次測定光合速率數據平均值做光強-光合速率曲線,曲線公式為PN=PC(1-e-KI)-RD,其中PN凈光合速率,PC最大光合勢能,RD暗呼吸速率,K半時間常數,I光照強度,YQ最大光量子產量(YQ=KPC)。

2.3 氣孔導度和氣孔導度滯后的測定

測定光合速率的同時測定氣孔導度,氣孔導度-光強曲線公式gS=gC(1-e-αI)-gO,其中gS氣孔導度,gC最大氣孔導度,gO0 μmol m-2s-1光強時氣孔導度,α氣孔開度相關常數,I光照強度。氣孔導度滯后計算方法同HP。

2.4 脯氨酸測定

參照Bates等[24]和Marin等[25]的酸性茚酸酮測定,稍作修改。0.3g混合葉片經5 mL 3%磺基水楊酸100℃水浴10 min作為脯氨酸提取液,脯氨酸提取液∶冰醋酸∶2.5%酸性茚酸酮(1∶1∶1)混合液100℃水浴30 min后冰浴終止反應,加入4 mL甲苯提取,520 nm測定吸光值。

2.5 超氧陰離子和MDA測定

超氧陰離子參考采用Bissenbaev等[26]羥胺氧化法。MDA采用硫代巴比妥酸法[27]。

2.6 抗氧化酶活性測定

抗氧化酶活性液提取參考Bradford方法[28],SOD參考Beyer和Fridovich[29]和Chakrabarty等[30]NBT法,135 μmol m-2s-1光強下照光5 min。CAT測定參考Beers和Sizer[31]方法,POD參考Khalil等[32]愈創(chuàng)木酚氧化法。

2.7 數據處理

用Origin 7.5軟件進行數據整理和作圖,用SAS 8.0數據分析軟件進行統(tǒng)計分析,采用LSD法進行差異顯著性檢驗。

3 結果

3.1 重復干旱提高葉片相對含水量

預干旱脅迫影響幼苗的生長發(fā)育,表現明顯的干旱特征,地上部矮小,葉片萎焉,葉片相對含水量降低到67.30%(圖1)。對花生幼苗進行重復干旱脅迫,發(fā)現干旱脅迫(D)處理幼苗葉片萎焉的程度比重復干旱脅迫(DD)處理高,但DD處理植株比D處理更矮小,DD處理葉片相對含水量(64.82%)顯著高于D處理(53.34%)(圖1)。因此,預干旱脅迫顯著提高了重復干旱脅迫下花生幼苗葉片的相對含水量。

圖1 葉片相對含水量Fig.1 Leaf relative water content左,預干旱脅迫5天；右,重復干旱5天;小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05); 大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)

3.2 重復干旱減少脯氨酸的積累

圖2 花生幼苗葉片脯氨酸含量Fig.2 Proline content in leaves of peanut seedlings大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)

花生幼苗在Stage I時期經預干旱脅迫后,葉片迅速大量積累脯氨酸(471.71 μg/g鮮重)以防御干旱脅迫(圖2)。Stage II重復干旱脅迫時期,D處理花生幼苗葉片中脯氨酸含量超過3500 μg/g鮮重,約為對照的45倍。DD處理葉片中積累的脯氨酸含量(1312.68 μg/g鮮重)僅為D處理的1/3,呈極顯著差異。Stage III復水后各處理幼苗葉片中脯氨酸含量急劇減少,但DD處理葉片中脯氨酸含量降低到150.42 μg/g鮮重,仍低于D處理(422.75 μg/g鮮重),對照在3個時期脯氨酸水平無明顯差異。

3.3 重復干旱降低MDA和含量

干旱脅迫可以引起植物體內活性氧自由基積累,進而導致細胞膜脂過氧化,產生過量MDA,造成細胞膜系統(tǒng)受到破壞。本試驗,Stage I預干旱脅迫增加花生幼苗葉片MDA的積累,比對照高40.56%(圖3)。Stage II重復干旱脅迫時期,D處理葉片中積累的MDA含量是對照的107.94%,而DD處理葉片中積累的MDA水平僅是D處理的38.19%,甚至比對照葉片中MDA含量低25.91%,但未達到極顯著差異。Stage III復水后,D和DD兩處理MDA降低到與對照無顯著差異。

2.4 重復干旱降低抗氧化酶活性

預干旱脅迫促使花生幼苗啟動抗氧化酶保護系統(tǒng),本試驗測定了SOD、CAT和POD活性,結果如圖4所示,預干旱脅迫(Stage I)顯著增強葉片中SOD和CAT活性,POD活性有所增加但與對照無顯著差異。Stage II重復干旱脅迫時期,D處理SOD和POD活性極顯著的高于對照,分別是對照的2.45倍和3.62倍,DD處理葉片中SOD和POD活性顯著低于D處理,尤其POD活性降低地更為顯著,僅為D處理的56.43%。DD處理葉片中CAT活性雖低于對照和D處理,但無顯著差異。Stage III復水后,D和DD兩處理葉片中SOD活性與對照無顯著差異,但CAT和POD均低于對照。

圖3 花生幼苗葉片MDA和含量Fig.3 MDA and contents in leaves of peanut seedlings大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)

圖4 花生幼苗葉片抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activities in leaves of peanut seedlings大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)

3.5 重復干旱增強葉片光合能力和氣孔導度

3.5.1 光合曲線

光合速率-光強曲線(圖5)可以看出,預干旱脅迫抑制了花生幼苗葉片的光合作用,表現在降低每個光強下的光合速率(PN)。在Stage II重復干旱脅迫時期,花生幼苗由于受到干旱脅迫的影響光合速率接近于0,經過預干旱脅迫的DD處理葉片光合速率稍高于D處理。Stage III復水后,兩處理均低于對照,但DD處理在光強超過500 μmol m-2s-1時光合速率顯著的高于D處理。

從光合曲線各參數的結果(表2)看出,Stage I預干旱脅迫顯著降低了葉片最大光合勢能(PC)、最大光量子產量(YQ),增強暗呼吸速率(RD)。Satge II時期,D處理的PC(4.8 μmol m-2s-1)僅為對照的12.9%；YQ(0.03646 mol/mol)僅為對照的39.5%；半時間常數K(7.58×10-3)代表光合速率達到最大光合勢能63%時所用的時間極顯著大于對照。與D處理相比,DD處理顯著提高PC和YQ,降低K值。Stage III復水后,未經過預干旱脅迫的D處理,PC(25.1 μmol m-2s-1)顯著低于對照(32.8 μmol m-2s-1),而DD處理PC(32.7 μmol m-2s-1)與對照(32.8 μmol m-2s-1)無顯著差異,D和DD處理YQ均顯著高于對照,D處理的K值大于對照,而DD處理的K值與對照無顯著差異。

3.5.2 光合滯后

花生幼苗在Stage I預干旱脅迫下測定光合速率,模擬光合曲線,結果發(fā)現同一處理下,光強從0—2000 μmol m-2s-1增加時得到的光合曲線,與光強再從2000 μmol m-2s-1逐漸減少到0 μmol m-2s-1時得到的光合曲線不吻合,兩條曲線所夾的面積不同(圖6)。與光強從低到高逐漸增加時每個光強下的PN相比,光強再次從高到低減少時,PN偏高或偏低,即同樣光強下光合曲線并不吻合,這種現象稱為光合滯后[23]。

圖5 花生幼苗葉片光合曲線Fig.5 Photosynthetic response curves in leaves of peanut seedlings

時期Stages處理Treatment最大光合勢能(PC)Photosyntheticcapacity(PC)/(μmolm-2s-1)暗呼吸(RD)Darkrespiration(RD)/(μmolm-2s-1)最大光量子產量(YQ)Maximumquantumyield(YQ)/(mol/mol)半時間常數(K)(×10-3)Halftimeconstant(K)(×10-3)/(m2sμmol-1)I預干旱對照30．8A1．3B0．04041a1．31aPre-drought預干旱23．8B2．1A0．03046b1．28bII重復干旱對照37．1a4．0B0．09238A2．49CRecurrentdrought干旱4．8c2．5C0．03646B7．58A重復干旱7．3b6．1A0．04605B6．30BIII復水對照32．8A5．3B0．08462B2．58BRe-watering干旱25．1B7．7AB0．09438A3．76A重復干旱32．7A9．9A0．09254AB2．83B

各參數由PN=PC(1-e-KI)-RD計算得到; 小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)；大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)

本試驗中,Stage I預干旱脅迫時期,對照和預干旱脅迫處理當光強從2000—0 μmol m-2s-1減少時,同一光強下的PN高于從0—2000 μmol m-2s-1增加時的PN。兩條曲線所夾的面積,即光合滯后面積(定積分值),預干旱脅迫處理極顯著大于對照,滯后中值和光合滯后率(HP10.40)均極顯著高于對照(HP7.37)(表3)。Stage II重復干旱脅迫時期,D處理當光強從2000—0 μmol m-2s-1降低時得到的光合曲線,同一光強下PN低于光強從0—2000 μmol m-2s-1增加時的PN,光合滯后面積(定積分值4067.72)與對照(4333.13)無顯著差異。而DD處理,由于干旱脅迫導致光合速率極低,但兩條光合曲線重疊性很好,光合滯后面積(2805.36)、滯后中值(1.40)和光合滯后率HP(0.45)均極顯著的低于對照和D處理。Stage III復水時期,DD處理光合滯后面積、滯后中值和滯后率均極顯著低于對照,D處理復水后HP為1.25,為3個處理中最低。

圖6 花生幼苗葉片光合滯后Fig.6 Photosynthetic hysteresis in leaves of peanut seedlings實心標記為各處理光強從0—2000 μmol m-2 s-1增加時測得的數據,同一處理空心標記為光強從2000—0 μmol m-2 s-1降低時測得的數據

時期Stages處理Treatment定積分值DefiniteIntegrals積分中值Integralmean滯后中值Hysteresismean光合滯后率HP/%PhotosynthetichysteresisI預干旱對照3166．69B21．49A1．58B7．37BPre-drought預干旱3755．56A18．06B1．88A10．40AII重復干旱對照4333．13A31．86A2．17A6．80ARecurrentdrought干旱4067．72A3．98B2．03AB0．51B重復干旱2805．36B4．49B1．40B0．45BIII復水對照7593．18A30．25A3．80A12．55ARe-watering干旱548．90C22．00B0．27C1．25C重復干旱3962．05B28．91A1．98B6．85B

大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)

3.5.3 氣孔導度

干旱和水分虧缺導致花生幼苗葉片失水,影響氣孔開閉。在3個處理時期測定光合的同時測定氣孔導度,分析氣孔導度-光強曲線,結果如圖7所示。Stage I預干旱脅迫時期,正常水分下的對照和預干旱脅迫的花生幼苗葉片氣孔導度(gS)隨著光照強度增加與光合曲線相似,符合自然常數e的負指數曲線,由于干旱脅迫,預干旱脅迫的葉片在每個光強下的gS均顯著的低于對照。預干旱脅迫處理最大氣孔導度gC(0.203)、0光強下氣孔導度gO(0.093)分別極顯著低于對照gC(0.495)、gO(0.214)(表4)。Stage II重復干旱脅迫時期,D和DD兩處理氣孔導度-光強曲線不符合e的負指數曲線,隨著光強的增加分別從0光強時0.126和0.194 mol m-2s-1逐漸降低,與對照呈明顯的相反趨勢,其中DD處理在各光強下gS均高于D處理。Stage III復水時期,D和DD處理各光強下的gS仍低于對照,gC和gO與氣孔導度曲線結果一致,均呈現對照>重復干旱>干旱。

圖7 花生幼苗氣孔導度Fig.7 Stomatal conductance in leaves of peanut seedlings

時期Stages處理Treatment最大氣孔導度(gC)Maximumofstomatalconductance(gC)/(molm-2s-1)0光強下氣孔導度(gO)Stomatalconductanceat0lightdensity(gO)/(molm-2s-1)α(×10-3)/(m2smol-1)I預干旱對照0．495A0．214A1．56aPre-drought預干旱0．203B0．093B1．34bII重復干旱對照0．818A0．3560．52Recurrentdrought干旱0．126C重復干旱0．194BIII復水對照0．668A0．292A1．27BRe-watering干旱0．329C0．174C0．39C重復干旱0．480B0．211B1．56A

小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)；大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)

3.5.4 氣孔導度滯后

葉片氣孔導度滯后曲線與光合滯后曲線相似,Stage II重復干旱時期,D處理在光強2000—0 μmol m-2s-1降低時同一光強下氣孔導度低于0—2000 μmol m-2s-1增加時的氣孔導度值(圖8)。

表5結果為各時期不同處理氣孔導度滯后相關參數。預干旱脅迫處理氣孔導度滯后面積(定積分值)、滯后中值、氣孔導度滯后率(HS)均高于對照。Stage II重復干旱時期和Stage III復水后,D和DD處理滯后面積和滯后中值極顯著低于對照,HS值則為干旱>對照>重復干旱。

4 討論

葉片失水是植株遇到干旱最直觀的反應,干旱條件下,生物量優(yōu)先分配給根系,植物可以通過增強根系生長,利于吸收土壤水分以更好地適應干旱環(huán)境[33]。本試驗,初始預干旱脅迫促使重復干旱時花生葉片保持較高的含水量,這一結果可能與重復干旱根系并未受到顯著影響有關,根系在預干旱復水后仍可以保持較高的吸水能力。也有研究得出相反的結果,葉片相對含水量不受上一次干旱脅迫的影響,無法通過根系生物量或吸水機制得到充分的解釋[34]。

圖8 花生幼苗葉片氣孔導度滯后Fig.8 Hysteresis of stomatal conductance in leaves of peanut seedlings實心標記為各處理光強從0—2000 μmol m-2 s-1增加時測得的數據,同一處理空心標記為光強從2000—0 μmol m-2 s-1降低時測得的數據

時期Stages處理Treatment定積分值DefiniteIntegrals積分中值Integralmean滯后中值Hysteresismean氣孔導度滯后率(HS)Hysteresisofstomatalconductance(HS)/%I預干旱對照97．97B0．46A0．049B10．71BPre-drought預干旱139．41A0．23B0．070A29．77AII重復干旱對照246．44A0．73A0．123A16．79abRecurrentdrought干旱32．91C0．08C0．016C20．84a重復干旱59．05B0．20B0．030B14．55bIII復水對照115．47a0．59A0．058A9．80BRe-watering干旱76．72c0．31C0．038B12．24A重復干旱82．93b0．44B0．041B9．45B

小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)；大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)

光合作用在多次脅迫中的響應也存在不同的結果。無論初始脅迫是中度還是重度脅迫,重復干旱均可顯著增加光合參數,如蒸騰速率、氣孔導度、胞間二氧化碳濃度、凈光合速率、表觀量子效率、最大凈光合速率[37]。也有試驗表明重復干旱降低凈光合速率、最大量子效率和最大熒光值[34]。本試驗結果表明,預干旱脅迫顯著提高花生植株在重復干旱下凈光合速率、最大光合勢能和最大光量子產量。預干旱脅迫處理造成氣孔和光合滯后顯著增加,干旱對植株光合系統(tǒng)光化學和參與光化學反應的酶造成了脅迫,而重復干旱比單次干旱明顯減少氣孔導度和光合速率滯后。光強從弱光到強光時需要一定時間達到穩(wěn)定,即出現光強滯后期。植物葉片的光合滯后現象原因之一由于光對酶的誘導活化和光合中間產物及CO2受體增生的反饋抑制,另一原因由于氣孔開度延長滯后時間影響氣體傳導[38-39]。光合滯后反映了葉片光合系統(tǒng)光化學反應、參與光合作用的酶等活性,間接表明植物對環(huán)境變化的適應能力[22]。一般情況下,當植株生長環(huán)境好、植株健壯的條件下,當光強從低到高增加時的光合曲線會與高光強到低光強減弱時的光合曲線基本吻合。植物光合滯后通常發(fā)生在衰老或脅迫環(huán)境下,氣孔比正常條件下更難完全張開,滯后越嚴重表明植株受到的脅迫影響越大。因此,本試驗中葉片氣孔和光合滯后率的降低說明預干旱脅迫在光化學反應、光合酶活性和氣孔開度上提高了植株對重復干旱脅迫的適應或抵抗能力,表現增強的光保護作用。

目前,關于植物對多種逆境的適應和自身抵御雖然受到廣泛關注,并大量應用于生產實踐,但其適應機制尚不清楚。Boussiba等[44]提出“交叉適應”(cross adaptation)機制,植物在經歷初發(fā)逆境后,能提高對次生或后生逆境的抵抗能力。近幾年的研究提出“脅迫記憶”機制,植物對重復脅迫在生理、生化水平上的自身抵御和印記,可能與耐受基因的轉錄有關[1]。植物在前期受過鍛煉或經歷過脅迫后可能通過轉錄因子的積累,在后期感知脅迫后增加防御基因的表達[45-46]。重復干旱脅迫發(fā)現除干旱響應基因外,還存在記憶基因、非記憶基因和后響應基因3類干旱誘導基因在重復干旱脅迫中發(fā)揮作用,其中記憶基因在后期脅迫反應中轉錄水平更明顯[2-4]。另一種機制解釋為脅迫可使DNA甲基化,引起表觀遺傳印記的發(fā)生,這種印記是可遺傳的[1,5-6,8]。未來的研究將在分子和生物化學水平上進一步解釋重復脅迫的適應和記憶響應機制。

5 結論

花生苗期預干旱脅迫提高植株重復干旱脅迫下葉片含水量,減輕重復干旱對植株造成的生理傷害,在光合作用上提高對重復干旱的抵御能力,并在復水后快速恢復到正常水分條件下植株生長水平?；ㄉ仓昕捎∮涱A干旱脅迫的生理響應,再次暴露于干旱脅迫時表現更為迅速和強烈的生理防御和快速的生理恢復機制。在生產實踐中,可利用這種脅迫記憶機制進行抗旱鍛煉。

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